蛋白質(zhì)組學(xué)揭示美洲大蠊卵鞘在胚胎發(fā)育中的重要功能

王 帥，朱克森，都二霞

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆蟲科學(xué)與技術(shù)研究所，廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，廣州市昆蟲發(fā)育與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，廣州 510631)

美洲大蠊Periplanetaamericana隸屬于節(jié)肢動物門Phylum arthropoda昆蟲綱Insecta有翅亞綱Pterygota蜚蠊目Blattaria，俗稱蟑螂，素有“小強”之稱，早在3.5億年前就已存在，是地球上最古老的昆蟲類群之一。美洲大蠊應(yīng)對環(huán)境驚人的適應(yīng)性和極強的繁殖力，使其成為廣東乃至華南地區(qū)室內(nèi)衛(wèi)生害蟲的霸主，也是世界上公認的病媒(Bell and Adiyodi, 1982; Alietal., 2017)。對于絕大部分蟑螂來說，它們的生命周期中都要經(jīng)歷一個特殊的階段-胚胎發(fā)育，在這一時期，卵鞘幾乎是卵的唯一屏障，它不僅為胚胎提供水分、氧氣，還可以抵御外界的機械保護，防止水分及藥劑進入等，對幼蟲的孵化至關(guān)重要。因此，卵鞘是蜚蠊目昆蟲重要適應(yīng)性的生殖策略。

美洲大蠊卵鞘是一種橢圓形、半圓柱狀的結(jié)構(gòu)，保護卵粒和完成整個胚胎發(fā)育過程。卵鞘由凸起的外表面及凹陷的內(nèi)表面組成的兩瓣結(jié)構(gòu)，中間由鋸齒狀的嵴連接。嵴保證卵鞘內(nèi)部與外界環(huán)境的氣體物質(zhì)交換(Mayaetal., 2002)，同時也是幼蟲孵出的位置。

性成熟后的雌性成蟲以孤雌生殖或兩性方式產(chǎn)卵，產(chǎn)卵時左右粘液腺分泌物在生殖前庭混合反應(yīng)后包裹卵粒排出體外，最終形成褐色堅硬且具有保護作用的結(jié)構(gòu)，即卵鞘(Pryor,etal., 1946)。較大的左側(cè)粘液腺可分泌3,4-二羥基苯甲酸(原兒茶酸)，一種酚類葡萄糖苷，作為黑化反應(yīng)前體(Wills and Brunetetal., 1966)。除此之外，左側(cè)粘液腺也可以分泌草酸鈣(Stayetal., 1960)，以及卵鞘蛋白(Pauetal., 1968)，研究表明，草酸鈣的含量與粘液腺的分泌功能有一定的關(guān)聯(lián)(Stayetal., 1960)。右側(cè)粘液腺主要分泌葡糖苷酶(Avilaetal., 2011)，當(dāng)左右粘液腺分泌物混合時，葡萄糖苷酶可水解葡萄糖苷(Brunet and Kent, 1955)生成原兒茶酸，原兒茶酸進一步被氧化形成醌類化合物(Whiteheadetal., 1960; Bell and Adiyodi, 1982; Whitehead, 2011)，最后，醌類化合物與結(jié)構(gòu)蛋白交聯(lián)，使卵鞘硬化。除此之外，多酚氧化酶(Sugumaran and Nellaiappan, 1990)，漆酶等物質(zhì)也參與了卵鞘黑化硬化的過程(Whiteheadetal., 1960; Whiteheadetal., 1969)。新的研究發(fā)現(xiàn)，附著在左側(cè)粘液腺上的血細胞在原兒茶酸的合成過程中至關(guān)重要，當(dāng)洗掉血細胞后，左側(cè)粘液腺就不能使酪氨酸脫羧(Lake and Mills, 1975; Whitehead, 2011)。左右粘液腺均有不同亞型的上皮細胞和分泌細胞(Bell and Adiyodi, 1982; Courrentetal., 2008)。

目前，對于美洲大蠊卵鞘的蛋白及其功能仍未系統(tǒng)研究，本研究利用Label-free定量技術(shù)對美洲大蠊卵鞘不同發(fā)育時期的差異蛋白進行鑒定及聚類分析，首次從蛋白質(zhì)組學(xué)水平揭示調(diào)控美洲大蠊卵鞘蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)控酶及結(jié)構(gòu)蛋白，不僅揭示美洲大蠊卵鞘對胚胎的保護功能的科學(xué)奧秘，也將推動蟑螂衛(wèi)生害蟲防治領(lǐng)域的進程。

1 材料與方法

1.1 材料

選用華南師范大學(xué)昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室所飼養(yǎng)的美洲大蠊產(chǎn)生的卵鞘，卵鞘從產(chǎn)出到幼蟲孵化需要40 d，選取剛產(chǎn)出的卵鞘定為前期卵鞘(Day 1)，第20天卵鞘定為中期卵鞘(Day 20)，每個時期卵鞘取樣重復(fù)3次，共6個樣品。

1.2 美洲大蠊卵鞘蛋白的提取

將兩個時間的卵鞘輕輕移除內(nèi)部卵粒，PBS緩沖液中清洗后加入RAPI強裂解液和100 mM PMSF蛋白酶抑制劑，用鋼珠超聲打碎，冰上裂解30 min。4℃最大速離心20 min，取上清即獲蛋白，供下一步的檢測和組學(xué)鑒定。

1.3 美洲大蠊不同發(fā)育時期卵鞘蛋白組label-free檢測

用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)的濃度并定量后分裝樣品，檢測濃度合格后，各樣品分別取30 μL蛋白質(zhì)溶液，各自加入DTT和碘乙酰胺對蛋白質(zhì)溶液進行二硫鍵斷裂、還原烷基化處理，隨后各樣品加入40 μL胰蛋白酶Trypsin酶解蛋白，收集好的濾液樣品采用nano-HPLC-MS/MS(Thermo Q Exactive)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進行分析，數(shù)據(jù)采集模式為數(shù)據(jù)依賴采集模式DDA(Data dependent acquisition)。

圖1 美洲大蠊卵鞘形態(tài)圖Fig.1 Morphology of oothecae of Periplaneta americana注：A為卵鞘前期(第1天)形態(tài)圖，B為卵鞘中期(第20天)形態(tài)圖，C為卵鞘細節(jié)觀察。(a)1，分割的卵室；2，凸起的外表面；3，嵴；(b)，嵴上拉鏈鋸齒狀結(jié)構(gòu)。(c)，嵴部正面觀。4，嵴前端的頸部；5，嵴頂端閉合處；6，嵴前端部分；7，嵴后端部分;(d)，卵鞘內(nèi)部。8，卵；(e)，幼蟲孵出后卵鞘內(nèi)部。9，內(nèi)部微絨毛；(f)，去掉微絨毛的卵鞘內(nèi)部結(jié)構(gòu)。10，通道結(jié)構(gòu)內(nèi)部；11，通道結(jié)構(gòu)外部；(g)，嵴。(h-i)，嵴部電鏡圖。Note: The morphological picture of the early ootheca (Day 1)(A)and (Day 20)(B). (C), Details of oothecae. (a), Mosaic assembly of the oothecae 1, adjacent segmentations; 2, Convex external surface; 3, Crest; (b), Zipper-like toothed rail structure of the crest. (c), Details shows the crest. 4, Neck; 5, Closed area of the crest; 6, Pre-dental elements; 7, Post-dental elements; (d), The inner side of the ootheca 8, numph; (e), The inner surfaces of ootheca after numph hatched; 9, Inner structure; (f), The surfaces without inner structure. Channel like structure of inside (10)and outer side (11); (g), Crest; (h-i), SEM of crest.

1.4 美洲大蠊卵鞘蛋白組label-free數(shù)據(jù)分析

1.4.1原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換

質(zhì)譜鑒定分析后的下機原始數(shù)據(jù)，通過pFind 3.1對數(shù)據(jù)進行提取、解析并去除同位素，然后轉(zhuǎn)換為Mascot Generic Format(MGF)格式文件。

1.4.2MaxQuant v1.5進行蛋白質(zhì)鑒定和label-free定量分析

用軟件MaxQuant v1.5與已發(fā)表的美洲大蠊基因組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，得到蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，相關(guān)參數(shù)如表1，首先在譜圖/肽段水平進行1% FDR的過濾(PSM-level FDR ≤ 0.01)，獲得具有顯著性的譜圖和肽段列表。為了控制蛋白的假陽性率，以FDR 1%再次進行過濾(Protein-level FDR ≤ 0.01)，最終用于蛋白質(zhì)定量分析的肽段譜圖數(shù)最少為1，同時通過質(zhì)控分析來判斷實驗數(shù)據(jù)是否合格。

表1 MaxQuant搜索參數(shù)信息表

1.4.4差異蛋白GO和KEGG富集分析

通過P<0.05和FDR<0.01對差異蛋白進行篩選，從定量結(jié)果中篩選出樣品間的顯著差異蛋白。隨后對差異蛋白進行GO、Pathway富集分析，利用Blast2GO對目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進行GO以及KOG注釋，利用KAAS軟件對目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進行通路注釋。GO功能顯著性富集分析主要通過與所有鑒定到的蛋白質(zhì)背景相比，差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO功能條目，從而給出差異蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。Pathway顯著性富集分析方法是以KEGG通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與所有鑒定到的蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的通路，從而確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲大蠊卵鞘不同發(fā)育時期的蛋白質(zhì)鑒定

選取美洲大蠊第1天和第20天卵鞘提取蛋白，每個時期3次重復(fù)，共2組6個樣品，分別命名為：Pa_o_p1(primary)、Pa_o_p2(primary)、Pa_o_p3(primary)、Pa_o_m1 (middle)、Pa_o_m2 (middle)、Pa_o_m3 (middle)。質(zhì)檢合格后上機，蛋白組檢測共生成18 882張二級譜圖，鑒定出4 324條肽段和754個蛋白(1% FDR，表2)，其中前期卵鞘中鑒定特異蛋白數(shù)目40個，中期中111個，而前中期共有的蛋白67個。以美洲大蠊卵鞘D1與D20其中一個樣品為例，特異性肽段數(shù)目分布圖顯示，在前期鑒定到的90個蛋白中，特異性肽段數(shù)目為1的蛋白約占總蛋白的41.11%，在中期鑒定到的蛋白中特異性肽段數(shù)目為1的蛋白約占總蛋白的41.03%，蛋白數(shù)量隨著匹配肽段數(shù)量的增加而不斷減少(圖2-A, D)；蛋白質(zhì)相對分子量分布圖顯示，美洲大蠊卵鞘前期分子質(zhì)量大小在21～40 kDa之間的蛋白質(zhì)較多，占所有檢測蛋白的41.11%，其次是分子質(zhì)量大小在0～30 kDa，占所有檢測蛋白的27.78%，美洲大蠊卵鞘中期蛋白質(zhì)相對分子量分布圖顯示在21～40 kDa之間的蛋白質(zhì)同樣最多，占所有檢測蛋白的41.11%，其次是41～60 kDa，占所有檢測蛋白的26.92%(圖2-B, E)；肽段長度分布圖顯示，美洲大蠊卵鞘前期和中期鑒定到的肽段長度主要集中在8～16 aa之間(圖2-C, F)。此外，3次重復(fù)檢測結(jié)果類似，表明檢測到的蛋白可信度較高。

表2 美洲大蠊卵鞘兩個時期的蛋白組學(xué)鑒定結(jié)果

表3 美洲大蠊卵鞘不同發(fā)育時期蛋白鑒定數(shù)量比較

圖2 美洲大蠊不同發(fā)育時期卵鞘蛋白的基本情況Fig.2 Basic situation of ovarian protein in different periods of Periplaneta americana

2.3 蛋白表達功能聚類

Gene Ontology(簡稱GO)是一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表(Controlled Vocabulary)來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO總共有3個本體(Ontology)，分別描述參與的生物過程(Biological Process)、所處的細胞位置(Cellular Component)、基因的分子功能(Molecular Function)。利用Blast2GO軟件將所有鑒定到的蛋白質(zhì)與已發(fā)表的美洲大蠊蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，得到相應(yīng)的GO功能注釋(圖3)。在生物過程方面，鑒定到的蛋白主要參與代謝過程(Metabolic process)、細胞過程(Cellular process)和單細胞過程(Signal-organism process)，它們的數(shù)目分別為30、33、31。在細胞組分方面，蛋白主要富集在細胞(Cell)、膜(Membrane)、細胞器(Organelle)和細胞部分(cell part)中；在分子功能方面，注釋結(jié)果顯示共有84個蛋白主要在催化活性(Catalytic activity)和結(jié)合活性(Binding)中富集，可以通過與ATP、GTP、DNA、RNA和金屬離子的結(jié)合從而來發(fā)揮功能。

圖3 美洲大蠊卵鞘蛋白的GO功能注釋Fig.3 GO function annotation of Periplaneta americana egg sheath protein注：深綠色代表生物過程，紅色代表細胞位置，藍色代表基因的分子功能，縱坐標(biāo)為基因數(shù)目。Note: Dark green represented biological processes, red represented cell component, blue represented the molecular function of genes, and the ordinate was the number of genes.

圖4 美洲大蠊卵鞘蛋白的KOG功能注釋Fig.4 KOG function annotation of Periplaneta americana egg sheath protein

KOG(Eukaryotic of Orthologous Groups of Proteins蛋白相鄰類的聚簇)是對蛋白質(zhì)進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫，構(gòu)成每個KOG的蛋白都是被假定為來自于一個祖先蛋白，并且因此或者是直系同源蛋白或者是旁系同源蛋白。直系同源蛋白是指來自于不同物種的由垂直家系(物種形成)進化而來的蛋白，并且典型的保留與原始蛋白有相同的功能。旁系同源蛋白是那些在一定物種中的來源于基因復(fù)制的蛋白，可能會進化出新的與原來有關(guān)的功能。將所有鑒定到的蛋白和KOG數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果顯示，在一般功能預(yù)測(general function prediction only, 57個)和翻譯后的修飾、蛋白周轉(zhuǎn)、分子伴侶(posttranslational modification, protein turnover, chaperones, 67個)2個方面聚集的最多，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌、小泡運輸(Inorganic ion transport and metabolism, 1個)和核結(jié)構(gòu)(cell motility, 1個)最少。

KEGG注釋結(jié)果顯示：106個美洲大蠊卵鞘蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫中有功能注釋，共參與了56條代謝通路，其中，最主要的代謝通路是代謝途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)合成，分別有25(23.58%)和18(16.98%)個蛋白參與，主要體現(xiàn)在能量合成(表4)。

表4 美洲大蠊卵鞘蛋白的KEGG通路分析

續(xù)表4 Continued table 4

2.4 蛋白質(zhì)定量

將美洲大蠊卵鞘前期3次重復(fù)鑒定的總蛋白與中期3次重復(fù)測序鑒定的總蛋白設(shè)置為比較組，利用MaxQuant軟件對鑒定到的蛋白質(zhì)進行定量。依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，設(shè)置差異倍數(shù)≥1.2倍且P<0.05，篩選差異蛋白，最終得到顯著差異蛋白數(shù)目(見圖5)。在美洲大蠊卵鞘發(fā)育的前期和中期，共有220個蛋白的表達量發(fā)生變化。其中差異蛋白157個，與新鮮卵鞘相比，在卵鞘發(fā)育到第20天，有102個蛋白質(zhì)表達上調(diào)，遠遠多于55個下調(diào)蛋白質(zhì)的數(shù)目(圖5)。

圖5 美洲大蠊卵鞘蛋白前期和中期間的顯著差異蛋白數(shù)目比較Fig.5 Up-regulated and down-regulated proteins in 20-day-old oothecae in comparison with 1-day-old

2.5 差異蛋白的富集分析

將上述鑒定的差異蛋白進行GO富集分析，在生物過程中，美洲大蠊卵鞘差異蛋白主要富集到細胞過程(cellular process, 15個)、代謝過程(metabolic process, 10個)、單細胞過程(single-organism process, 13個)等 ；在細胞組分中，美洲大蠊卵鞘差異蛋白主要富集到細胞(cell, 14個)、細胞內(nèi)(cell part, 14個)和細胞器(orangelle, 13個)；在分子功能方面，美洲大蠊卵鞘差異蛋白主要富集到在催化活性(catalytic activity, 17個)和結(jié)合活性(binding activity, 13個)(圖6)。同時美洲大蠊卵鞘差異蛋白的Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，Pa_o_p-vs-Pa_o_m差異。蛋白主要的富集通路是代謝途徑(Metabolic pathways)、溶酶體(Lysosome)、長壽調(diào)節(jié)途徑(Longevity regulating pathway)以及碳代謝(Carbon metabolism)(圖7)。

圖6 美洲大蠊卵鞘不同發(fā)育時期差異蛋白的GO富集分析Fig.6 GO enrichment of differential proteins in Periplaneta americana oothecae on day1 and day20

圖7 美洲大蠊卵鞘不同發(fā)育時期差異蛋白的KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment of differential proteins in Periplaneta americana oothecae on day1 and day20

通過兩個不同時期的卵鞘蛋白定量熱圖發(fā)現(xiàn)，與前期新鮮卵鞘蛋白相比，中期卵鞘中熱休克蛋白，核糖體蛋白及一些卵黃蛋白增加(圖8)，說明這些可能參與了應(yīng)激，新蛋白的合成和能量代謝，而中期中一些漆酶，絲氨酸蛋白酶抑制劑。葡萄糖脫氫酶及其受體與黑化硬化相關(guān)的顯著下降，說明這些在前期鞘形成中起關(guān)鍵作用，因此害蟲防治要考慮卵鞘前期的蛋白作為分子靶標(biāo)。

圖8 卵鞘形成相關(guān)差異蛋白聚類分析Fig.8 Cluster analysis of different proteins related to oocyte formation

3 結(jié)論與討論

美洲大蠊作為世界性的衛(wèi)生害蟲，對外界環(huán)境有驚人的適應(yīng)性和極強的繁殖力，是廣東乃至華南地區(qū)室內(nèi)衛(wèi)生害蟲的霸主。美洲大蠊兼具孤雌生殖和兩性生殖兩種方式，同時卵鞘為胚胎的屏障，有效阻止了藥劑的滲入和防止了水分的流失，加上化學(xué)滅蟑藥的使用導(dǎo)致蟑螂的抗藥性不斷增加，使得蟑螂的防治不盡如人意，因此，本文對不同發(fā)育時期美洲大蠊卵鞘進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，尋找卵鞘的功能蛋白，為卵鞘對胚胎的功能研究奠定基礎(chǔ)，進而為害蟲生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

本研究利用非定量標(biāo)記的方法對美洲大蠊 2個不同發(fā)育時間(產(chǎn)出卵鞘第1天到第20天)的卵鞘蛋白進行了定量分析，對鑒定得到754個卵鞘蛋白的相對分子量、氨基酸肽段長度和特異性肽段數(shù)目的統(tǒng)計分析均表明測得的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，754個美洲大蠊卵鞘蛋白中共有84個蛋白主要在催化活性(Catalytic activity)和結(jié)合活性(Binding)中富集，這包括催化脂肪酸以及卵鞘結(jié)構(gòu)蛋白的合成與代謝、能量轉(zhuǎn)運與儲存、卵鞘黑化硬化的一系列酶。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，有106個非冗余美洲大蠊卵鞘蛋白直接參與了與主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的27條代謝途徑。

通過Label-free定量分析發(fā)現(xiàn)，在美洲大蠊卵鞘2個不同發(fā)育時期中有共有220個美洲大蠊卵鞘蛋白的表達量發(fā)生了變化，Pa_o_p-vs-Pa_o_m中有157個樣品間差異蛋白，進一步注釋發(fā)現(xiàn)與卵鞘形成過程相關(guān)類型的蛋白有20個，有102個蛋白質(zhì)表達上調(diào)，遠遠多于55個下調(diào)蛋白質(zhì)的數(shù)目。對不同生長時期的美洲大蠊卵鞘差異蛋白的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，主要的富集通路是代謝途徑(Metabolic pathways)、溶酶體(Lysosome)、長壽調(diào)節(jié)途徑(Longevity regulating pathway)以及碳代謝(Carbon metabolism)，差異蛋白的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊卵鞘差異蛋白在分子功能上主要富集到在催化活性(catalytic activity)和結(jié)合活性(binding)，這些酶的表達量的顯著變化可能在在調(diào)控美洲大蠊卵鞘形成過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

基于label-free非定量標(biāo)記技術(shù)，通過對兩個發(fā)育時期的卵鞘蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進行比較，篩選得到含量較高的差異蛋白：如熱休克蛋白、低密度脂蛋白、鈣調(diào)蛋白、黏蛋白、漆酶、葡萄糖脫氫酶、絲氨酸蛋白酶等。其中漆酶(Asanoetal., 2019)、絲氨酸蛋白酶已經(jīng)證明在表皮的黑化和硬化中起到關(guān)鍵作用(Dittmeretal., 2004; Gormanetal., 2008; Futahashietal., 2010; Wuetal., 2013)，可能也參與卵鞘的黑化和硬化；而黏蛋白與卵鞘保水相關(guān)。黏蛋白是分布在各種管腔，高度糖基化的粘蛋白具有相當(dāng)?shù)谋Ｋ芰?，并通過吸收大量水分形成凝膠，結(jié)構(gòu)中包含半胱氨酸富含區(qū)域中，C端D結(jié)構(gòu)域形成二硫鍵連接形成二聚體，N端的D結(jié)構(gòu)域形成二硫鍵參與的三聚體，進而形成粘蛋白的分子量較高不溶于水的特點。因此卵鞘的具有良好的保水性能。低密度脂蛋白是一種分泌型糖蛋白，是Lipocalin家族的成員，在結(jié)合和運輸特定的疏水分子方面發(fā)揮作用，能與膽紅素結(jié)合，在昆蟲中，與著色及抵抗細菌入侵及對抗其它的脅迫信號(Guoetal., 2016)。鈣調(diào)素參與胞吐和胞吞，卵鞘在發(fā)育過程中有新的蛋白的合成；還有鞘脂蛋白可能在調(diào)控卵鞘形成、代謝與轉(zhuǎn)運以及在卵鞘形成裝配中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這些數(shù)據(jù)將為闡明蟑螂種群生殖機制和深入實施美洲大蠊生物防治提供了新的策略與理論依據(jù)。