氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材中35 種農(nóng)藥殘留的樣品處理方法

王紅梅，石青，王晨，郭貝，鄭莉

（湖北省普林標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，武漢 430050）

中醫(yī)藥是我國醫(yī)藥衛(wèi)生的重要組成部分，具有悠久的歷史傳統(tǒng)，是中華民族智慧的結(jié)晶，其獨特的治療理念已逐漸被其它國家所接受。目前我國常用的植物源中藥材有600 多種［1-2］，每年有大量中藥材出口到包括美國、日本在內(nèi)的近100 個國家和地區(qū)［3-4］。由于人類對中藥材需求量較大，野生中藥材資源日漸匱乏，人工種植中藥材成為中藥材市場的主流。為了控制病蟲害，提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，農(nóng)藥的使用量逐漸增加。另外，種植基地的大氣、土壤及灌溉水質(zhì)量等均是導(dǎo)致中藥材中農(nóng)藥殘留的重要因素［5］。近年來，中藥材中農(nóng)藥的檢出率呈現(xiàn)上升趨勢。何清彥等［6］考察了10 種30 批藥食兩用藥材中有機(jī)氯的殘留量，檢出率為100%；鄭雙雙等［7］以《歐洲藥典》為標(biāo)準(zhǔn)，對金銀花、澤瀉和川芎中11種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)金銀花、澤瀉和川芎的不合格率分別為60%、40%和10%；王瑩等［8］調(diào)查了枸杞中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留情況，發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和氯氟氰菊酯4 種中等毒性的農(nóng)藥檢出率均超過25%，其中氰戊菊酯的檢出率高達(dá)75%，因此建立高效、精準(zhǔn)的中藥材中農(nóng)藥殘留的檢測方法勢在必行。

測定農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等［9］。氣相色譜法主要是根據(jù)待測農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)及其所含元素的不同，選擇相應(yīng)的檢測器，不適合對多種不同類型農(nóng)藥的同時檢測。液相色譜法適用于不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定化合物的分析，此法分離效率高、分析速度快，但是液相色譜檢測器不能準(zhǔn)確檢測化合物結(jié)構(gòu)，主要依賴于色譜柱的分離度來定性，不適合多種農(nóng)藥殘留高通道同時檢測［10］。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法作為一種典型的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可對難以區(qū)分的熱穩(wěn)定好且易揮發(fā)的同分異構(gòu)體進(jìn)行分離鑒定，可根據(jù)農(nóng)藥分子的特征離子碎片，準(zhǔn)確鑒別未知農(nóng)藥化合物，適合多組分農(nóng)藥的同時檢測。

常用的中藥材樣品處理方法有固相萃取法、基于QuEChERS 原則的處理方法、凝膠滲透色譜法、加速溶劑萃取法等［11］。凝膠滲透色譜法和加速溶劑萃取法能準(zhǔn)確分離農(nóng)藥殘留組分，減少基質(zhì)干擾，但需要消耗大量溶劑和標(biāo)準(zhǔn)品，操作繁瑣且易造成二次污染；固相萃取法在一定程度上對樣品能起到凈化作用，但是對于多種農(nóng)藥同時分析時難以保證所有農(nóng)藥回收率均較佳；基于QuEChERS 原則的處理方法提取過程較繁瑣［12］，而且鹽包中的硫酸鎂溶解時會放出大量的熱量，影響熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的測定結(jié)果，因此不同樣品處理方法各有優(yōu)勢，但也同時存在缺點和局限性。

目前中藥材中農(nóng)藥殘留檢測主要面臨兩方面問題。一方面是中藥材品種繁多，而且每種中藥材成分的理化性能差異較大，難以建立一種統(tǒng)一的樣品處理方法，甚至對于一些基質(zhì)特殊的中藥材還沒有摸索出適合的樣品處理方法；另一方面是農(nóng)藥品種多樣，物理化學(xué)性質(zhì)差異較大，在藥材中殘留量較低，一般為痕量級，且中藥材中部分成分的理化性能與農(nóng)藥成分相似，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留的提取和凈化難度增大［13-14］。筆者以氣相-串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測手段，對200 種中藥材中35 種農(nóng)藥檢測時的樣品處理方法進(jìn)行了梳理，比較分析了基于QuEChERS 原則的處理方法、石墨化碳黑氨基復(fù)合固相萃?。℅CBNH2）法和親水親油平衡材料固相萃?。℉LB）法3種樣品處理方法的優(yōu)缺點，優(yōu)化了不同類型中藥材的樣品處理方案，為今后中藥材檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀：7890B-7010B GC/TQ 型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：XS105DU 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

全自動均質(zhì)器：AH-50 型，睿科集團(tuán)股份有限公司。

高通道真空平行濃縮儀：MPE 型，?？萍瘓F(tuán)股份有限公司。

高通道全自動固相萃取儀：FS 360 型，?？萍瘓F(tuán)股份有限公司。

可調(diào)式混勻儀：MX-S 型，大龍興創(chuàng)實驗室儀器（北京）股份公司。

35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號為CDAA-M-490405-TZ-1ML，各農(nóng)藥質(zhì)量濃度見表1，上海安譜實驗科技股份有限公司。

表1 35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各農(nóng)藥質(zhì)量濃度

甲苯、乙腈：均為色譜級，上海安譜實驗科技股份有限公司。

氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

基質(zhì)固相分散材料（MSPD）、親水親油平衡材料固相萃取小柱（HLB）和石墨化碳黑氨基復(fù)合固相萃取小柱（GCB-NH2）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

金銀花樣品：客戶送檢。

1.2 樣品處理

1.2.1 基于QuEChERS 原則的處理方法

準(zhǔn)確稱取3.00 g 金銀花粉末（過三號篩）于50 mL 離心管中，加入1%乙酸溶液15 mL，渦旋，使藥粉充分浸潤，靜置30 min，加入15 mL 乙腈，渦旋，混勻，置于振蕩器中以500 次/分的頻率震蕩5 min，加入無水硫酸鎂與無水硫酸鈉的混合粉末（質(zhì)量比為4∶1）7.5 g，立即搖散，置于振蕩器中以500次/分的頻率震蕩3 min，于冰浴中冷卻10 min，以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液9 mL，置于預(yù)先裝有凈化材料（無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化炭黑90 mg）的分散固相萃取凈化管中渦旋，混勻，置于振蕩器中以500 次/分的頻率震蕩5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹儀上濃縮至0.4 mL，加入乙腈稀釋至2.0 mL，渦旋混勻，濾過得樣品處理液。將上述樣品處理液過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，取1.0 mL，加入0.01 mL乙腈，混勻，待測。

1.2.2 HLB 法

準(zhǔn)確稱取5.00 g 金銀花粉末（過三號篩）于100 mL 離心管中，加入1 g 氯化鈉，立即搖散，再加入50 mL 乙腈，以不低于12 000 r/min 轉(zhuǎn)速勻漿處理2 min，然后離心，取上清液。沉淀物中加入50 mL 乙腈重復(fù)操作，合并兩次提取液，減壓濃縮至約3～5 mL，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻即得提取液。移取上述提取液3 mL，通過親水親油平衡材料固相萃取柱（HLB）（200 mg，6 mL）凈化，收集全部凈化液，混勻，即得樣品處理液。將上述樣品處理液過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，取1.0 mL，加入0.01 mL 乙腈，混勻，待測。

1.2.3 GCB-NH2法

提取液制備方法同1.2.2。移取2 mL 提取液，加入裝有石墨化碳黑氨基復(fù)合固相萃取小柱（500 mg/500 mg，6 mL）［臨用前用乙腈-甲苯混合溶液（體積比為3∶1）10 mL 預(yù)洗］，用20 mL 乙腈-甲苯混合溶液（體積比為3∶1）洗脫，搜集洗脫液，減壓濃縮至近干，用乙腈轉(zhuǎn)移并稀釋至2.0 mL，混勻，即得樣品處理液。將上述樣品處理液過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，取1.0 mL，加入0.01 mL乙腈，混勻，待測。

1.3 溶液配制

35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：移取35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，混勻。其中α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、艾氏劑、水胺硫磷、α-硫丹、狄氏劑、4，4′-滴滴伊、除草醚、2，4′-滴滴涕、4，4′-滴滴滴、4，4′-滴滴涕、β-硫丹、硫丹硫酸酯、蠅毒磷的質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL，p，p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度為0.4 μg/mL，久效磷、甲基硫環(huán)磷的質(zhì)量濃度均為0.3 μg/mL，內(nèi)吸磷-O、內(nèi)吸磷-S、滅線磷、殺蟲脒、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、氟甲腈、甲基對硫磷、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈、對硫磷、甲基異柳磷、氟蟲腈砜、苯線磷的質(zhì)量濃度均為0.2 μg/mL，o，p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取金銀花空白基質(zhì)樣品，分別按照1.2.1、1.2.2 和1.2.3 方法進(jìn)行處理。取1.0 mL 樣品提取液，各6 份，氮氣吹干，分別加入35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mL，用乙腈定容至1.0 mL，混勻。其中α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、艾氏劑、水胺硫磷、α-硫丹、狄氏劑、4，4′-滴滴伊、除草醚、2，4′-滴滴涕、4，4′-滴滴滴、4，4′-滴滴涕、β-硫丹、硫丹硫酸酯、蠅毒磷的質(zhì)量濃度均分別為5、10、25、50、75、100 μg/L，p，p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度分別為4、8、20、40、60、80 μg/L，久效磷、甲基硫環(huán)磷的質(zhì)量濃度均分別為3、6、15、30、45、60 μg/L，內(nèi)吸磷-O、內(nèi)吸磷-S、滅線磷、殺蟲脒、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、氟甲腈、甲基對硫磷、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈、對硫磷、甲基異柳磷、氟蟲腈砜、苯線磷的質(zhì)量濃度均分別為2、4、10、20、30、40 μg/L，o，p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、15、20 μg/L。

1.4 共萃取基質(zhì)的測定

用“質(zhì)量測定”方法［15］考察3 種樣品處理方法得到的提取液中共萃取基質(zhì)的含量，即取空白樣品，經(jīng)乙腈提取后未凈化的萃取液為初級萃取液，經(jīng)不同樣品處理方法凈化后的萃取液為最終凈化液，分別將2 mL 最終凈化液置于已稱重的潔凈試管中，氮氣吹干后于110 ℃烘箱中干燥至恒重，取出冷卻并稱重，與原試管質(zhì)量差即為共萃取基質(zhì)的含量。

1.5 儀器工作條件

1.5.1 色譜

色譜柱：VF-17 ms 彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；不分流時間：1 min；載氣：氦氣，純度（體積分?jǐn)?shù)）為99.999%；恒壓模式，柱前壓力為146 kPa；程序升溫：初始溫度為60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min 升溫至120 ℃，然后以10 ℃/min 的速率升溫至160℃，再以2 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，最后以15℃/min 的速率升溫至300 ℃，保持6 min。

1.5.2 質(zhì)譜

電離方式：電子轟擊（EI）電離模式；電離能量：70 eV；燈絲電流：100 μA；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；Q2 碰撞氣：氮氣，純度（體積分?jǐn)?shù)）為99.999%；溶劑延遲：7 min；掃描方式：動態(tài)多反應(yīng)檢測（dMRM）模式。Masshunter 10.0 工作站軟件用于儀器控制和數(shù)據(jù)處理。35 種農(nóng)藥的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 35 種農(nóng)藥的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 共萃取基質(zhì)與色譜峰干擾

基于QuEChERS 原則的處理方法所用的凈化材料為無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）和石墨化碳黑（GCB）。無水硫酸鎂主要是去除多余水分，增強(qiáng)PSA 的凈化效果，排除水分對氣相色譜柱的影響；PSA 能有效去除樣品溶液中酸性和極性化合物，如有機(jī)酸、脂肪酸、部分色素及糖類；C18能除去非極性化合物，如揮發(fā)油、萜類、木質(zhì)素、脂類、類胡蘿卜素等；GCB 可以去除大部分色素和甾醇。HLB 法主要是去除樣品中揮發(fā)油、萜類、磷脂等，對色素去除能力較差。而GCB-NH2法中起凈化作用的主要是NH2—和石墨化碳黑，NH2—與PSA 凈化原理類似，主要去除樣品溶液中極性雜質(zhì)，如有機(jī)酸，脂肪酸等。3 種處理方法凈化后的萃取液中共萃取基質(zhì)的質(zhì)量如圖1所示。由圖1 可以看出，基于QuEChERS 原則的處理方法得到的共萃取基質(zhì)含量最高，為0.031 g，這是因為此方法提取時加入了1%乙酸，水溶性提取物比較多。GCB-NH2法得到的共萃取基質(zhì)含量最低，為0.014 g，而凈化效果比HLB 法好。

圖1 3 種處理方法凈化后的萃取液中共萃取基質(zhì)的質(zhì)量

o，p′-三氯殺螨醇經(jīng)3 種處理方法得到的提取離子色譜圖如圖2 所示。由圖2 可以看出，基于QuEChERS 原則的處理方法對目標(biāo)物色譜峰的干擾最嚴(yán)重，HLB 法其次，而GCB-NH2法干擾最小。

圖2 o，p′-三氯殺螨醇經(jīng)3 種處理方法得到的提取離子色譜圖

2.2 加標(biāo)回收與精密度試驗

稱取金銀花空白基質(zhì)樣品3.00 g，加入35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液25 μL，按1.2.1 方法平行處理6 份樣品溶液；稱取2 份金銀花空白基質(zhì)樣品，各5.00 g，分別加入35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液15 μL，分別按1.2.2 和1.2.3 方法各平行處理6 份樣品溶液，在1.5 儀器工作條件下分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。由表3 可知，基于QuEChERS 原則的處理方法回收率最好，除殺蟲脒外其它34 種農(nóng)藥回收率均在72.9%～110.9%范圍內(nèi)；GCB-NH2法其次，除兩種內(nèi)吸磷外，其它33 種農(nóng)藥回收率均在68.4%～101.8%范圍內(nèi)；HLB 法回收率稍差，有31 種農(nóng)藥回收率在67.4%～112.5%范圍內(nèi)，回收率較差的主要是3 種滴滴涕農(nóng)藥和殺蟲脒，其中4，4′-滴滴伊回收率為53.6%，2，4′-滴滴涕回收率為55.2%，4，4′-滴滴涕回收率為57.2%，殺蟲脒回收率為56.1%。

表3 3 種處理條件下35 種農(nóng)藥加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.3 3 種處理方法綜合對比

基于QuEChERS 原則的處理方法是近幾年比較熱門的一種樣品處理方法［16-17］，此方法不需要對溶劑進(jìn)行大量濃縮，無需購買固相萃取裝置，對于沒有條件購置大量自動化處理設(shè)備的實驗室比較適合，但是此方法主要為手動操作、過程繁瑣，凈化不徹底，易導(dǎo)致目標(biāo)物出峰不理想，殺蟲脒易被凈化材料PSA 吸附造成其回收率偏低，另外也會加快儀器污染和維護(hù)頻率，增加儀器維護(hù)成本。此方法一個樣品只能制備2 mL 凈化液，若要配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，需要同時處理3 個空白樣品，費時費工。

HLB 法不需要活化和洗脫，固相萃取操作相對簡便、快速，親水親油材料由于去除揮發(fā)油類物質(zhì)效果較好，適合含揮發(fā)油較高的中藥材，因此對于一般的藥材均可以用此法處理。不足之處在于此方法較其它兩種方法回收率稍差，對于一些含有較強(qiáng)極性物質(zhì)的中藥材，如延胡索、丹參處理效果較差，使多種化合物靈敏度降低，甚至在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰。

GCB-NH2法的優(yōu)點在于去除色素效果較好，回收率也比HLB 法稍佳，不足之處在于操作較復(fù)雜，固相萃取過程中需要活化和洗脫，固相萃取完以后需要進(jìn)一步濃縮，耗時較長，而且用到甲苯等毒性較強(qiáng)的有機(jī)試劑。對一些揮發(fā)油含量特別高的中藥材，如廣藿香、厚樸、木香等處理效果不佳，部分化合物在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰，襯管和色譜柱也會由于樣品中揮發(fā)油的存在受到污染，從而增加儀器維護(hù)成本。

以上3 種處理方法各有優(yōu)缺點，而中藥材種類繁多，每種中藥材成分理化性能差異較大，很難建立一種統(tǒng)一的樣品處理方法。筆者通過對200 種中藥材的處理方法進(jìn)行摸索，建立了不同中藥材樣品處理方法數(shù)據(jù)庫，見表4。由表4 可知，大部分中藥材用3 種處理方法均可以得到滿足要求的檢測結(jié)果，但是部分中藥材只能選擇其中一種或兩種方法進(jìn)行處理。含揮發(fā)油多的樣品，如廣藿香，用HLB 法可以得到比較理想的結(jié)果，但是采用GCB-NH2法會導(dǎo)致大部分化合物在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰。含極性物質(zhì)較多的中藥材，如延胡索和丹參，只能用石墨化碳黑氨基復(fù)合柱法進(jìn)行處理，否則多種農(nóng)藥在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰，具體原因有待進(jìn)一步研究。含揮發(fā)油和有機(jī)酸較多的中藥材，如厚樸、木香、沉香、沒藥、司卡摩尼亞脂、花椒等，優(yōu)先選擇用HLB 與GCB-NH2相結(jié)合的方法，若單用石墨化碳黑氨基復(fù)合柱法會導(dǎo)致氟蟲腈類物質(zhì)、六六六、甲基對硫磷、對硫磷、三氯殺螨醇、甲基異柳磷和甲基硫環(huán)磷等物質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)出峰不理想。另外，值得關(guān)注的是大部分基質(zhì)中農(nóng)藥化合物保留時間均比較穩(wěn)定，只有某幾種基質(zhì)中的氟蟲腈類物質(zhì)會出現(xiàn)保留時間后移的現(xiàn)象，如厚樸、木香和細(xì)辛等基質(zhì)中的氟蟲腈類物質(zhì)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

表4 200 種藥材前處理方法推薦

3 結(jié)語

基于QuEChERS 原則的處理方法回收率最好，但是過程操作較繁瑣，基質(zhì)干擾較大；親水親油平衡材料（HLB）固相萃取法操作相對較簡便，對揮發(fā)油類含量較多的中藥材處理效果較理想，但是回收率稍差；石墨化碳黑氨基復(fù)合柱法除色素能力最強(qiáng)，基質(zhì)凈化效果最佳，但是對揮發(fā)油類物質(zhì)不理想，且過程操作較復(fù)雜。由于中藥材品種繁多，每種中藥材成分理化性能差異較大，不能籠統(tǒng)地建立一種適合所有中藥材農(nóng)藥檢測的處理方法，因此應(yīng)根據(jù)所檢測的中藥材的理化特性選擇合適的處理方法。