高效液相色譜法測(cè)定香烤瓜子中糖精鈉含量的不確定度評(píng)估

◎ 許文雅，林 洋，王 韻，郁蕉竹，張宏宏

（沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽 110136）

糖精鈉是一種合成甜味劑，被廣泛應(yīng)用于食品中，其甜度遠(yuǎn)高于蔗糖，攝入過多會(huì)對(duì)腸胃的消化吸收功能造成影響，使食欲減退，有致癌和致遺傳損害的可能性[1-2]，因此仍須嚴(yán)格控制糖精鈉在食品中的使用?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定糖精鈉在帶殼熟制堅(jiān)果與籽類中的最大允許使用量為1.2 g·kg-1[3]。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果接近限量值時(shí)，檢測(cè)結(jié)果對(duì)樣品是否合格有很大影響?！稖y(cè)量不確定度的要求》（CNAS—CL07：2011）[4]中表明，若檢測(cè)結(jié)果的有效性與不確定度有關(guān)、或當(dāng)不確定度對(duì)結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度有影響時(shí)、或當(dāng)檢測(cè)方法及法規(guī)有要求時(shí)，檢測(cè)結(jié)果必須出具不確定度報(bào)告。當(dāng)初檢不合格樣品在復(fù)檢時(shí)，不確定度也是評(píng)價(jià)檢驗(yàn)方法合理性與科學(xué)性的有效定量指標(biāo)，所以測(cè)量不確定度的評(píng)定對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義。本文依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）[5]第一法高效液相色譜法測(cè)定香烤瓜子中糖精鈉的含量，根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL006：2019）[6]和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[7]，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定香烤瓜子中糖精鈉含量的不確定度建立模型，對(duì)影響其不確定度的因素進(jìn)行系統(tǒng)的分析和評(píng)定，為同類樣品檢測(cè)結(jié)果超出限量的判斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀[Waters e2695（配2998PDA檢測(cè)器），美國(guó)Waters公司]；分析天平[BSA224S-CW，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；電子天平[Quintix213-1CN，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；超聲波清洗器（KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（H1750R，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；超純水機(jī)（Milli-Q reference，Millipore SAS公司）；移 液 器[（20～200 μL，705878；100～1 000 μL，705880），普蘭德公司]；移液器[（5～50 μL，NZ44739），Thermo公司]。

1.2 材料與試劑

糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品[（1 000 mg·L-1，以糖精計(jì)760 mg·L-1），北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司]；甲醇（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；乙酸銨（色譜純，F(xiàn)isher chemical）；超純水[（電導(dǎo)率：18.2 MΩ·cm，25℃），自制]；水系濾膜（0.45 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；香烤瓜子（企業(yè)復(fù)檢樣品，盤錦長(zhǎng)久食品有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品用水提取，通過高效液相色譜進(jìn)行分離，利用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

1.3.1 樣品前處理

精密稱量2.000 g左右的樣品，置于50 mL帶蓋塑料離心管中，加入25 mL水，振蕩混勻，置于超聲儀中超聲約20 min，取出后混合均勻，放置離心機(jī)中于8 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，再加入20 mL水于殘?jiān)?，搖勻后超聲5 min，離心，將上清液轉(zhuǎn)移至上述50 mL容量瓶中，用水定容，混勻后取上清液過濾膜，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密量取0.05 mL糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，精密量取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用水定容 至 刻 度，配 制 成 濃 度 為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Tnature C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=11∶89；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；波長(zhǎng)：230 nm。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立樣品中糖精鈉（以糖精計(jì)）含量按下式計(jì)算：

式中：X為樣品中糖精鈉的含量，g·kg-1；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品溶液中糖精的濃度，mg·L-1；V為樣品溶液的定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 不確定度來源分析

由檢驗(yàn)過程和數(shù)學(xué)模型可知高效液相色譜法測(cè)定香烤瓜子中糖精鈉含量的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、樣品前處理、樣品測(cè)量重復(fù)性，每一種來源又分別受到不同因素的影響，其不確定度來源可分為A類和B類不確定度，其不確定來源如圖1[8]。

圖1 糖精鈉測(cè)量不確定的來源圖

A類不確定度主要是由樣品測(cè)量重復(fù)性引入的，平行測(cè)定樣品6次，計(jì)算樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度u(f)。

B類不確定度主要是稱量樣品質(zhì)量產(chǎn)生的不確定度u(m)；樣品定容體積產(chǎn)生的不確定度u(v)，即容量瓶誤差引入、溫度變化引入；標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度u(c)，即標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度（包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入、移液器和容量瓶引入）和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度。

由于各不確定度分量互不相關(guān)，其合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算如下：

3 不確定度評(píng)定

3.1 樣品測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(f)

按照1.3.1所述的前處理?xiàng)l件處理樣品，得到6次重復(fù)測(cè)試的結(jié)果見表1。根據(jù)貝塞爾公式得出測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度為0.002 01 g·kg-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表1 樣品6次重復(fù)性測(cè)試結(jié)果表

3.2 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)

使用千分之一的電子天平，準(zhǔn)確稱取2 g待測(cè)樣品，根據(jù)電子天平的檢定證書可知，所使用天平的最大允許誤差為±0.01 g，按矩形分布計(jì)算得出

3.3 樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(v)

3.3.1 容量瓶誤差引入的不確定度u1(v)

樣品經(jīng)提取后定容至50 mL容量瓶（A級(jí)）中，根據(jù)容量瓶的檢定證書，其最大允許誤差為±0.05 mL，按三角分布計(jì)算得出

3.3.2 溫度變化引入的不確定度u2(v)

容量瓶的實(shí)際校準(zhǔn)溫度為24 ℃，實(shí)驗(yàn)室溫度在（22±4）℃波動(dòng)。由于溫度變化對(duì)容量瓶體積的影響明顯小于對(duì)液體體積的影響，因此可忽略容量瓶體積的變化。已知水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，則由此產(chǎn)生的體積變化為±50 mL×4 ℃×2.1×10-4/℃=±0.042 mL。按均勻分布，包含因子則由此引入的相對(duì)不確定度

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c)

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(c)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制產(chǎn)生的不確定度u1(c)包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度u2(c)、移液器和容量瓶引入的不確定度u3(c)，則

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(c)。糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液證書注明標(biāo)準(zhǔn)值1 000 μg·mL-1，以糖精計(jì)標(biāo)準(zhǔn)值為760 μg·mL-1，相對(duì)擴(kuò)展不確定度U為1%（k=2），則相對(duì)不確定度u2(c)= 0.01/2=0.005。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3(c)。使用糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別移取0.05 mL于50 mL容量瓶中，移 取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。在配制過程中，50 μL移液器使用1次，200 μL移液器使用2次（分別移取100 μL 1次，200 μL 1次），500 μL移液器使用1次，1 000 μL移液器使用4次（分別移取500 μL 1次，1 000 μL 3次），10 mL容量瓶使用5個(gè)，50 mL容量瓶使用1個(gè)。根據(jù)移液器和容量瓶的檢定證書，其最大允許誤差及移取體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2，移液器按矩形分布，包含因子容量瓶按三角形分布，包含因子

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制量器移取體積引入的不確定度表

由3.3.2可知，10 mL、50 mL容量瓶由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化分別為±0.008 4 mL、±0.042 mL，移液器移取的體積小，溫度效應(yīng)忽略不計(jì)。服從均勻分布，，10 mL容量瓶由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為50 mL容量瓶由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為10 mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4(c)

使用糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，利用線性最小二乘法擬合曲線。根據(jù)式（2）～式（4）計(jì)算樣品溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4(c)。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定結(jié)果見表3，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

式（2）～（4）中：SR為殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；CX為待測(cè)樣品溶液濃度的平均值，mg·L-1；b為斜率；a為截距；P為樣品測(cè)定次數(shù)；n為測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線次數(shù)；CP為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的平均值，mg·L-1；Sxx為離均差平方和；Ci為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度，mg·L-1；Ai為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的峰面積。

根據(jù)表3、表4中的數(shù)據(jù)，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4(c)=0.053 3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定結(jié)果表

表4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程及統(tǒng)計(jì)結(jié)果表

3.5 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(x)

樣品中糖精鈉測(cè)定結(jié)果相對(duì)合成不確定度為：

3.6 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定和結(jié)果報(bào)告

取置信區(qū)間p=95%，包含因子k=2，則香烤瓜子中的糖精鈉含量測(cè)定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel=k×urel(x)=2×0.059 4=11.88%。

該實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品中糖精鈉含量均值為1.583 g·kg-1，因此擴(kuò)展不確定度U=1.583 g·kg-1×11.88%=0.188 g·kg-1，高效液相色譜法測(cè)定香烤瓜子中糖精鈉含量的最終結(jié)果表示為X=(1.583±0.188) g·kg-1，k=2。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)討論了高效液相色譜法測(cè)定香烤瓜子中糖精鈉含量不確定度的主要來源及各不確定度分量的評(píng)定方法，通過評(píng)定過程可知，樣品稱量、樣品溶液定容、重復(fù)性測(cè)量對(duì)分析結(jié)果的不確定度影響相對(duì)較小。本實(shí)驗(yàn)主要的不確定度來自標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的B類不確定度。其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線的溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制不確定度影響較大的為量器引入的不確定度，檢測(cè)過程中應(yīng)盡量選擇精度較高的量器，同時(shí)注重量器的維護(hù)保養(yǎng)，保持量器干燥潔凈，并定期進(jìn)行檢定。單次測(cè)量引入的隨機(jī)誤差對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度貢獻(xiàn)較大。因此，在日常檢驗(yàn)過程中為減少隨機(jī)誤差，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，可增加標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)。