不同殺蟲劑對蕎麥害蟲西伯利亞龜象的毒力及作用機(jī)制研究

陳 磊，王宇飛，孟煥文，李海平，周洪友

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特 010019)

蕎麥?zhǔn)俏覈匾碾s糧作物，分為甜蕎和苦蕎兩種，南北均有分布。我國蕎麥的種植面積約為1 000萬畝，產(chǎn)量約63萬噸，占世界蕎麥總產(chǎn)量的30.7%，種植面積和產(chǎn)量居世界第二，僅次于俄羅斯(任長忠等, 2016)。其中，甜蕎主要分布在我國北方，甜蕎面積最大的三大產(chǎn)區(qū)為內(nèi)蒙古后山白花甜蕎產(chǎn)區(qū)、內(nèi)蒙古東部白花甜蕎產(chǎn)區(qū)和陜甘寧紅花甜蕎產(chǎn)區(qū)(盛晉華等, 2009; 范昱等, 2019)。內(nèi)蒙古特殊的地理環(huán)境和氣候條件都非常適合蕎麥生長，因此內(nèi)蒙古地區(qū)甜蕎種植面積約占全國的80%～90%，居全國第一(王仙女等, 2017)。內(nèi)蒙古庫倫旗更是被譽(yù)為蕎麥種植的“黃金地帶”，2006年內(nèi)蒙古庫倫旗蕎麥通過國家工商總局“原產(chǎn)地商標(biāo)”認(rèn)證，有“中國蕎麥之鄉(xiāng)”之譽(yù)(王濱, 2017)。近年來農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及食品營養(yǎng)學(xué)等方面的研究表明，蕎麥營養(yǎng)成分豐富且價(jià)值高，含有特殊的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，集營養(yǎng)、保健、藥用為一體，是目前被公認(rèn)為21世紀(jì)最具有前途的健康保健食品(林汝法等, 2005; 劉森, 2014; 王鵬科等, 2016; 任長忠等, 2018)。

蕎麥抗逆能力強(qiáng)，生育期短，受病蟲害危害較少。主要害蟲有蚜蟲、薊馬、黏蟲Mythimnaseparata(Walker)、蕎麥鉤翅蛾SpicaparallelangulaAlpheraky以及螻蛄Gryllotalpaspp.、蠐螬等地下害蟲，危害都不是很大(鄭慶偉, 2014; 張曉娜等, 2019; 王宇飛等, 2020)。2013年在內(nèi)蒙古赤峰市突然爆發(fā)成災(zāi)的害蟲-西伯利亞龜象RhinoncussibiricusFaust，給蕎麥的生產(chǎn)及產(chǎn)量帶來很大的危害和損失(東保柱等, 2014)。

西伯利亞龜象RhinoncussibiricusFaust屬于鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae，主要分布在俄羅斯、蒙古、韓國等地。據(jù)報(bào)道，俄羅斯普列莫爾斯基地區(qū)的蕎麥種植受西伯利亞龜象的影響，蕎麥種植面積由高峰期的3×104hm2，下降到2011年3 000 hm2，且對蕎麥的危害率達(dá)100%(Potemkinaetal., 2008; Moiseenkoetal., 2010; Kuznetsovaetal., 2012)。2013年該蟲在我國內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市翁牛特旗首次發(fā)現(xiàn)(卜一等, 2014)，當(dāng)年僅翁牛特旗發(fā)生面積就有3 667.67 hm2，嚴(yán)重發(fā)生面積約1 000 hm2，成蟲蟲口密度高達(dá)200～600頭/m2，越冬成蟲將嫩葉全部取食吃光，嚴(yán)重的使剛出土的幼苗整株死亡，甚至造成部分地塊毀種；后期幼蟲蛀入蕎麥莖內(nèi)，嚴(yán)重時(shí)將根部及莖部蛀食一空，導(dǎo)致蕎麥死亡(孟煥文等, 2014)。近幾年，隨著蕎麥種植面積的擴(kuò)大，該蟲在內(nèi)蒙古及周邊省份已有發(fā)現(xiàn)，2019年報(bào)道該蟲在內(nèi)蒙古通遼市、烏蘭察布市、興安盟、薩拉齊、固陽等地，山西省大同市，河北省張家口等地都有分布，給當(dāng)?shù)厥w麥的生產(chǎn)帶來極大的危害(Mengetal., 2019)。

西伯利亞龜象在內(nèi)蒙古地區(qū)一年發(fā)生一代，以成蟲在土壤中越冬，次年5月下旬出土，越冬代成蟲首先選擇一年前被風(fēng)吹落的種子萌發(fā)的蕎麥幼苗和其它蓼科雜草上危害，待蕎麥播種出苗后轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)田危害(東保柱等, 2014)。國內(nèi)外研究表明，西伯利亞龜象對蕎麥造成的危害，以成蟲危害剛出土的幼苗為重，常造成蕎麥不能保苗、缺苗斷壟、甚至部分地塊毀種，因此加強(qiáng)對西伯利亞龜象越冬成蟲的防治非常重要。目前報(bào)道對西伯利亞龜象成蟲主要進(jìn)行化學(xué)防治(孟煥文等, 2014; Klykovetal., 2014)。但這些藥劑對西伯利亞龜象的毒力如何，哪些藥劑對西伯利亞龜象的防效較好，目前均無相關(guān)的報(bào)道。因此，本文選擇目前比較常用的殺蟲劑，研究其對西伯利亞龜象的毒力和作用機(jī)制，為選擇最佳藥劑防治西伯利亞龜象提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

西伯利亞龜象：采集自內(nèi)蒙古包頭市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)薩拉齊職業(yè)技術(shù)學(xué)院的蕎麥試驗(yàn)田。將成蟲從田間采回后，在實(shí)驗(yàn)室事先種好的蕎麥幼苗上飼養(yǎng)，放置到溫度25℃±1℃，相對濕度70%左右的光照培養(yǎng)箱中，飼養(yǎng)至少一周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用個(gè)體大小基本一致的健康成蟲。

1.2 供試藥劑及試劑

有機(jī)磷殺蟲劑：79.1%樂果原藥、80.5%三唑磷原藥、95.0%毒死蜱原藥(山東濟(jì)南世幫農(nóng)化公司)；氨基甲酸酯類殺蟲劑：92.0%丁硫克百威原藥、97.6%滅多威原藥(山東濟(jì)南世幫農(nóng)化公司)；煙堿類殺蟲劑：94.0%吡蟲啉原藥、97.0%噻蟲嗪原藥(湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司)；擬除蟲菊酯類殺蟲劑：27.0%高效氯氰菊酯原藥、96.0%聯(lián)苯菊酯原藥、98.2%溴氰菊酯原藥、95.0%高效氯氟氰菊酯原藥、92.5%氰戊菊酯原藥(江蘇揚(yáng)農(nóng)化工股份有限公司)。70%噻蟲嗪種子處理可分散粉劑(70% thiamethoxam ZF，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)。

碘化硫代乙酰膽堿(acetylthiocholineiodide, ATCh)，5,5′-二硫雙硝基苯甲酸(5,5′-tithio-bis-2-nirorbenzoicacid, DTNB)，考馬斯亮藍(lán)G-250，牛血清白蛋白(純度99%)，Sigma公司。ATP酶測試盒，南京建成生物工程研究所第一分所產(chǎn)品。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 不同殺蟲劑對西伯利亞龜象的毒力

參照Moores等(1992)的葉片藥膜法測定。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將農(nóng)藥原藥用丙酮稀釋成6個(gè)濃度梯度，將稀釋好的藥液倒入燒杯中，將室內(nèi)種植的沒有接觸過藥劑的蕎麥葉片浸入藥液中，5 s后撈出，用濾紙將葉片上多余的藥液吸去，在陰涼干燥處晾干。將浸泡過藥液的蕎麥葉片葉柄用脫脂棉保濕，放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接入室內(nèi)飼養(yǎng)的西伯利亞龜象成蟲，每個(gè)濃度至少接10頭，放入25℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，以丙酮為對照，重復(fù)3次。48 h后檢查死亡數(shù)，以毛筆輕觸蟲體，不動計(jì)為死亡。

1.4 AChE酶活性的測定

1.4.1AChE酶液制備

取西伯利亞龜象10頭，加入液氮迅速殺死，加入2 mL預(yù)冷的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.3，含0.1% trition X-100)，在冰浴條件下研磨勻漿。勻漿液在4℃，10 000 g離心20 min，抽濾，上清液即為酶液。

1.4.2AChE比活力測定

參照高希武(1987)方法。每個(gè)處理分別加入0.1 mL 10 mmol/L的ATCh，水浴鍋中保溫5 min，加入酶液0.1 mL，反應(yīng)15 min，加入1.8 mL顯色劑DTNB終止反應(yīng)，總反應(yīng)體系為2.0 mL，兩分鐘后在412 nm下測定A412 nm，計(jì)算AChE的比活力，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測定3次。

AChE比活力=(ΔA412nm/mg×V)/ε×L

其中，V為反應(yīng)總體積(mL)，ε為酶與底物反應(yīng)的產(chǎn)物和DTNB絡(luò)合物的摩爾消光系數(shù)，值為13 600 L/mol/cm，L為比色杯的光程。

1.4.3AChE動力學(xué)性質(zhì)測定

測定西伯利亞龜象AChE與底物ATCh反應(yīng)的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)。設(shè)置6個(gè)底物濃度，濃度范圍是0.1～10 mmol/L，在上述條件下與酶液反應(yīng)，測定吸光度值。

1.4.4殺蟲劑對西伯利亞龜象AChE的抑制

以丙酮溶解農(nóng)藥原藥制成母液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，使用前用磷酸緩沖液(pH 7.3、0.1 mol/L)將農(nóng)藥稀釋成不同濃度(濃度范圍為10-3～10-7mol/L)。反應(yīng)時(shí)先加入不同濃度的抑制劑和酶液混合，保溫5 min后，加入底物(ATCh)，反應(yīng)15 min后加入顯色劑(DTNB)終止反應(yīng)，測其殘留的AChE活性。對照管以緩沖液代替抑制劑。每個(gè)藥劑至少5個(gè)濃度，每個(gè)濃度3次重復(fù)。

抑制率計(jì)算公式：酶的抑制率(%)=(對照組酶活性-處理組酶活性)/對照組酶活性×100

以殺蟲劑不同濃度對西伯利亞龜象AChE抑制百分率，計(jì)算抑制中濃度(median inhibitory concentration, IC50)。

1.4.5時(shí)間抑制進(jìn)程曲線的測定

將制備好的酶液分別與不同濃度的農(nóng)藥混合后保溫，以2 min的時(shí)間間隔監(jiān)測反應(yīng)混合物中AChE的活性。每一間隔3次獨(dú)立重復(fù)。計(jì)算抑制中時(shí)間(median inhibitory time，IT50)。

1.5 菊酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象線粒體腺苷三磷酸酶(ATPase)的抑制

1.5.1西伯利亞龜象ATPase酶液的制備

取10頭西伯利亞龜象成蟲，加入2 mL pH 7.4 Tris-HCl緩沖液(含0.1% tritionX-100)，在冰浴條件下勻漿，采用差速離心法提取ATPase酶液。勻漿液在4℃ 3 000 g下離心10 min，取上清液，再在10 000 g下離心30 min，棄去上清液，沉淀用上述緩沖液再溶解作為酶源備用。

1.5.2西伯利亞龜象ATPase活性的測定

本實(shí)驗(yàn)ATPase活性測定依照ATP酶測試盒說明進(jìn)行。

1.5.3菊酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象離體ATPase活性的抑制

將菊酯類殺蟲劑用丙酮配成一定濃度的母液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取母液用緩沖液稀釋至所需濃度(現(xiàn)配現(xiàn)用)，在反應(yīng)體系中加入酶液和藥劑，其他步驟如ATPase的活力測定方法相同。抑制率的計(jì)算公式為：

抑制率(%)=(對照ATPase活性-藥劑處理ATPase活性)/對照ATPase活性×100

1.6 西伯利亞龜象蛋白含量測定

參考Bradford(1976)考馬斯亮藍(lán)G-250法。采用牛血清白蛋白測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

酶的動力學(xué)用GraphPad Prism5軟件處理，所有數(shù)據(jù)計(jì)算均在EXCEL 2010與SPSS 12.0.1統(tǒng)計(jì)分析軟件上完成，并檢驗(yàn)處理間的差異顯著性，方差分析采用Duncan新復(fù)極差測驗(yàn)。生測數(shù)據(jù)用POLO-Plus軟件處理，計(jì)算致死中濃度(Lethal Concentration 50, LC50)及其95%置信區(qū)間和斜率b。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺蟲劑對西伯利亞龜象的毒力

4種菊酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象的毒力大于有機(jī)磷、氨基甲酸酯類和煙堿類殺蟲劑。菊酯類殺蟲劑中毒力最大的是高效氯氰菊酯，LC50為17.37 mg/L，毒力較低的為高效氯氟氰菊酯，LC50為42.60 mg/L。氨基甲酸酯類藥劑中丁硫克百威毒力最大，LC50為29.56 mg/L，毒力最小的為滅多威，LC50為63.89 mg/L，煙堿類藥劑噻蟲嗪和吡蟲啉對蕎麥害蟲西伯利亞龜象的LC50分別為42.14 mg/L和46.19 mg/L(表1)。

表1 不同殺蟲劑對西伯利亞龜象的毒力

2.2 西伯利亞龜象乙酰膽堿酯酶(AChE)的特性

以碘化硫代乙酰膽堿(ATCh)為底物時(shí)，西伯利亞龜象乙酰膽堿酯酶(AChE)米氏常數(shù)Km=1.43 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax=16.75 μmol/min/mg。

圖1 西伯利亞龜象乙酰膽堿酯酶的米氏曲線Fig.1 Michaelis curve of AChE in Rhinoncus sibiricus Faust

2.3 有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制作用

供試的氨基甲酸酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象AChE的抑制作用大于有機(jī)磷殺蟲劑。其中，滅多威對西伯利亞龜象AChE抑制作用最強(qiáng)，丁硫克百威次之，樂果對西伯利亞龜象AChE的抑制中濃度最大。從抑制中時(shí)間上來看，丁硫克百威抑制中時(shí)間最短，樂果和三唑磷次之，滅多威抑制中時(shí)間最長(表2)。

表2 殺蟲劑對西伯利亞龜象乙酰膽堿酯酶抑制中濃度和抑制中時(shí)間

2.4 有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象AChE抑制的時(shí)間效應(yīng)

5種殺蟲劑對AChE的抑制均隨著時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)。在15 min左右都達(dá)到最高點(diǎn)。除毒死蜱以外，其它4種抑制劑在最高抑制程度上趨于一致，均在70%左右(圖2)。

圖2 不同殺蟲劑對西伯利亞龜象乙酰膽堿脂酶抑制時(shí)間效應(yīng)Fig.2 Effect of different pesticides on AChE from Rhinoncus sibiricus Faust at different times

2.5 擬除蟲菊酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象ATPase抑制作用

5種菊酯類殺蟲劑對Na+-K+-ATPase的抑制高于對Ca2+-Mg2+-ATPase的抑制。溴氰菊酯的抑制作用最強(qiáng)，高效氯氰菊酯的抑制作用相對最弱(表3)。

表3 擬除蟲菊酯類藥劑對西伯利亞龜象線粒體離體ATPase抑制作用

2.6 噻蟲嗪拌種對西伯利亞龜象蛀莖率的影響

噻蟲嗪拌種后，無論前茬作物是蕎麥還是土豆SolanumtuberosumL.，西伯利亞龜象蛀莖率都明顯下降，與對照有顯著差異(表4)。

表4 噻蟲嗪拌種對西伯利亞龜象蛀莖率的影響

3 結(jié)論與討論

蕎麥?zhǔn)俏覈饕碾s糧作物，近幾年隨著國家和各地方對蕎麥產(chǎn)業(yè)的重視，蕎麥的種植面積不斷增大，關(guān)于蕎麥的研究也逐年增多。李玲等(2020)分析2000-2017年發(fā)表的蕎麥文獻(xiàn)及相關(guān)研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，蕎麥的研究主要集中在營養(yǎng)保健、食品加工、栽培技術(shù)、生長發(fā)育環(huán)境和分子生物學(xué)5個(gè)方面。而關(guān)于蕎麥病蟲害的研究則很少。西伯利亞龜象是內(nèi)蒙古地區(qū)蕎麥近年新發(fā)生的重要害蟲，給蕎麥生產(chǎn)帶來很大的危害，而且有向周邊地區(qū)不斷擴(kuò)散危害的風(fēng)險(xiǎn)，必須加以有效防治。

化學(xué)防治是害蟲大發(fā)生時(shí)最簡便、有效的防治方法。不同殺蟲劑對不同害蟲的防治效果不同。本實(shí)驗(yàn)采用浸葉法測定不同藥劑對西伯利亞龜象的毒力，結(jié)果表明菊酯類殺蟲劑對西伯利亞龜象的毒力作用較高，高效氯氰菊酯的致死中濃度LC50為17.37 mg/L，有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑中毒力最高的是丁硫克百威，LC50為29.56 mg/L。由于西伯利亞龜象是近年來才報(bào)道發(fā)生的害蟲，因此關(guān)于該蟲的研究報(bào)道很少。Klykov等(2014)在調(diào)查不同藥劑對西伯利亞龜象的大田防治效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯類藥劑防治效果好于煙堿類和有機(jī)磷類殺蟲劑。孟煥文等(2014)研究不同殺蟲劑對西伯利亞龜象的藥效，噴施高效氯氰菊酯的藥效好于辛硫磷，也好于噻蟲嗪拌種，其中噻蟲嗪拌種+高效氯氰菊酯噴施防治效果最好，防效可達(dá)98.79%。王欣欣等(2020)篩選了不同藥劑對西伯利亞龜象的防治效果，使用噻蟲嗪、吡蟲啉拌種，出苗后用丁硫-啶蟲脒噴霧處理，對西伯利亞龜象防治效果都很好。他們的大田試驗(yàn)結(jié)果與本論文室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。由于菊酯類殺蟲劑的觸殺毒力很強(qiáng)，對高等動物的毒性小，殘效期短，因此生產(chǎn)上可以選用菊酯類殺蟲劑防治西伯利亞龜象。但由于菊酯類殺蟲劑容易使害蟲產(chǎn)生抗藥性，因此也需要和其它殺蟲劑交替輪換使用。另外，本論文主要是研究藥劑在室內(nèi)對西伯利亞龜象的毒力，沒有做相應(yīng)的大田藥效實(shí)驗(yàn)，因此生產(chǎn)實(shí)踐中還需要考慮當(dāng)?shù)氐挠盟幩?、管理措施、氣象條件等因素，參照藥劑的毒力，科學(xué)合理使用殺蟲劑防治西伯利亞龜象。

不同農(nóng)藥其作用機(jī)制不同，了解農(nóng)藥的作用機(jī)制對合理使用農(nóng)藥，防止有害生物產(chǎn)生抗藥性非常重要。乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷、氨基甲酸酯類殺蟲劑的靶標(biāo)酶，該酶作用于突觸間隙，分解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)的興奮作用，從而保證信號在神經(jīng)突觸的正常傳遞(Siegfried Betal., 1990)。關(guān)于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑對AChE的抑制作用，目前已有大量的研究。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，供試藥劑對西伯利亞龜象AChE的抑制中濃度為滅多威>丁硫克百威>三唑磷>毒死蜱>樂果，除滅多威之外，其它4種藥劑對AChE的抑制中濃度與生測結(jié)果一致。

菊酯類殺蟲劑是生產(chǎn)中經(jīng)常使用的一大類殺蟲劑，其主要特點(diǎn)表現(xiàn)為：高效、低毒、擊倒快、殘留少，對人畜較為安全(汪霞等, 2017)。菊酯類殺蟲劑的作用機(jī)制比較復(fù)雜，一般認(rèn)為其主要作用于鈉離子通道，影響生物膜的流動性和ATPase的活性(Jones and Lee, 1986; 李海平等, 2006; Lietal., 2015)。很多研究證實(shí)，菊酯類殺蟲劑可以抑制昆蟲體內(nèi)ATPase活性(Lietal., 2015; 張叢等, 2015; 張叢等, 2018)。本研究表明，菊酯類殺蟲劑可以抑制西伯利亞龜象ATPase的活性，對Na+-K+-ATPase抑制率高于Ca2+-Mg2+-ATPase，溴氰菊酯對兩種ATPase的抑制程度最強(qiáng)。

蕎麥?zhǔn)侵匾碾s糧作物，隨著現(xiàn)代人們保健意識的增強(qiáng)，對蕎麥的需求將越來越大。國家也專門增設(shè)了燕蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，加大對蕎麥的研究和投入。但蕎麥總體經(jīng)濟(jì)價(jià)值偏低，經(jīng)營粗放，對病蟲害的防治在一定階段內(nèi)以化學(xué)防治為主。因此選擇合適的時(shí)間、合適的藥劑對西伯利亞龜象進(jìn)行有效防治，對提高蕎麥產(chǎn)量，防止害蟲產(chǎn)生抗藥性有重要的科學(xué)意義。