miRNA-125b、miRNA-34a在不同分型鼻息肉中的表達(dá)與相關(guān)性分析

顏抗 聶琛 胡環(huán)宇 馬亞琳

鼻息肉(nasalpolyps)是發(fā)生于鼻腔和鼻竇黏膜的慢性疾病，以極度水腫的鼻黏膜在中鼻道形成單發(fā)或多發(fā)息肉為臨床特征，發(fā)病率與復(fù)發(fā)率均極高，是一種鼻科常見病[1]。鼻息肉的臨床表現(xiàn)因息肉出現(xiàn)的位置、大小及多少而異[2]；通常來說，體積較小的息肉可無明顯癥狀，較大的息肉可出現(xiàn)鼻塞、嗅覺減退等表現(xiàn)[3]；常發(fā)生于支氣管哮喘、阿司匹林耐受不良、變應(yīng)性真菌性鼻竇炎與囊性纖維化患者[4]。目前鼻息肉最有效的治療方法為鼻內(nèi)鏡手術(shù)加糖皮質(zhì)激素治療[5]，但是治療后仍有20%左右復(fù)發(fā)，是鼻科目前治療的難點[6]。鼻息肉的發(fā)病可能與變態(tài)反應(yīng)、阿司匹林耐受不良、遺傳、鼻腔纖毛功能障礙、中鼻道微環(huán)境等有關(guān)[7]。本研究通過研究miRNA-125b和miRNA-34a在正常鼻黏膜、鼻息肉、復(fù)發(fā)性鼻息肉中的表達(dá)情況，期望能找到miRNA-125b和miRNA-34a對鼻息肉發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的影響及規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年3月至2021年3月于我院就診的行鼻內(nèi)鏡下手術(shù)患者71例,分為正常對照20例，初發(fā)鼻息肉患者27例，復(fù)發(fā)鼻息肉患者24例。初發(fā)患者包括單發(fā)鼻息肉21例，多發(fā)鼻息肉6例，男女比例為16∶11；年齡27～59歲，平均年齡(39.3±15.9)歲；復(fù)發(fā)患者包括單發(fā)鼻息肉15例，多發(fā)鼻息肉9例，男女比例為13∶11，年齡31～57歲，平均年齡(41.7±16.2)歲。收集手術(shù)切除患者的增生息肉組織，對照組收集正常鼻黏膜組織作為試驗材料，共收集標(biāo)本71份，收集后立即置于經(jīng)DEPC處理的EP管中，放置于-80℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：高速冷凍離心機(3K30，德國Sigma公司)；超低溫冰箱(DW-86L288，海爾公司)；血細(xì)胞分析儀(RS300，江蘇鴻恩醫(yī)用設(shè)備有限公司)；電泳儀(BL61-DYCZ-24A，北京中西遠(yuǎn)大公司)；微量核酸分析儀(Nano 400A，杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)；熒光定量PCR儀(7500，ABI公司)。

1.2.2 試劑：miRNA-125b、miRNA-34a特異性引物(eBioscience公司，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒(北京中杉公司)；Trizol試劑、RNase free water(上海生工)；氯仿、異丙醇、乙醇均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 EOS水平檢測：術(shù)前1 d抽取空腹靜脈血，置于抗凝管內(nèi)，使用全血細(xì)胞自動分析儀進(jìn)行血細(xì)胞比例分析，當(dāng)EOS比例>5.0%時記錄為陽性(+)。

1.3.2 熒光定量PCR檢測miRN-125b和miRN-34a的表達(dá)在鼻黏膜組織及息肉組織中的表達(dá)：將凍存完好的樣本組織置于室溫自然解凍，取約100 mg置于經(jīng)RNase free EP管中，加入Trtzol Reagent，勻漿，震蕩，提取樣本總RNA，離心(12 000 r/min，10 min，4℃)；取上清液，加氯仿適量，劇烈震蕩約30 s，使混勻，室溫避光放置10 min以上，離心(12 000 r/min，10 min，4℃)；取上清液，轉(zhuǎn)移至另一新的RNase free EP管中；加入等體積異丙醇，緩慢搖勻，-20℃，放置24 h，離心(12 000 r/min，10 min，4℃)，收集沉淀；加入少量75%乙醇溶液，輕輕顛倒EP管，離心(12 000 r/min，5 min，4℃)，重復(fù)2次；置于超凈臺中風(fēng)干，加入0.2 ml RNase free water溶解備用。將上述提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、滅活、PCR擴(kuò)增、電泳、凝膠成像分析(PCR反應(yīng)條件為：PCR Buffer 5 μl，dNTP 1 μl，EsTaq Master-Mix 100 μl，RT反應(yīng)產(chǎn)物10 μl，上下游特異性引物各25 mmoL，總體積50 μl；PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃，3 min；58℃，30 s；72℃，1 min，循環(huán)35次，最后1個循環(huán)72℃延長至7 min)。

2 結(jié)果

2.1 EOS表達(dá)水平 不同類型鼻息肉組織與正常鼻黏膜組織中EOS陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；全部鼻息肉組織標(biāo)本(包括初發(fā)型鼻息肉、復(fù)發(fā)型鼻息肉患者的標(biāo)本組織，n=51)的EOS陽性率為76.47%(39/51)。見表1。

表1 EOS表達(dá)水平

2.2 miRNA-125b和miRNA-34a表達(dá)水平 不同病理類型的標(biāo)本組織中miRNA-125b、miRNA-34a表達(dá)水平不同，正常標(biāo)本組織中miRNA-125b和miRNA-34a表達(dá)水平均較低，而初發(fā)組與復(fù)發(fā)組中，miRNA-125b和miRNA-34a的平均表達(dá)水平升高，2組標(biāo)本組織中miRNA-125b平均表達(dá)水平約為正常標(biāo)本組織的4倍，miRNA-34a的平均表達(dá)水平分別接近正常標(biāo)本組織的1.5和2倍。各組間miRNA-125b表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.05)；miRNA-34a的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。見表2。

表2 miRNA-125b、miRNA-34a表達(dá)水平

2.3 EOS與miRNA-125b、miRNA-34a相關(guān)性分析 列聯(lián)系數(shù)法分析得出，EOS與miRNA-125b、miRNA-34a表達(dá)明顯呈相關(guān)性(P<0.05)。EOS與miRNA-125b的相關(guān)系數(shù)為0.375(P=0.032)，與miRNA-34a的相關(guān)系數(shù)為0.283(P=0.045)。見表3。

表3 嗜酸性粒細(xì)胞與miRNA-125b、miRNA-34a表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

有研究認(rèn)為鼻息肉是染色體隱性遺傳性疾病，也有認(rèn)為其屬于多基因遺傳[8]。人類白細(xì)胞抗原(HLA)

是迄今為止發(fā)現(xiàn)的人類最具有多態(tài)性的基因復(fù)合體，有研究發(fā)現(xiàn)特定HLA等位基因與鼻息肉之間有一定的相關(guān)性[9,10]?，F(xiàn)有研究表明參與鼻息肉病理過程十分復(fù)雜，過敏因素及成纖維細(xì)胞在其中扮演重要角色[11,12]；既往研究表明，miRNA-125b和miRNA-34a在調(diào)控嗜酸性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中起關(guān)鍵作用[13,14]，多種炎性因子的表達(dá)和E0S的作用是鼻息肉發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[15]。鼻黏膜的慢性炎癥同時停隨著局部組織的重構(gòu)，病理上主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞化生，基底膜增厚，膠原及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，間質(zhì)纖維化，血管形成等，其具體機制仍有待闡明[16,17]。

本研究通過觀察miRNA-125b和miRNA-34a其在不同鼻息肉組織中的表達(dá)情況，結(jié)合臨床表現(xiàn)和血中EOS計數(shù)，分析其在不同類型鼻息肉患者的表達(dá)，特別是復(fù)發(fā)性鼻息肉的病因提供新的靶點，找到和嗜酸粒細(xì)胞活化和MAK信號通路的調(diào)控關(guān)系。通過選取初發(fā)鼻息肉及復(fù)發(fā)鼻息肉患者51例，正常對照20例，發(fā)現(xiàn)正常組織、初發(fā)鼻息肉組織、復(fù)發(fā)鼻息肉組織中EOS的陽性率不同類型鼻息肉組織與正常鼻黏膜組織中EOS陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，正常組EOS水平極低，初發(fā)組與復(fù)發(fā)組遠(yuǎn)高于正常組，但是復(fù)發(fā)組又高于初發(fā)組約13%，EOS水平與鼻息肉是否發(fā)生存在相關(guān)性，但是與復(fù)發(fā)幾率的關(guān)系尚不清晰。初發(fā)組、復(fù)發(fā)組標(biāo)本組織中miRNA-125b平均水平約為正常標(biāo)本組織的4倍，miRNA-34a的平均表達(dá)水平分別接近正常標(biāo)本組織2倍，各組間miRNA-125b水平存在顯著差異，miRNA-34a的水平也存在顯著差異；EOS與miRNA-125b的相關(guān)系數(shù)為0.375，與miRNA-34a的相關(guān)系數(shù)為0.283；說明鼻息肉的發(fā)病受到miRNA-125b、miRNA-34a水平的調(diào)控，而且鼻息肉是否復(fù)發(fā)也與此2種miRNA緊密相關(guān)。

既往研究說明miRNA-125b、miRNA-34a水平在鼻息肉的發(fā)生和發(fā)展中起作用，目前鼻息肉的治療主要是局部激素和手術(shù)治療，但沒有很好的方法區(qū)分鼻息肉的性質(zhì)，也沒有找到復(fù)發(fā)性鼻息肉的真正原因和指導(dǎo)下一階段治療的指標(biāo)[18,19]。與蛋白質(zhì)相比，miRNA是一種在體內(nèi)存在相對較穩(wěn)定的形式，有可能成為潛在的一個非侵入性的生物學(xué)標(biāo)志[20]。癌癥的臨床前期研究顯示，miRNA有很大可能成為疾病診斷及預(yù)后判斷的一個生物標(biāo)志物。

綜上所述，miRNA-125b、miRNA-34a水平與EOS水平及鼻息肉的發(fā)病存在密切相關(guān)性，此相關(guān)性對鼻息肉靶向治療及預(yù)后具有重要意義。