鈣調(diào)素結(jié)合蛋白參與調(diào)控植物逆境脅迫的研究進(jìn)展

吳春婷,范甜,呂天曉,周玉萍,田長恩

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東省植物適應(yīng)性與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510006)

干旱、低溫、鹽、重金屬離子和病原菌等脅迫條件對植物的生長發(fā)育有嚴(yán)重影響，而植物體也具有一系列迅速感知并對逆境脅迫進(jìn)行防御應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[1]。Ca2+作為植物體內(nèi)廣泛存在的第二信使，在植物感受到外界刺激時(shí)會(huì)短暫提高胞質(zhì)的Ca2+濃度，從而形成鈣信號(hào)，不同刺激造成的Ca2+濃度的變化時(shí)間、頻率和幅度均不相同[1]。在不同的逆境脅迫下，植物細(xì)胞通過Ca2+內(nèi)流產(chǎn)生鈣信號(hào)，在完成信號(hào)傳遞功能后，胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+會(huì)被H+/Ca2+酶和Ca2+-ATP 酶重新轉(zhuǎn)運(yùn)回到鈣庫，從而終結(jié)脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)[1]。Ca2+效應(yīng)器主要有3 種: 鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)及其類似蛋白(calmodulinlike protein,CML)、鈣依賴型蛋白激酶(Ca2+dependent protein kinases,CDPK)、鈣調(diào)磷酸酶B 樣蛋白(complexes of calcineurin-B-like proteins,CBL)[2]。CaM/CML 是Ca2+濃度波動(dòng)的主要感受器，由于其本身并沒有催化活性，只能通過與下游的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(calmodulin binding proteins,CaMBPs)互相作用并調(diào)節(jié)其活性來發(fā)揮功能[2]。本文主要介紹CaM/CML 的下游結(jié)合蛋白在植物脅迫信號(hào)響應(yīng)中的作用。

1 鈣調(diào)素與其結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與種類

CaM 是一種廣泛存在于植物中的鈣結(jié)合蛋白,具有多種亞型，其氨基酸序列兩端各含有1 對能與Ca2+結(jié)合的EF-hand 結(jié)構(gòu)，中間以螺旋管結(jié)構(gòu)相連[3]。1 個(gè)CaM 蛋白可以與4 個(gè)Ca2+結(jié)合，形成復(fù)合物后CaM 構(gòu)象會(huì)發(fā)生顯著變化，EF-hand 螺旋間的相對方向發(fā)生變化，使一些疏水殘基暴露于CaM表面以增大暴露面積，形成容易與靶蛋白結(jié)合的疏水表面和疏水穴[3]。而沒有Ca2+結(jié)合的CaM 稱為ApoCaM，可以在低濃度或者缺乏Ca2+的條件下與靶蛋白結(jié)合并發(fā)揮活性，與Ca2+/CaM 復(fù)合物的構(gòu)象變化相比，ApoCaM 在N 端始終關(guān)閉的情況下,C端則保持半開和關(guān)閉的動(dòng)態(tài)變化，從而保證在沒有Ca2+的情況下也能與靶蛋白結(jié)合[3]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有7 個(gè)基因(CaM1～CaM7)編碼4 種CaM 亞型，分別為CaM1/CaM4、CaM2/CaM3/CaM5、CaM6 和CaM7；除此之外，還發(fā)現(xiàn)了50個(gè)編碼CML 的基因，其中CaM7具有轉(zhuǎn)錄活性,其余的CaM/CML均要與下游靶蛋白結(jié)合才能發(fā)揮功能[4]。

CaMBPs 是指能與CaM/CML 結(jié)合的蛋白，包括在體外或體內(nèi)能和CaM/CML結(jié)合的蛋白以及各種受CaM/CML 調(diào)控的酶類[4]，CaMBPs 通過CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CaM-bingding domain,CaMBD)與CaM結(jié)合。IQ 基序是第1 個(gè)發(fā)現(xiàn)的不依賴Ca2+的CaMBD，1-5-10 基序和1-8-14 基序是依賴于Ca2+的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，故通過與CaM 結(jié)合方式的不同將CaMBPs分為Ca2+依賴型和Ca2+不依賴型[5]。Ca2+依賴型CaMBPs 主要包括CBP60s (calmodulin-binding protein 60s)、MLO (mildew resistance locus Os)、MKPs (mitogenactivated protein kinase phosphatases)及其他與CaM/CML 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等；而Ca2+不依賴型CaMBPs 在植物中主要是指含有IQ 基序的蛋白，主要包括myosins、CAMTAs (calmodulin-binding transcription activators)、CNGCs (cyclic nucleotidegated channels)、IQDs (IQ67-domain containing proteins)和IQMs (IQ-motif containing proteins)[2]。

已經(jīng)在植物中鑒定出許多種類的CaMBPs，功能已經(jīng)明確的超過50 個(gè)，主要種類包括代謝酶類、轉(zhuǎn)錄因子、離子通道等[2],不僅參與調(diào)控植物的多種生理過程，還參與植物脅迫防御反應(yīng)調(diào)控過程。研究表明CaMBPs 的表達(dá)可以被各種非生物脅迫(高溫、干旱、和寒冷等)、生物脅迫(各種病原菌和食草性昆蟲)和水楊酸(salicylic acid,SA)、乙烯和茉莉酸(jasmonic acid，JA)等激素誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)下游靶基因并參與激素信號(hào)、離子運(yùn)輸、基因轉(zhuǎn)錄等途徑，從而對植物的抗逆響應(yīng)起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[6–11]。

2 Ca2+依賴型的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白參與調(diào)控植物脅迫響應(yīng)

2.1 鈣調(diào)素結(jié)合蛋白60 (CBP60)家族

CBP60s 是植物中特有的可以結(jié)合CaM 的轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥篩選CaMBP 中最早被發(fā)現(xiàn)[12]。擬南芥中該家族有8 個(gè)成員(CBP60a～CBP60g 和SARD1)，均含有1 個(gè)CaMBD，大多數(shù)位于C 端,只有CBP60g 的CaMBD 位于N 端附近，但SARD1的CaMBD 突變，不能與CaM 結(jié)合[12]。

CBP60s 在植物的免疫響應(yīng)中具有重要作用,CBP60g主要通過調(diào)控異分支酸合酶1 (isochorismate synthase 1,ICS1)來調(diào)節(jié)受到病原菌侵害的植物中產(chǎn)生SA，從而引起植物的防御反應(yīng)[8,12]。研究表明CBP60g 是植物免疫的正調(diào)節(jié)因子，CBP60g過表達(dá)促進(jìn)擬南芥SA 的積累，同時(shí)誘導(dǎo)病程相關(guān)(pathosenesis-related,PR)基因和ICS1基因的表達(dá)，從而提高了對丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的抗病性[8]，而cbp60g突變增強(qiáng)了擬南芥對丁香假單胞菌的敏感性，降低了植物體內(nèi)的SA 水平[12]。CBP60b可以直接激活CBP60g和SARD1的轉(zhuǎn)錄,cbp60b的突變會(huì)使擬南芥植株SA 含量升高，從而增加了植物抗病性[14]。除了參與調(diào)控植物對丁香假單胞菌的抵抗力，大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的分泌蛋白VdSCP41 可以直接靶向結(jié)合擬南芥CBP60g、SARD1 和棉花(Gossypium hirsutum)的GhCBP60b,抑制轉(zhuǎn)錄因子活性，從而降低植物抗病性[15]。

與CBP60b/CBP60g 不同，該家族的另1 個(gè)成員CBP60a 被認(rèn)為是一個(gè)免疫抑制因子，其突變會(huì)導(dǎo)致病原菌生長減慢，CBP60a 能夠與CML46、CML47 結(jié)合，抑制SA 在被病原菌感染的擬南芥中的積累，表明SA 依賴的鈣調(diào)素信號(hào)在植物免疫中具有一個(gè)復(fù)雜的模式[16]。

除了應(yīng)對各種病原菌的侵襲，CBP60 家族同時(shí)也參與調(diào)節(jié)植物的多種非生物脅迫，對擬南芥進(jìn)行熱激處理后，AtCBP60g過表達(dá)的植株表現(xiàn)對高溫脅迫更為敏感的表型，其比野生型更為矮小，出現(xiàn)黃化現(xiàn)象[13]。而在干旱脅迫下，AtCBP60g過表達(dá)還可以提高ICS1基因的表達(dá)量，增強(qiáng)了對干旱的耐受能力[8]。

2.2 白粉病抗性基因(MLO)家族

MLO 是一類植物特有的抗病蛋白，在C 末端存在CaMBD，可以在Ca2+存在下與CaM 形成復(fù)合物[17]。該家族中大多數(shù)成員作為白粉病的感病因子，均會(huì)降低植物對白粉病的抵抗力，MLO 蛋白作為白粉病菌入侵植物體所必需的條件[18]，當(dāng)特定的mlo基因的缺失突變，MLO 蛋白失去負(fù)調(diào)控白粉菌抗性的功能，使煙草(Nicotiana tabacum)[18]、大麥(Hordeum vulgare)[19]和番茄(Lycopersicon esculentum)[20]等植物引發(fā)對白粉病的廣譜抗性。

MLO基因最初在大麥中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大麥?zhǔn)艿桨追劬秩緯r(shí)，CaM 可以通過與MLO 蛋白相互作用從而抑制植物的防御反應(yīng)[19]。在辣椒(Capsicum annuum)中，CaMLO2 和CaCaM1 特異性結(jié)合可以抑制由辣椒瘡痂病菌(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)引起的細(xì)胞死亡和植物免疫防御，而沉默CaMLO2基因的表達(dá)會(huì)增加植物體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量以及增強(qiáng)抗病性[21],過表達(dá)CaMLO2會(huì)增強(qiáng)擬南芥對丁香假單胞菌和對卵菌病原灰霉病(Hyaloperonospora arabidopsidis)的敏感性[22],同時(shí)可以恢復(fù)番茄突變體對白粉菌的敏感性[20]。CsMLO1和CsCaM3的過表達(dá)均降低了黃瓜(Cucumis sativus)子葉對棒孢葉斑病菌(Corynespora cassiicola)的抗性和防御相關(guān)基因的表達(dá)，證明CsMLO1 與CsCaM3 的相互作用能夠負(fù)調(diào)控黃瓜的抗病防御反應(yīng)[23]。

MLO 蛋白不僅可以負(fù)調(diào)控植物對病原體感染的防御反應(yīng)，在植物響應(yīng)干旱脅迫的應(yīng)答中也有重要作用。有研究表明，干旱處理12 d 后，沉默CaMLO2基因的辣椒葉片組織鮮重?fù)p失較小，丙二醛含量降低，而過表達(dá)CaMLO2基因的擬南芥植株，干旱脅迫12 d 后的地上部分生物量的相對減少量顯著高于野生型，證明CaMLO2 作為ABA 的負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控了植物的抗旱性[24]。

2.3 MAPK 磷酸酶(MKP)家族

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與植物對各種生物和非生物脅迫的響應(yīng)，如重金屬、低溫和鹽等[25]。MAPK 磷酸酶(MAPK phosphatases,MKPs)是MAPK 信號(hào)途徑重要的負(fù)調(diào)控因子，作為一種雙特異性磷酸酶，對絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸殘基去磷酸化使MAPKs 失活，從而使MAPKs 的信號(hào)傳導(dǎo)可以受到嚴(yán)格的調(diào)控[26]。在擬南芥基因組中，只鑒定到5 種MKPs，包括AtMKP1、PHS1、IBR5、MKP2 和DsPTP1，其中CaM 結(jié)合型MAPK 磷酸酶MKP1 和DsPTP1 可以在Ca2+存在下和CaM 結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其活性，在生物和非生物脅迫過程中均有重要作用[27–28]。

煙草NtMKP1 是最早被鑒定可以與CaM (Nt-CaM1,NtCaM3 和NtCaM13)結(jié)合的MAPK 磷酸酶，NtMKP1過表達(dá)會(huì)抑制傷口誘導(dǎo)的蛋白激酶(woundinduced protein kinase,WIPK)和SA 誘導(dǎo)的蛋白激酶(salicylic acid-induced protein kinase,SIPK)的表達(dá)[26]。NtMKP1表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因煙草NtMKP1-AS 植株中SIPK和WIPK表達(dá)增強(qiáng)，且在接種灰霉菌(Botrytis cinerea)后的煙草葉片壞死率顯著小于對照，同時(shí)也降低了甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)和夜蛾(Spodoptera litura)在煙草葉片上的存活率[10],證明NtMKP1作為一種負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控植物的損傷反應(yīng)和對病蟲害的抗性[10,26]。

TMKP1 是目前唯一被鑒定到的小麥(Triticum aestivum) MAPK 磷酸酶，參與調(diào)節(jié)小麥對鹽脅迫和滲透脅迫的響應(yīng)[29]。TMKP1在擬南芥中異源表達(dá)可以提高鹽脅迫下種子發(fā)芽率和幼苗的抗氧化活性[30]。

在擬南芥中，CaM 通過2個(gè)CaMBD與AtMKP1結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性[27]。atmkp突變及其磷酸酶活性的缺失提高了植物耐鹽性，提示MKP1 在滲透調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用[31]。而在植物免疫反應(yīng)中，AtMKP1作為負(fù)調(diào)控因子調(diào)控ROS 的產(chǎn)生和植物對不同病原體的敏感性[32]。AtDsPTP1 作為1 個(gè)CaM 結(jié)合型的雙特異性磷酸酶，與CaM2 的結(jié)合僅會(huì)調(diào)節(jié)其對酪氨酸的去磷酸化活性[28]。在atdsptp1突變體中,脯氨酸含量和滲透應(yīng)答基因表達(dá)均顯著增加，用甘露醇處理后，atdsptp1突變的種子也較野生型有更高的發(fā)芽率[33]。

2.4 其他Ca2+依賴型的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白

除以上3 個(gè)依賴Ca2+的CaMBP 家族外，植物中，還有一些依賴Ca2+的CaMBPs 作為酶、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等在植物的脅迫響應(yīng)中起重要作用。

酶參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生長發(fā)育過程中的各種生理活動(dòng)，而一些酶類可以結(jié)合CaM 在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[34]。AtPP7 是植物中最先發(fā)現(xiàn)的CaM 結(jié)合型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,atpp7缺失突變體降低了擬南芥幼苗的耐熱性[35]。龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)的肌醇-1-磷酸合酶(myoinositol-1-phosphate synthase,MIPS)也是一種CaMBP,可參與響應(yīng)植物的高溫脅迫[36]。

CaM 結(jié)合型激酶在逆境響應(yīng)中同樣發(fā)揮重要作用，AtCBK3 是擬南芥中的一種CaM 結(jié)合型激酶,可以促進(jìn)AtHSFA1a 的磷酸化和激活HSFs (heat-shock transcription factors)與HSEs (heat-shock elements)的結(jié)合，從而正向調(diào)節(jié)擬南芥的熱休克反應(yīng)[37]。CRLK1 是一種CaM 結(jié)合型類受體蛋白激酶，正常生長條件下，crlk1突變體與野生型并無特別表型差異，但處于低溫條件中，crlk1突變體表現(xiàn)出更高的敏感性[9]。OsDMI3 是一種Ca2+/CaM 依賴性蛋白激酶(Ca2+/CaM-dependent protein kinase,CCaMK)，作為ABA 信號(hào)傳導(dǎo)的正調(diào)節(jié)因子，在鹽脅迫下，可以正向調(diào)控水稻根系對鹽的耐受性以及側(cè)根的生長[38–39]。

CaM 除了可以調(diào)節(jié)酶的活性之外，還能夠與轉(zhuǎn)錄因子相互作用[2]。MYB2 是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族成員之一，GmCaM4 通過結(jié)合AtMYB2增強(qiáng)AtMYB2 的DNA 結(jié)合活性，過表達(dá)GmCaM4增加了脯氨酸的積累，從而增強(qiáng)植物的耐鹽性[40]。在GTL (GT-2 LIKE)轉(zhuǎn)錄因子家族中,AtGTL1 能與CaM 結(jié)合，是植物抗旱性的負(fù)調(diào)節(jié)因子，gtl1可以在干旱脅迫下保持更高的存活率[41]；同樣地，從楊樹(Populussp.)中鑒定的PtaGTL1 也能與CaM 結(jié)合，在干旱脅迫下可以調(diào)節(jié)水分利用率和增強(qiáng)植物的耐旱性[42]。在擬南芥中，另一種轉(zhuǎn)錄因子AtABF2/AREB1 也被鑒定為CaMBP，可以正向調(diào)控植物的抗旱性，其突變體atabf2在干旱脅迫下成活率明顯降低[43]。

WRKY 家族中的WRKY7/WRKY11/WRKY17都能與CaM 互作[44]，作為擬南芥病原菌相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)觸發(fā)免疫的調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控植物對丁香假單胞菌的抗性[45]。AtTGA3 是第1 個(gè)被發(fā)現(xiàn)能與CaM 結(jié)合的堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)類型的轉(zhuǎn)錄因子,其突變體attga3會(huì)增加擬南芥對丁香假單胞菌的敏感性[46]。

除此之外，CaM 還可將Ca2+傳遞到與其結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而對跨膜運(yùn)輸進(jìn)行調(diào)節(jié)，在擬南芥的P2A型鈣離子ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(autoinhibited Ca2+-ATPase,ACA)家族中，ACA2/ACA4/ACA8/ACA11 均被鑒定為CaMBP[34,47],aca4/aca11突變激活了由SA 誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡，而aca8及其同源物aca10突變則會(huì)增加植物對病菌的敏感性[48]，同時(shí)aca8和aca10雙突變體會(huì)減少由細(xì)菌鞭毛蛋白flg22誘導(dǎo)的ROS 和鈣離子的爆發(fā)，提示ACA4/ACA8/ACA11均參與調(diào)節(jié)植物的免疫應(yīng)答[48–49]。PEN3 是PDR(pleiotropic drug resistance)型ABC (ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，可以與CaM7 結(jié)合,調(diào)節(jié)擬南芥對病原菌的免疫響應(yīng)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[50]。在擬南芥中的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+antiporter,NHX) AtNHX1 能與CML18 互作，AtNHX1過表達(dá)可以降低擬南芥對鹽脅迫的敏感性[51–52]。

3 Ca2+不依賴型的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白參與調(diào)控植物生物與非生物脅迫

3.1 鈣調(diào)素結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子(CAMTA/SR)家族

CAMTAs 是受CaM 調(diào)控的一類轉(zhuǎn)錄因子，由于可以響應(yīng)多種信號(hào)分子，所以也稱為SRs (signalresponsive genes)[53]。CAMTAs 最早在煙草幼苗中作為CaMBP 被分離出來[54]。在擬南芥[53]、番茄[55]和水稻[56]中分別鑒定出CAMTA/SR 家族成員16、7和7 個(gè)。在真核生物中，該家族的功能結(jié)構(gòu)域較為保守，均含有CG-1 結(jié)構(gòu)域、TIG 結(jié)構(gòu)域、ANK 重復(fù)結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)Ca2+依賴型CaMBD 和串聯(lián)重復(fù)的IQ 基序[56]。2 個(gè)CaMBD 的存在提示不同物種的CAMTA/SR 蛋白結(jié)合CaM 的方式可能存在不同,例如擬南芥CAMTA1 和番茄CAMTA 與CaM 結(jié)合均依賴Ca2+[53,55]，而水稻的OsCBT 中,在Ca2+缺乏時(shí)可以通過IQ 基序與CaM 結(jié)合,在Ca2+存在時(shí)通過另一個(gè)Ca2+依賴型CaMBD 與CaM 結(jié)合[56]。小麥的TaCAMTA4 也被證明以依賴Ca2+的方式結(jié)合CaM[57]。

在大多數(shù)植物中，CAMTAs 參與調(diào)節(jié)植物對不同病蟲害的防御反應(yīng)。擬南芥CAMTA3/SR1 被證明是植物免疫響應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，有研究表明,CAMTA3/SR1 可以通過識(shí)別和結(jié)合與抗病有關(guān)的靶基因EDS1、NDR1和EIN3的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)來參與SA 和乙烯反應(yīng)通路，從而負(fù)調(diào)控植物對丁香假單胞菌、白粉病菌和灰霉菌的抗性[58–59]。擬南芥camta3-1、camta3-2在正常情況下出現(xiàn)嚴(yán)重的病變表型，且該突變會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)SA 的積累[58,60]；在擬南芥camta3突變植株中接種稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)后，提高了植物體內(nèi)由PAMP 誘導(dǎo)的H2O2和ROS 含量，且增強(qiáng)了病原體誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)[61]。同時(shí)在接種核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)后，突變體植株中AtJIN1基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)，推測AtCAMTA3 也可能通過直接靶向JIN1 來調(diào)節(jié)JA 信號(hào)通路，從而負(fù)調(diào)節(jié)對核盤菌的抗性[62]。AtCAMTA3 在水稻中的同源蛋白OsCBT也是植物防衛(wèi)反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，oscbt突變體會(huì)增強(qiáng)水稻對稻黃單胞菌和稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的抵抗力[56]。利用VIGS 技術(shù)沉默小麥和番茄的CAMTA基因，結(jié)果表明小麥的TaCAMTA4 和番茄的SlSR1、SlSR3L 也發(fā)揮負(fù)調(diào)控抗病響應(yīng)的功能[57,63]。

除了參與調(diào)控植物對病菌體的防御反應(yīng)，CAMTA3 作為正調(diào)控因子與CaM 結(jié)合參與調(diào)節(jié)植物對食草性昆蟲的防衛(wèi)反應(yīng)[64–65]。JA 是植物體內(nèi)的一種重要的信號(hào)分子，JA 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)植物對食草昆蟲的抵抗，蟲咬會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)JA含量的增加，而sr1突變體經(jīng)蟲咬后體內(nèi)的SA 含量增加而JA 水平降低[65]。sr1突變均降低了擬南芥對食草昆蟲真菌蚊(Bradysia impatiens)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的抗性[64]。

CAMTA3 不僅參與調(diào)控植物的抗病蟲害反應(yīng),在植物響應(yīng)鹽脅迫中也起到負(fù)調(diào)節(jié)的作用。當(dāng)用100、150 mmol/L 的NaCl 處理camta3突變體時(shí)，2個(gè)突變體sr1-1和sr1-2均表現(xiàn)出了對鹽脅迫的耐受性[66]。在種子萌發(fā)過程中，另一個(gè)耐鹽性的負(fù)調(diào)控因子CAMTA6/SR3 直接或間接調(diào)控了大多數(shù)與鹽脅迫有關(guān)的基因的表達(dá)，且其突變體camta6-4和camta6-5在鹽脅迫下的發(fā)芽率也高于野生型[67]。在干旱條件下，相比于野生型，擬南芥camta1突變體表現(xiàn)出了生長緩慢，光合作用效率和水分利用率均降低等對干旱高敏感性的表型[68]。番茄的SlSR1L可能調(diào)控大量干旱脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，沉默SlSR1L的番茄植株對干旱的耐受性下降[63]。最近,CAMTA3 也被證明可以正調(diào)控植物對干旱脅迫的應(yīng)答，sr1-1和sr1-2缺失突變體對干旱的敏感性高于野生型，過表達(dá)的SR1株系SR1OX-4 和SR1OX-5在停止14 d 的干旱脅迫，復(fù)水后的存活率也高于野生型[11]。在擬南芥中，CBF 寒冷響應(yīng)途徑被證明可以調(diào)節(jié)植物對低溫的耐受性，而CAMTA3 是CBF2表達(dá)的正調(diào)控因子，但camta3單突變體的耐凍性無顯著變化，而camta3和camta1雙突變體對低溫的抗性顯著降低，證明擬南芥的耐冷性依賴于CAMTA3和CAMTA1 的共同作用[69]。

3.2 IQ67 結(jié)構(gòu)域(IQD)家族

IQD 家族是植物特有的CaMBP 家族，最早在水稻和擬南芥中發(fā)現(xiàn)[70]，分別有29 和33 個(gè)同源基因。該家族成員的特征是均含有1 個(gè)由67 個(gè)氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域，也稱為IQ67 結(jié)構(gòu)域[70]。該結(jié)構(gòu)域不僅含有1 個(gè)IQ 基序，還具有2 個(gè)Ca2+依賴型的1-5-10 基序和1-8-14 基序[70]。故不同IQD結(jié)合CaM 的方式有所不同，AtIQD1 與CaM 的結(jié)合依賴Ca2+[71]，而AtIQD20 和AtIQD26 與CaM 的結(jié)合均不依賴Ca2+[72]。

硫代葡萄糖苷是一種參與調(diào)控植物防御反應(yīng)的次生代謝物，擬南芥IQD1 可以調(diào)控多種硫代葡萄糖苷代謝基因的表達(dá)，作為正調(diào)控因子增加植物體內(nèi)硫代葡萄糖苷的積累，從而促進(jìn)植物對食草性昆蟲的抗性[71]。最近研究表明，擬南芥IQD1 還參與了調(diào)控植物對病原菌的抗性，iqd1-1對灰霉菌的敏感性增加而超表達(dá)的植株對灰霉菌的抵抗性增加[73]。

在陸地棉(Gossypium hirsutum)GhIQD31和Gh-IQD32基因敲除植株中，抗氧化物酶SOD、CAT 活性降低，從而提高了陸地棉對干旱和鹽脅迫的敏感性[74]。在大白菜(Brassica rapavar.glabra)中，利用VIGS 技術(shù)沉默BrIQD5基因，正常情況下的表型與野生型一樣，但干旱處理10 d 后，沉默BrIQD5的植株出現(xiàn)了更嚴(yán)重的黃化和枯萎現(xiàn)象[75]。而在煙草瞬時(shí)超表達(dá)BrIQD5和BrIQD35植株均提高了對干旱的耐受性[75–76]。

3.3 IQ 基序(IQM)家族

在擬南芥IQM 家族中共有6 個(gè)成員(IQM1～I(xiàn)QM6)，N-端具有一段與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A (pea heavy-metal induced protein 6A,PHMIP 6A)同源性較高的序列，C-端與天花粉素具有較高的同源性,每個(gè)成員均含有1 個(gè)IQ 基序，與CaM 的結(jié)合不依賴Ca2+[77]。而IQM1 和IQM4 的IQ 基序發(fā)生突變后，均不能與CaM 結(jié)合[77–78]。同樣地，水稻中的8個(gè)IQM 家族成員也均是通過IQ 基序結(jié)合OsCaM1，缺失則不能結(jié)合[79],證明IQ 基序是IQM 家族成員與CaM 結(jié)合所必需的。

有研究表明，AtIQM1 可以直接結(jié)合CATALASE2 (CAT2)并促進(jìn)其表達(dá)，從而提高CAT2 活性和間接提高與JA途徑相關(guān)的ACX2和ACX3活性,提高JA 的含量。并且當(dāng)IQM1 與CaM5 結(jié)合后，CAT2活性會(huì)被進(jìn)一步升高,證明IQM1 是在CaM 介導(dǎo)下通過與CAT2 的結(jié)合激活JA 介導(dǎo)的植物病害反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而提高擬南芥對灰霉菌的抗性[80]。棉花中的IQM1 在植物抗病性上表現(xiàn)出了相反的作用，接種黃萎病菌“V991”后20 d，GhIQM1沉默的植株出現(xiàn)葉片壞死黃化等表型顯著輕于野生型[81],與SA 途徑有關(guān)的NPR1、NPR3和PR5的表達(dá)量均提高，而與JA 途徑有關(guān)的后AOC、AOS和PDF1.2表達(dá)均下降，證明GhIQM1基因通過激活JA 信號(hào)途徑同時(shí)負(fù)調(diào)控SA 信號(hào)和棉花對黃痿病的抗性[81]。

在擬南芥中，IQM4 被證明可以調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的響應(yīng)，iqm4在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中均表現(xiàn)出ABA 不敏感和鹽超敏感表型，而IQM4過表達(dá)株系則表現(xiàn)出ABA 和滲透超敏感和鹽不敏感表型[78]。

3.4 環(huán)核苷酸門控通道(CNGC)家族

CNGCs 是一種由4 個(gè)亞基組成的非選擇性陽離子通道，首個(gè)報(bào)道的CNGC基因是在大麥的糊粉蛋白cDNA 表達(dá)文庫中篩選CaM 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中鑒定出來的[82]。在擬南芥[83]、小麥[84]和大白菜[85]等植物也報(bào)道了CNGC的同源序列。從結(jié)構(gòu)來看,CNGC 含有6 個(gè)ɑ-螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)域(S1～S6)，其中S5 和S6間存在1 個(gè)負(fù)責(zé)離子選擇性過濾的P 結(jié)構(gòu)域(P loop),CaMBD 位于CNGCs 的C 端，與位于C 末端的環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CNBD)有部分重疊[85]。此外，植物中的CNGCs 還存在1 個(gè)IQ 基序，部分AtCNGCs通過IQ 基序與CaM 結(jié)合，如AtCNGC12 的N 端還存在1 個(gè)CaMBD[83]，證明CaM 對CNGCs 調(diào)控可能存在多種方式。

當(dāng)病原體入侵植物細(xì)胞時(shí)會(huì)引起細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的改變，而CNGC 作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的組分，一方面可以通過與環(huán)核苷酸結(jié)合參與調(diào)控激活Ca2+的內(nèi)流，另一方面其通道活性被增多的Ca2+/CaM 反饋抑制，從而抑制Ca2+的內(nèi)流[86]。同時(shí)植物在防御病原體侵染時(shí)會(huì)產(chǎn)生超敏反應(yīng)，使被感染的細(xì)胞死亡,從而阻止病原體在植物體內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)散。cngc2和cngc4均產(chǎn)生了組成型激活自身免疫反應(yīng)，與野生型相比，體內(nèi)的SA 含量提高,PR的組成型表達(dá)，均提高了擬南芥對病原菌的抗性[97]。ATCNGC11和ATCNGC12的缺失導(dǎo)致擬南芥對灰霉菌和丁香假單胞桿菌無毒株系抵抗力降低，而由這2 個(gè)基因融合而成的功能突變體cpr22(constitutive expresser of PR gene 22)可以組成型表達(dá)PR基因,且表型與cngc2和cngc4一致，不同的是cpr22可以引發(fā)Ca2+依賴的超敏反應(yīng)，且ATCNGC12過表達(dá)可以抑制該組成型免疫表型的產(chǎn)生[88–89]。而進(jìn)一步研究表明CaM1 發(fā)揮功能依賴的是CNGC12 鈣通道活性的激活而并非是CNGC11[90]。ngc20-4可以增強(qiáng)植物的ETI 效應(yīng)子觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity)和PTI (PAMP-triggered immunity)反應(yīng),同時(shí)該單突變體也出現(xiàn)了自身免疫，但與cngc2的生長缺陷不一樣，提示兩者可能以不同方式調(diào)控Ca2+[91]。這證明CNGCs可以參與調(diào)控植物的免疫防御反應(yīng)。

此外，CNGCs 還涉及調(diào)控植物對食草性昆蟲的抗性。AtCNGC19 參與調(diào)控植物識(shí)別食草夜蛾并激活由其誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ca2+內(nèi)流，atcngc19中Ca2+內(nèi)流減弱,茉莉?；惲涟彼岷?、JA 響應(yīng)基因的表達(dá)量和硫代葡萄糖苷積累量均降低，從而降低了擬南芥對食草性昆蟲的抗性。CaM2 作為植物抗蟲害的正調(diào)節(jié)因子，CNGC19 可以與其結(jié)合從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并將其與下游防御信號(hào)耦合[92]。

擬南芥CNGC2 及其在小立碗蘚(Physcomitrella patens)的同源蛋白PaCNGCb 被認(rèn)為是陸地植物的熱傳感器，兩者的缺失均會(huì)使植株產(chǎn)生超熱敏表型，PaCNGCb 的缺失導(dǎo)致植物體內(nèi)Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生熱休克反應(yīng)[93]。cngc2-1 和cngc2-2的耐熱性增強(qiáng),幼苗中抗壞血酸過氧化物酶和熱休克蛋白等熱響應(yīng)蛋白的積累增加[94]。而AtCNGC10、AtCNGC19和AtCNGC20都被證明參與調(diào)節(jié)擬南芥對鹽脅迫的響應(yīng)，在NaCl 處理下，atcngc10突變增強(qiáng)了種子萌發(fā)和幼苗時(shí)期的擬南芥耐鹽性[95]；AtCNGC19和At-CNGC20在地上部的表達(dá)增強(qiáng)，cngc19和cngc20突變體植株和愈傷組織生長較遲緩，而過表達(dá)的AtCNGC19和AtCNGC20使植株和愈傷組織出現(xiàn)對鹽的耐受性[96–97]。

3.5 肌球蛋白(Myosin)家族

肌球蛋白Myosins 是個(gè)十分龐大的家族，可分成37 類，與其他真核生物相比，在植物中的數(shù)量較少，只鑒定出VIII 和XI 兩類植物特異性的肌球蛋白[98]。肌球蛋白的結(jié)構(gòu)較為保守，由頭、頸和尾三部分組成，頸部含有2 條輕鏈，其中包含1～6 個(gè)IQ 基序[100]。肌球蛋白作為一種分子馬達(dá)，能將ATP水解產(chǎn)生的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為供生命活動(dòng)所需的機(jī)械能，并能夠沿著肌動(dòng)蛋白絲運(yùn)動(dòng)。其已被報(bào)道的主要功能包括在細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、有絲分裂以及胞間連絲等起到重要作用[98]，其成員在植物抗逆方面的研究較少。擬南芥Myosins XI共有13個(gè)成員(XI-1、XI-2、XI-A～XI-K)，其中XI-2、XI-B 和XI-F 的IQ 基序可以輕鏈的形式與CaM 結(jié)合[99]。在病原體感染反應(yīng)中，5 個(gè)肌球蛋白XI 基因(XI-1、XI-2、XI-H、XI-I、XI-K)在葉片的表達(dá)量較高，進(jìn)一步構(gòu)建單突和多突變體驗(yàn)證試驗(yàn)證明，四突變體xi-1、xi-2、xi-i、xi-k植株對滲透脅迫具有較高的抗性，用真菌病原體炭疽菌(Colletotrichum destructivum)侵染后，與野生型相比，四突變體植株的葉片出現(xiàn)了大量孢子萌發(fā)和菌絲的形成，表現(xiàn)出對病原體完全敏感的表型。提示擬南芥Myosins XI 是提高植物抗病性的關(guān)鍵調(diào)控因子[100]。

3.6 其他Ca2+不依賴型的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白

擬南芥中的AtBAG6 含有1 個(gè)BAG (BCL-2-associated athanogene)結(jié)構(gòu)域與IQ 基序，與CaM 結(jié)合不依賴游離的Ca2+。編碼該蛋白的基因轉(zhuǎn)錄是由SA、H2O2和高溫特異性誘導(dǎo)。過表達(dá)AtBAG6基因會(huì)使酵母和植物細(xì)胞產(chǎn)生類似于超敏反應(yīng)的程序性死亡，且IQ 基序是該蛋白誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡所必需的，證明AtBAG6 是一個(gè)參與調(diào)控植物抗逆和細(xì)胞程序性死亡的CaMBP[13]。

4 展望

CaM/CML 是目前研究最廣泛的Ca2+效應(yīng)器之一，它能夠通過與下游CaMBPs 相互作用來參與調(diào)控植物的各種生理活動(dòng)，尤其是在對逆境脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要功能。盡管目前已經(jīng)鑒定了大量參與植物逆境響應(yīng)的CaMBP，但仍存在一些有待解決的問題。首先，鑒定新的CaMBP 是當(dāng)前最重要的任務(wù)之一，不僅包括經(jīng)典的CaM 靶蛋白，還有目前研究較少的CML 家族調(diào)控的靶蛋白。綜合應(yīng)用多種方法對CaMBP 進(jìn)行篩選將會(huì)擴(kuò)展對植物Ca2+信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)；其次，需要確定CaMBP 在參與調(diào)節(jié)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑時(shí)是否受到了CaM/CML的調(diào)控，在植物抗逆過程中，CAMTA3、CBP60b和CBP60g 等CaMBPs 與CaM 的結(jié)合是它們發(fā)揮調(diào)控免疫功能所必需的，其他的CaMBPs 在植物免疫中的作用是否同樣也依賴于CaM 有待進(jìn)一步研究;第三，需要了解CaM/CML 及其相對應(yīng)的CaMBPs調(diào)節(jié)植物抗逆的復(fù)雜性，如CAMTA3、CBP60b 和CNGCs 等家族成員在調(diào)控植物抗逆中被證明不只是單個(gè)CaMBP 發(fā)揮作用，而是家族成員之間存在拮抗作用或者形成復(fù)合物從而共同調(diào)節(jié),且不同家族成員之間，例如在擬南芥響應(yīng)病原菌時(shí)CAMTA3對CBP60g 和S4RD1 存在抑制作用，提示CaMBPs之間的作用也有利于完善對植物響應(yīng)抗逆機(jī)制的研究。雖然目前已經(jīng)研究了部分CaMBPs 參與調(diào)控特定植物的抗逆反應(yīng)，但將這些CaMBPs 用于培育抗逆作物的工作才剛剛開始，因此可利用分子標(biāo)記輔助育種、基因編輯等技術(shù)將現(xiàn)有研究成果應(yīng)用到作物栽培中，從而獲得各種抗逆的品種。