二代測序技術(shù)檢測650例非小細胞肺癌驅(qū)動基因突變

趙 冉，伍瀟怡，陳穎瑋，何章勇，羅 鵬，黃維綱，王雪亮

肺癌是全球發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤[1-2]，其分子遺傳學具有較強的異質(zhì)性[3-4]。非小細胞肺癌(non-small cell cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%，是我國肺癌的主要病理類型，其5年生存率較低[5]。NSCLC的發(fā)生、發(fā)展與EGFR等一系列驅(qū)動基因變異有關(guān)[6]。二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)可同時檢測多樣本、多基因、多位點突變信息，可較全面地指導肺癌患者個體化治療或進一步發(fā)現(xiàn)新的基因突變，輔助腫瘤發(fā)病機制研究，已被越來越多地應用于臨床[7-9]。然而，不同研究結(jié)果中NSCLC基因突變位點及頻率存在差異，現(xiàn)有文獻多為對西方人群的報道[4,10]，其與我國人群基因突變情況不同[11]。此外，越來越多的NSCLC多基因突變共存情況被發(fā)現(xiàn)[12]。本實驗通過NGS技術(shù)檢測650例NSCLC中15種肺癌相關(guān)驅(qū)動基因突變情況，進一步明確中國人群驅(qū)動基因突變特征，為NSCLC的精準診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年6月～2020年7月上海鼎晶生物醫(yī)藥公司醫(yī)學檢驗實驗室650例NSCLC標本，均經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed and paraffin embedded， FFPE)保存。650例患者中男性353例(54.31%)，女性297例(45.69%)，年齡28～94歲，中位年齡65歲，平均(64.4±10.4)歲。本實驗在上海市臨床檢驗中心倫理委員會指導下進行，所有患者均知情同意。

1.2 NGS測序及分析采用QIAamp DNA FFPE Kit(德國Qiagen公司)對所有研究樣本進行DNA提取，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。對提取成功的DNA使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(美國Thermo Fisher公司)試劑盒及Qubit 4.0熒光定量儀檢測濃度，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測DNA降解程度。

使用Rapid DNA Lib Prep Kit for Illumina(武漢愛博泰克公司)試劑盒構(gòu)建含目標基因的全基因組文庫，建庫過程中使用UMI接頭保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準確性，使用液相探針進行雜交捕獲，確保文庫的高均一性及高捕獲效率。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(美國Thermo Fisher公司)對捕獲文庫進行定量。

使用Illumina HiSeq X Ten測序儀(美國Illumina公司)進行靶向NGS測序。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，進行生物信息學分析。以GRCh37/hg19為參考序列，分析的基因包括：ALK、BCL2L11、BRAF、EGFR、ERBB2、FGFR、KRAS、MAP2K1、MET、NRAS、NTRK、PIK3CA、RET、TP53、ROS1；檢測分析覆蓋的區(qū)域為全部熱點外顯子(exon)區(qū)域以及部分基因內(nèi)含子；檢測基因變異類型包括點突變、插入缺失變異、融合變異、拷貝數(shù)變異等。檢測變異豐度1%及以上的基因變異判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用t檢驗或χ2檢驗，基因突變數(shù)、突變位點數(shù)、突變頻率等計數(shù)資料采用例數(shù)或率(百分比)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC驅(qū)動基因突變在650例NSCLC標本中，252例(38.77%)未檢測出基因突變，398例(61.23%)檢測有至少1個基因突變，包括274例(42.15%)單個基因位點突變的患者及124例(19.08%)攜帶2個及以上基因突變位點的患者，分別占檢測有基因突變患者的68.84%及31.16%。

本組檢測共有566個突變位點，突變頻率最高的3種基因為EGFR(67.65%)、KRAS(9.22%)和PIK3CA(4.52%)(圖1)。所有檢測有突變的樣本中，BCL2L11基因突變者10例，均為intron2 del(缺失)； ALK基因突變者6例，3例為EML4-ALK融合，其余3例分別為exon 19 P1029S、exon 20 R1084L及exon 23 S1206Y位點突變。

圖1 非小細胞肺癌中各基因突變位點分布

2.2 EGFR基因突變在650例NSCLC患者中313例(48.15%)檢測有EGFR基因突變，包括250例(38.46%)僅攜帶1個EGFR突變位點的患者，51例(7.85%)攜帶2個EGFR突變位點的患者，11例(1.69%)攜帶3個EGFR突變位點的患者，1例(0.15%)攜帶4個EGFR突變位點的患者。其中攜帶≥2個EGFR突變位點的患者合計63例，占NSCLC的9.69%，占EGFR突變的20.13%。

統(tǒng)計學分析：81.5%的EGFR突變?yōu)闊狳c突變，包括L858R(33.93%)、exon 19del(33.16%)、T790M(12.08%)和exon 20ins(2.31%)。其余18.52%的EGFR突變包括24種不同的位于EGFR基因其他外顯子或結(jié)構(gòu)域上的位點，如位于胞外區(qū)域exon 3上的R108I和N110H突變(1.02%)、exon 7上的E282K和A289V突變(1.55%)以及激酶區(qū)域exon 18上的G719A/C/S突變(3.34%)、exon 21上的L861Q/R(1.80%)、exon 20上的C797S(0.77%)突變等(表1)。

表1 非小細胞肺癌中EGFR突變位點

2.3 EGFR基因與其他基因共突變除EGFR基因突變之外，本實驗中還檢測有170例(26.15%)NSCLC攜帶其他14種基因突變，頻率較高的有KRAS、PIK3CA、MET、ERBB2、BRAF等；其中38.24%(65/170)的患者合并有EGFR突變(表2)。

表2 其他基因突變頻率及合并EGFR基因突變[n(%)]

本實驗檢出313例EGFR突變患者中，56例合并其他基因突變，占EGFR突變患者的17.89%，占NSCLC的8.62%。其中48例為EGFR合并另1種基因共突變，7例為EGFR合并其他2種基因共突變，1例為EGFR合并其他3種基因共突變(表3)。

表3 EGFR基因合并其他基因突變

2.4 NSCLC中驅(qū)動基因突變與臨床病理特征的關(guān)系本實驗中女性NSCLC患者發(fā)生驅(qū)動基因突變的比例高于男性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腺癌患者發(fā)生驅(qū)動基因突變的比例明顯高于鱗狀細胞癌患者，腺癌中攜帶基因突變的患者(67.24%)高于無基因突變的患者(32.76%)，鱗狀細胞癌中無基因突變的患者(64.1%)高于攜帶基因突變的患者(35.9%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。鱗狀細胞癌患者中檢測有14例(35.90%)攜帶基因突變：1例ERBB2單一突變，1例ROS1單一突變，1例BRAF單一突變，1例PIK3CA單一突變，7例EGFR單一突變，1例發(fā)生3處EGFR基因突變，1例EGFR合并BCL2L11基因突變，1例EGFR、ERBB2、PIK3CA三基因共突變。5例腺鱗癌患者中檢測有1例攜帶KRAS基因突變。此外，本實驗中不同年齡組間驅(qū)動基因突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表4)。

表4 不同分組間驅(qū)動基因突變情況比較[n(%)]

3 討論

我國每年約40萬人死于肺癌，多數(shù)患者在確診時已處于晚期，失去手術(shù)機會。肺癌的診斷及分型需要綜合臨床、病理、影像、分子生物學等多學科信息，以尋求精準診療方案。其中，分子生物學檢測對提高NSCLC的早期診斷率、改善患者預后具有重要意義，如EGFR、ALK、ROS1等作為重要的肺癌基因靶點已得到廣泛認同[11,13]。因此，NSCLC的治療策略已逐漸從傳統(tǒng)的以腫瘤分期為基礎的方法，轉(zhuǎn)變?yōu)橐越M織形態(tài)學和基因突變引導的靶向治療[13-14]。

近年NGS已逐步應用于臨床，為NSCLC的早期診斷及精準藥物治療提供更可靠的理論和實驗依據(jù)。一項對22例晚期NSCLC患者的多基因靶向NGS結(jié)果顯示，TP53、EGFR、KRAS等基因突變最常見[15]。有國內(nèi)研究結(jié)果顯示，EGFR、TP53、KRAS在29例肺腺癌中的突變率位居前3位[16]。本研究NSCLC患者中突變頻率最高的3種基因為EGFR、KRAS和PIK3CA，而TP53的突變頻率僅為1.39%，在NGS檢測15種基因結(jié)果中突變頻率排第8位，低于文獻報道[15-16]。

EGFR突變在NSCLC基因分型中具有代表性，發(fā)生突變的位點個數(shù)最多，在本實驗結(jié)果中占67.65%。本組NSCLC患者中EGFR突變頻率為48.15%，遠高于已報道的西方NSCLC群體中的10%～35%[4,10,15]。除L858R、exon 19del、T790M、exon 20ins等熱點突變外，本實驗還發(fā)現(xiàn)24種不常見的EGFR突變，占EGFR突變的18.52%；在6例ALK突變中，除3例EML4-ALK融合外，還發(fā)現(xiàn)3例其他不同位點突變。上述結(jié)果均提示中國NSCLC患者基因突變特征的不同。此外，本實驗選取6例NGS檢測EGFR基因未突變及9例EGFR突變的樣本進行exon 18、exon 19、exon 20、exon 21熱點突變區(qū)域的一代測序驗證，結(jié)果與NGS結(jié)果一致，進一步確認了NGS檢測結(jié)果的準確性。

在NSCLC中已發(fā)現(xiàn)越來越多的多驅(qū)動基因變異共存情況，同一NSCLC患者可同時攜帶多個基因突變，或同一種基因上發(fā)生多個位點突變。在本實驗中63例(9.69%)患者檢出≥2個EGFR基因突變位點，占EGFR突變攜帶者的20.13%；56例(8.62%)患者為EGFR合并其他基因突變，占EGFR突變攜帶者的17.89%。然而，在美國及歐洲人群的研究報道中，EGFR突變肺癌患者中共突變基因占比較高的為TP53(54.6%～64.6%)、PIK3CA(9%～12.4%)等[17-19]，與本實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)易合并EGFR突變的基因ERBB2(78.57%)、TP53(62.50%)、ROS1(62.50%)、BCL2L11(57.14%)、PIK3CA(38.46%)等共突變頻率略有差異。本實驗中未發(fā)現(xiàn)有EGFR與ALK共突變情況，與文獻報道ALK重排和EGFR突變相互排斥的結(jié)果一致[20]。不同基因共突變情況會影響EGFR突變NSCLC患者進行TKI治療[17-18]，如EGFR突變-TP53野生型腫瘤對EGFR-TKI的應答率、中位無進展生存率和總生存率，均高于EGFR突變-TP53突變型腫瘤[18]。然而，針對各種不同的基因突變患者，臨床如何選擇合適及有效的治療方案，仍需更多的研究與驗證。利用NGS技術(shù)全面檢測患者腫瘤相關(guān)基因突變，探索基因共突變情況對于指導患者靶向治療、判斷預后具有重要意義。

NSCLC驅(qū)動基因突變情況與不同臨床特征具有一定的相關(guān)性。本實驗結(jié)果顯示，NSCLC女性患者基因突變率高于男性，與文獻報道較一致[21]。此外，腺癌患者基因突變頻率明顯高于鱗狀細胞癌患者；腺癌中攜帶基因突變的患者比例較高，而鱗狀細胞癌中無基因突變的患者比例較高。因此，對于腺癌患者行基因突變檢測指導其靶向治療更有意義。目前，肺鱗狀細胞癌的靶向治療尚不明確，已有研究表明PIK3CA、TP53等基因在肺鱗狀細胞癌患者中突變頻率相對較高，可作為影響肺鱗狀細胞癌患者治療方案及判斷預后的指標[22-23]。后續(xù)可進行更多樣本量的臨床研究驗證。

綜上所述，利用NGS技術(shù)可全面分析患者多基因突變情況，不僅有助于NSCLC早期診斷，也可為患者靶向治療及預后評價提供依據(jù)。NSCLC驅(qū)動基因突變的頻率與臨床病理特征有關(guān)，EGFR、KRAS、PIK3CA等基因在NSCLC中的突變頻率較高，且EGFR突變患者中存在一定比例的與其他基因共突變情況。這些結(jié)果對指導NSCLC患者精準診療有幫助，但仍需積累更多病例進一步分析。