三葉香茶菜介導(dǎo)IκB-α磷酸化對CCl4致大鼠肝纖維化的影響

周至品,農(nóng)汝楠,覃 樂,劉代華,王竟靜,陳 勇,王曉源?

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院,廣西 柳州 545006;2.右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530001)

三葉香茶菜(Isodon ternifolius(D.Don)Kudo)為唇形科植物牛尾草,為廣西瑤藥材[1],可全草入藥,藥性甘、微苦,涼,具利濕疏肝、清熱解毒的功效,多用于急慢性肝炎及早期肝硬化等疾病。前期的研究表明三葉香茶菜有抵抗大鼠肝纖維化作用,能夠顯著下調(diào)肝纖維化大鼠TGF-β1的表達[2-3]。三葉香茶菜能降低大鼠肝組織中Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)與核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)表達及入核,下調(diào)IL-1β、TNF-α、IL-6的細胞因子水平[4-5]。但三葉香茶菜如何抑制TLR4/NF-κB的的活化仍有待進一步研究。研究表明IκB-α與NF-κB結(jié)合不利于NF-κB活化入核,而IκB-α磷酸化水解與NF-κB分離,NFκB即活化入核,促進炎癥因子的表達,引起細胞炎癥反應(yīng)[6]。因此,本研究擬以IκB-α分子及其磷酸化蛋白為靶點,進一步研究三葉香茶菜抗肝纖維化大鼠NF-κB信號通路活化的作用機制,為三葉香茶菜的利用提供新的理論。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠,96只,雌雄各半,體重為180～200g(±20%),購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0002]。動物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥科學(xué)實驗中心動物房[SYXK(桂)2019-0001]。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(DW20190329-05),實驗設(shè)計及實施過程中嚴格遵循動物實驗的3R原則。

1.2 主要試劑

藥材來源于廣西金秀縣,并由廣西中醫(yī)藥大學(xué)梁子寧教授鑒定為三葉香茶菜。秋水仙堿(20180804)購自廣東彼迪藥業(yè)有限公司;ALT(20190727)、HYP(20190728)生化試劑盒均購于南京建成生物工程研究所公司;TGF-β1(TAEJCJYV2W)、α-SMA(QPPHWEUQE8)、IL-6(ZCN5LZ69HT)、TNF-α(9G5HET75U2)ELISA試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;TLR4(bs-20594R)、p-IκB alpha(bsm-52169R)、NF-κB p65(bs-20159R)抗體均購于Bioss公司;β-actin抗體(ab8227)購于abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模及給藥

取SPF級SD大鼠96只,隨機分成6組,每組16只,即對照組、模型組、秋水仙堿(0.2mg/kg)組、三葉香茶菜高劑量(80g/kg)組、三葉香茶菜中劑量(40g/kg)組、三葉香茶菜低劑量(20g/kg)組(按生藥量計)。除對照組外,模型組、秋水仙堿組、三葉香茶菜高劑量、中劑量、低劑量組分別給予皮下注射40% CCl4花生油混合溶液,首劑量為5mL/kg,后調(diào)整為3mL/kg,2次/周,連續(xù)注射12周。造模4周后,正常組灌胃生理鹽水,其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃,給藥1次/日,治療8周。末次給藥后,禁食不禁水12h大鼠麻醉后,腹主動脈取血,分離肝組織[5]。

1.3.2 指標檢測

(1)HE染色 取肝組織,福爾馬林固定,石蠟包埋并切片,切片2mm厚,HE染色,顯微鏡下觀察肝組織病理情況。

(2)生化法 采用酶標儀測定血清中ALT活力及HYP水平,操作均嚴格按照試劑盒說明。

(3)ELISA法 嚴格按照ELISA試劑盒操作要求,測定血液中TGF-β1、α-SMA纖維相關(guān)因子及IL-6、TNF-α炎癥因子水平。

(4)熒光定量PCR 取肝組織,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,制備DNA模版,最后熒光定量PCR反應(yīng)。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物信息見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table1 Real-time PCR primer sequence

(5)Western blot 取肝組織,提取組織蛋白。100℃變性10min,凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜,一抗,4℃孵育12h,二抗,37℃孵育1h,ECL顯色,曝光成像,得到灰度值,計算相對表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS25.0軟件處理。計量資料用平均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組間差異比較方差齊時采用LSD法,方差不齊時采用T2檢驗;計數(shù)資料用非參數(shù)秩和檢驗比較分析。檢驗水準α=0.05,α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 三葉茶香菜對大鼠肝組織慢性病理損害的保護作用

光鏡下,對照組肝小葉完整清晰,肝細胞圍繞中央靜脈,呈放射性排列,未見壞死,無炎性細胞浸潤,未見纖維組織增生。模型組出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝細胞索排列紊亂,纖維間隔增厚,肝細胞變性,部分壞死,假小葉形成。秋水仙堿組及三葉香茶菜組肝組織損傷程度叫模型組明顯減輕,肝細胞變性、炎細胞浸潤、壞死情況有所改善。病理見圖1,評分表見表2。

圖1 三葉香茶菜對CCl4致肝纖維化大鼠肝組織病理損害抵抗作用(HE染色)Figure1 Effect of Isodon ternifolius(D.Don)Kudo on liver damage of the rats with liver fibrosis induced by CCl4(HE staining)

表2 三葉香茶菜對CCl4致肝纖維化大鼠肝組織病理損害程度影響(n=8)Table2 Effect of Isodon ternifolius(D.Don)Kudo on the damage of liver tissue of the rats with liver fibrosis induced by CCl4

2.2 三葉香茶菜對肝纖維化大鼠ALT、HYP水平的影響

ALT、HYP是反應(yīng)肝損傷及纖維化相關(guān)的生化指標。生化結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組較對照組大鼠血清ALT、HYP水平有顯著升高(P＜0.01);與模型組比,秋水仙堿組、三葉香茶菜高、中劑量組ALT的活力水平明顯降低(P＜0.01),三葉香茶菜中、低劑量組HYP水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01),見表3。

表3 三葉香茶菜對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠ALT、HYP水平的影響(±s)Table3 Effect of Isodon ternifolius(D.Don)Kudo on ALT and HYP level in rats with liver fibrosis induced by CCl4

表3 三葉香茶菜對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠ALT、HYP水平的影響(±s)Table3 Effect of Isodon ternifolius(D.Don)Kudo on ALT and HYP level in rats with liver fibrosis induced by CCl4

注:與模型組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note.Compared with model group,?P＜0.05,??P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose n 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L)ALT羥脯氨酸(μg/mg prot)HYP對照組Control gourp / 16 30.9±7.1?? 0.233±0.018??模型組Model group / 12 166.2±52.0 0.425±0.094秋水仙堿組Colchicine group 0.0002 12 117.9±16.0?? 0.313±0.062?三葉香茶菜高劑量組High dose Isodon ternifolius group 80 16 94.2±34.5?? 0.352±0.126三葉香茶菜中劑量組Medium dose Isodon ternifolius group 40 14 117.0±17.0?? 0.331±0.072?三葉香茶菜低劑量組Low dose Isodon ternifolius group 20 12 139.4±26.0 0.284±0.028??

2.3 三葉香茶菜對肝纖維化大鼠IL-6、TNF-α、TGF-β1、α-SMA表達影響

炎癥因子及纖維化化相關(guān)因子IL-6、TNF-α、TGF-β1、α-SMA與肝纖維化密切相關(guān)。ELISA結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α、TGF-β1、α-SMA的表達水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比較,秋水仙堿組及三葉香茶菜高、中、低劑量組IL-6、TGF-β1、α-SMA表達水平顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),秋水仙堿組和三葉香茶菜中劑量組TNF-α的表達水平顯著降低(P＜0.01),三葉香茶菜高、低劑量大鼠血清中TNF-α的水平較模型組有下降,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義,見表4。結(jié)果表明,三葉香茶菜能降低炎癥因子IL-6、TNF-α及TGF-β1、α-SMA纖維化相關(guān)因子的水平,抑制肝纖維化。

表4 三葉香茶菜對CCl4致肝纖維化大鼠IL-6、TNF-α、TGF-β1、α-SMA水平的作用(±s)Table4 Effect of Isodon ternifolius(D.Don)Kudo on the IL-6,TNF-α,TGF-β1,α-SMA in rats with liver fibrosis induced by CCl4

表4 三葉香茶菜對CCl4致肝纖維化大鼠IL-6、TNF-α、TGF-β1、α-SMA水平的作用(±s)Table4 Effect of Isodon ternifolius(D.Don)Kudo on the IL-6,TNF-α,TGF-β1,α-SMA in rats with liver fibrosis induced by CCl4

注:與模型組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note.Compared with model group,?P＜0.05,??P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose n白介素6(ng/mL)IL-6腫瘤壞死因子α(pg/mL)TNF-α轉(zhuǎn)化生長因子β1(ng/mL)TGF-β1 α-平滑肌肌動蛋白(ng/mL)α-SMA對照組Control gourp / 16 174.0±11.2?? 88.8±16.2?? 2.5±0.4?? 16.9±3.9??模型組Model group / 12 235.1±17.8 156.1±14.7 5.0±0.6 43.1±4.1秋水仙堿組Colchicine group 0.0002 12 207.9±14.6?? 139.9±14.7? 3.6±0.6?? 19.3±4.1??三葉香茶菜高劑量組High dose Isodon ternifolius group 80 16 196.8±13.9?? 141.8±9.9 4.3±0.3? 23.8±6.7??三葉香茶菜中劑量組Medium dose Isodon ternifolius group 40 14 204.4±10.8?? 111.4±14.4?? 4.3±0.5? 22.8±7.0??三葉香茶菜低劑量組Low dose Isodon ternifolius group 20 12 211.1±9.8?? 147.0±18.2 4.8±0.5 19.6±5.6??

2.4 三葉香茶菜對大鼠肝組織TLR4/NF-κB信號通路表達的影響

RT-qPCR和Western blot結(jié)果均表明,與對照組相比,模型組TLR4、NF-κB p65表達水平明顯升高(P＜0.05)。RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對組組比,模型組IκB-α mRNA無統(tǒng)計學(xué)差異,但是有下降趨勢,而Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-IκB-α表達水平升高(P＜0.05)。RT-qPCR和Western blot結(jié)果均表明三葉香茶菜組較模型組IκB-α表達水平顯著升高(P＜0.05),TLR4、NF-κB p65、p-IκB-α蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見圖2。綜上,結(jié)果表達三葉香茶菜抑制了IκB-α的磷酸化從而抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化。

圖2 三葉香茶菜對肝纖維化大鼠TLR4/NF-κB信號蛋白及mRNA表達的影響Figure2 Effect of Isodon ternifolius(D.Don)Kudo on the expression of TLR4/NF-κB signal protein and mRNA in liver fibrosis rat

3 討論

為進一步明確三葉香茶菜對TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控,本研究采用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,研究了三葉香茶菜對TLR4、NF-κB p65、IκB-α、p-IκB-α信號蛋白的影響。本研究結(jié)果表明,經(jīng)三葉香茶菜治療后,治療組大鼠肝組織慢性損害明顯改善。三葉香茶菜能降低血清IL-6、TNF-α炎癥因子以及TGF-β1、α-SMA纖維化相關(guān)因子水平,下調(diào)肝組織中的TLR4、NF-κB p65,上調(diào)IκB-α mRNA表達,抑制IκB-α磷酸化水平。

TLR4是一種識別病原相關(guān)分子模式中的識別受體,它是最早發(fā)現(xiàn)的第一個Toll樣受體相關(guān)蛋白[7],具有識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)及損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的作用[8]。TLR4活化后激活下游的NF-κB信號通路,而NF-κB是重要的炎癥轉(zhuǎn)錄因子,其激活可增強炎癥反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄,致大量促炎因子IL-6、TNF-α等釋放,發(fā)生炎癥反應(yīng),促進肝組織損傷[9]。研究表明TLR4在肝纖維化的進展中發(fā)揮重要作用[10],TLR4/NF-κB是調(diào)控HSC及炎性細胞激活的信號通路,參與肝損傷時調(diào)控炎癥細胞因子的形成[11]。TNF-α是TLR4下游重要的促炎因子[12],其具有誘導(dǎo)炎性細胞因子及趨化因子發(fā)生炎癥級聯(lián)效應(yīng)的作用,還能夠促進纖維化因子的表達[13],增加ECM在肝的沉積,加速纖維化的進程。NF-κB是Rel蛋白家族的成員之一,其主要以同源或異源的二聚體的形式存在。具有對DNA識別、二聚化及核定位等生物學(xué)功能。未活化的NFκB主要存在于細胞質(zhì)中,以p65亞基形式與IκB-α(NF-κB的抑制蛋白)結(jié)合后以三聚體形式存在于細胞漿中[14]。當(dāng)受到細胞因子、LPS、氧自由基等應(yīng)激刺激時,促進NF-κB的活化釋放炎癥因子導(dǎo)致肝細胞損傷[15]。

NF-κB信號 激 活 過 程 包 括NF-κB誘 導(dǎo) 激 酶(NIK)激活I(lǐng)κB激酶(IKK-α),致使IκB-α(NF-κB抑制蛋白)磷酸化后降解,NF-κB復(fù)合物解離,最后致使NF-κB活化后進入細胞核促進其與相應(yīng)的靶基因結(jié)合,導(dǎo)致一系列效應(yīng)基因的表達,如IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性細胞因子的合成與釋放,引起細胞炎癥、細胞增殖、形態(tài)改變、細胞分化、凋亡等[16]。而IκB為NF-κB的抑制分子,IκB分子由N端和C端組成,N端含有磷酸化和泛素化位點是信號反應(yīng)區(qū),C端是能夠組成與NF-κB亞基RHD結(jié)合的位點。其IκB蛋白均具有氨基酸的錨蛋白重復(fù)序列,其作用是與NF-κB同源結(jié)構(gòu)域RHD相結(jié)合,從而隱藏NF-κB的核定位序列,抑制其NF-κB進入細胞核發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),慢性乙型肝炎患者肝組織中的NF-κB的表達增加與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展成正相關(guān)[17]。研究表明,NF-κB的活化可以受到許多因素的抑制,其主要是通過抑制IκB的磷酸化及降解,上調(diào)IκB的表達或直接作用于NFκB等途徑抑制其活性[18]。研究表明,在肝中IKK/NF-κB信號的激活通過巨噬細胞介導(dǎo)慢性炎癥加重肝纖維化[19]。當(dāng)IκB被抑制,LPS誘導(dǎo)小鼠模型的肝纖維化程度明顯減輕,其機制是通過阻斷NF-κB信號通路的活化,從而抑制炎癥因子及纖維化相關(guān)因子的釋放[20]。因此,增加IκB-α的表達及抑制其磷酸化都可以弱化NF-κB活化轉(zhuǎn)核,抑制TNF-α、IL-6及TGF-β的合成和分泌,減輕肝纖維化的進展[21]。

綜上表明,三葉香茶菜具有抗肝纖維化作用,其機制是通過升高IκB-α基因表達,下調(diào)IκB-α蛋白磷酸化水平,抑制了NF-κB活化轉(zhuǎn)核,阻斷TLR4/NF-κB信號通路的活化,從而抑制下游炎癥細胞因子的表達,減弱肝的炎癥損傷及纖維相關(guān)因子產(chǎn)生,達到抗肝纖維化作用。