利用秈粳交RIL群體進(jìn)行水稻發(fā)芽期與芽期耐冷性QTL分析

陳子琪，王偉蘋(píng)，趙宏強(qiáng)，王 皓，韓 笑，楊洛淼，辛 威，劉化龍，鄭洪亮，王敬國(guó)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

水稻起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是我國(guó)三大糧食作物之一[1]。與其他糧食作物相比，水稻對(duì)低溫變化更為敏感[2]。黑龍江省作為我國(guó)優(yōu)質(zhì)粳稻的主產(chǎn)區(qū)，是保證我國(guó)糧食安全的“壓艙石”[3]。然而，東北地區(qū)每隔3～4 a就會(huì)發(fā)生一次低溫冷害，導(dǎo)致糧食減產(chǎn)約50億kg[4]，嚴(yán)重危害了我國(guó)糧食安全[5]。黑龍江春季頻發(fā)的倒春寒，嚴(yán)重影響著水稻發(fā)芽期和芽期的生長(zhǎng)。近些年來(lái)，隨著水稻市場(chǎng)價(jià)格逐年下降，人工成本不斷增加，直播作為一種輕簡(jiǎn)化的栽培方式，在水稻生產(chǎn)上的應(yīng)用面積逐年增加[6]。直播栽培經(jīng)常遭受發(fā)芽期和芽期的低溫，導(dǎo)致種子活力下降，發(fā)芽率降低，發(fā)芽慢，出苗不整齊，嚴(yán)重影響了水稻后期的生長(zhǎng)，致使水稻產(chǎn)量大幅降低[7]。因此，定位水稻發(fā)芽期和芽期耐冷相關(guān)QTL，挖掘耐冷相關(guān)基因，對(duì)于耐冷性育種和直播稻生產(chǎn)具有重要意義。

水稻的耐冷性是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。不同研究人員利用不同群體、結(jié)合關(guān)聯(lián)分析和連鎖分析，對(duì)發(fā)芽期和芽期耐冷性QTL進(jìn)行了定位。其中，發(fā)芽期耐冷性鑒定指標(biāo)大多以發(fā)芽率為主。侯名語(yǔ)[8]鑒定了521份水稻品種的低溫發(fā)芽力，發(fā)現(xiàn)秈稻的低溫發(fā)芽力高于粳稻品種，并利用USSR5/N22衍生的F2群體在第2，6，7，11，12號(hào)染色體上檢測(cè)到5個(gè)與低溫發(fā)芽率相關(guān)的QTL。Schl?ppi等[9]利用202個(gè)水稻品種組成的自然群體為試驗(yàn)材料，在第1，6，7，9，10，12號(hào)染色體上共檢測(cè)到6個(gè)與水稻低溫發(fā)芽率相關(guān)的QTL。姜旋等[10]利用粳秈交構(gòu)建的RIL群體，檢測(cè)到7個(gè)水稻發(fā)芽期耐冷QTL，分別位于水稻1，3，5，6，8號(hào)染色體上，表型貢獻(xiàn)率為5%～16%。紀(jì)素蘭等[11]利用Kinmaze和DV85雜交衍生的重組自交系群體，檢測(cè)到11個(gè)與低溫發(fā)芽力相關(guān)的QTL，其中qLTG-7和qLTG-11的表型貢獻(xiàn)率均最大(27.93%)。張所兵等[12]利用扎西瑪/南粳46雜交衍生的RIL群體定位了3個(gè)低溫發(fā)芽率QTL，位于第2，4，7號(hào)染色體上，可解釋7.69%～22.93%的表型變異。姚曉云等[13]利用耐冷型粳稻龍稻5號(hào)和冷敏感型秈稻中優(yōu)早8構(gòu)建RIL群體，分別在自然低溫和人工低溫環(huán)境下各定位到5個(gè)相關(guān)的QTL，位于第2，3，7，8，11，12號(hào)染色體上。滕勝等[14]利用秈粳交構(gòu)建的DH群體，在4，9號(hào)染色體定位到2個(gè)與低溫發(fā)芽力相關(guān)的QTL。朱金燕等[15]以秈稻品種廣陸矮4號(hào)為受體親本、粳稻品種日本晴為供體親本構(gòu)建的染色體單片段代換系為試驗(yàn)材料，檢測(cè)到20個(gè)低溫發(fā)芽率QTL，分布在第1，2，3，5，6，9，11，12號(hào)染色體上。水稻芽期耐冷性評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括損傷程度、成苗率、死苗率等。Zhang等[16]利用包含249個(gè)水稻品種組成的自然群體，以損傷程度和存活率為指標(biāo)，在5 ℃低溫處理下共定位到13個(gè)芽期耐冷相關(guān)QTL。張露霞[17]利用Asominori/IR24構(gòu)建的RIL群體，在5 ℃低溫處理下以死苗率為指標(biāo)，檢測(cè)到3個(gè)芽期耐冷性QTL，分別位于第5號(hào)和第12號(hào)染色體上，可解釋12.00%～19.21%的表型變異。Baruah等[18]利用A58/W107構(gòu)建RIL群體，檢測(cè)到3個(gè)芽期耐冷相關(guān)QTL，分別位于1，11，12號(hào)染色體上。

綜上所述，不同學(xué)者對(duì)水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性進(jìn)行的研究，所選擇的遺傳群體、試驗(yàn)方法和鑒定指標(biāo)存在較大差異，定位到的QTL及其表型貢獻(xiàn)率也多有不同，而且很少利用同一群體同時(shí)進(jìn)行發(fā)芽期和芽期耐冷QTL定位。本研究利用耐冷性強(qiáng)的粳稻品種彩稻為母本和耐冷性弱的秈稻品種WD為父本雜交衍生的含有189個(gè)株系的RIL群體為試驗(yàn)材料，結(jié)合高密度遺傳連鎖圖譜，對(duì)發(fā)芽期和芽期耐冷性進(jìn)行QTL分析，以期發(fā)現(xiàn)控制水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性的QTL，從而為水稻耐冷性的遺傳改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究以粳稻品種彩稻為母本、秈稻品種WD為父本雜交衍生的含有189個(gè)株系的RIL群體為試驗(yàn)材料。

1.2 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用試劑盒提取雙親及RIL群體的DNA，將提取的DNA送至博睿迪生物公司進(jìn)行10K Array基因芯片分析，去除冗余標(biāo)記后，把基因型相同且連續(xù)的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記記為一個(gè)Bin標(biāo)記。將與親本彩稻基因型相同的Marker標(biāo)記為“a”，與親本W(wǎng)D基因型相同的Marker標(biāo)記為“b”，將其他基因型的Marker標(biāo)記為“-”，以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用JoinMap 4.0軟件構(gòu)建該RIL群體的遺傳圖譜。

1.3 發(fā)芽期耐冷性鑒定

發(fā)芽期耐冷性鑒定參考李太貴[19]的方法進(jìn)行，并稍加改動(dòng)。將種子放入48 ℃恒溫干燥箱中高溫處理48 h，使其充分干燥并打破休眠。分別選取2個(gè)親本及RIL群體各株系打破休眠后的100粒飽滿種子，放入墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，用1%的次氯酸鈉浸種消毒30 min，用蒸餾水沖洗2～3遍后加入適量蒸餾水，放入13 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。以胚芽鞘的出現(xiàn)作為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[20]，逐日記錄每天發(fā)芽數(shù)，直至連續(xù)3 d發(fā)芽數(shù)為0。同樣數(shù)量的種子，經(jīng)過(guò)相同的處理后，放入26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，作為對(duì)照。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。以相對(duì)發(fā)芽率和處理的平均發(fā)芽天數(shù)作為表型鑒定指標(biāo)[21]。

1.4 芽期耐冷性鑒定

芽期耐冷性鑒定參考韓龍植等[22]的方法進(jìn)行，并稍加改動(dòng)。從親本及RIL群體各株系中分別選取100粒飽滿種子，放于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，待種子芽長(zhǎng)5～8 mm時(shí)選取48粒長(zhǎng)勢(shì)一致的種子放于剪好孔的PCR板中。加入適量蒸餾水后放在3 ℃培養(yǎng)箱中處理10 d，再置于26 ℃光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)正常生長(zhǎng)7 d，調(diào)查成苗率。并按照姜樹(shù)坤等[23]的方法將秧苗的恢復(fù)狀態(tài)劃分為5個(gè)級(jí)別(表1)。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

耐冷級(jí)別=(0×0級(jí)的株數(shù)+1×1級(jí)的株數(shù)+2×2級(jí)的株數(shù)+3×3級(jí)的株數(shù)+4×4級(jí)的株數(shù))/處理的材料總株數(shù)。

表1 芽期耐冷性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Evaluation standard of cold tolerance at bud stage

1.5 QTL分析

運(yùn)用IciMapping 4.2軟件進(jìn)行QTL定位，LOD值≥2.5即認(rèn)為該區(qū)間存在一個(gè)加性QTL，LOD值≥5.0即認(rèn)為該區(qū)間存在一個(gè)上位性QTL，并計(jì)算QTL的加性效應(yīng)、上位性效應(yīng)及表型貢獻(xiàn)率。QTL的命名原則參照McCouch等[24]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

雙親及RIL群體經(jīng)10K芯片分析共得到了3 041個(gè)SNPs，利用IciMapping 4.2的Bin模塊去除冗余標(biāo)記后獲得了978個(gè)Bin標(biāo)記，最終利用JoinMap 4.0構(gòu)建了全長(zhǎng)2 465.33 cM的遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記間距離平均值為2.52 cM(圖1僅展示部分)。其中，9號(hào)染色體上標(biāo)記數(shù)最少(49個(gè))，11號(hào)染色體上標(biāo)記數(shù)最多(140個(gè))。標(biāo)記間平均距離最小值與最大值分別為1.64，4.31 cM，分別位于11號(hào)染色體和3號(hào)染色體上(表2)。

圖中數(shù)據(jù)單位為cM。The data unit in the figure is cM.

表2 染色體標(biāo)記信息Tab.2 The Bin markers locating on chromosome

2.2 發(fā)芽期和芽期耐冷表型分析

耐冷親本彩稻和冷敏親本W(wǎng)D在相對(duì)發(fā)芽率和平均發(fā)芽天數(shù)這2個(gè)發(fā)芽期耐冷相關(guān)性狀以及成苗率和芽期耐冷級(jí)別這2個(gè)芽期耐冷相關(guān)性狀上存在顯著差異。

RIL群體中各株系表型均呈連續(xù)分布，且存在明顯的超親分離現(xiàn)象。其中成苗率的變異系數(shù)最大，為33.02%。正態(tài)分布的適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，除平均發(fā)芽天數(shù)的峰度值>1外，其余性狀的偏度和峰度的絕對(duì)值均<1，表明RIL群體表型數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布，屬于典型的數(shù)量性狀(表3、圖2)。

表3 RIL群體中發(fā)芽期和芽期耐冷表型統(tǒng)計(jì)Tab.3 Trait statistic of germination and bud stage in RIL population

圖2 性狀分布Fig.2 Trait distribution

2.3 發(fā)芽期和芽期耐冷性QTL定位

共檢測(cè)到5個(gè)與發(fā)芽期耐冷相關(guān)的QTL，其中2個(gè)與相對(duì)發(fā)芽率相關(guān)，3個(gè)與平均發(fā)芽天數(shù)相關(guān)?？刂瓢l(fā)芽率的2個(gè)QTL是qLTG3和qLTG8，其LOD值分別為7.07，2.60，可解釋17.17%，7.89%的表型變異，增效等位基因分別來(lái)源于WD和彩稻。與平均發(fā)芽天數(shù)相關(guān)的3個(gè)QTL分別是qMLIT3-1、qMLIT3-2和qMLIT5，可解釋7.76%，7.03%，6.62%的表型變異，qMLIT3-1的增效等位基因來(lái)源于親本彩稻，qMLIT3-2和qMLIT5的增效等位基因來(lái)源于親本W(wǎng)D(表4)。

表4 耐冷相關(guān)的QTLTab.4 QTLs related to cold tolerance

共檢測(cè)到5個(gè)與芽期耐冷相關(guān)的QTL，其中2個(gè)與芽期耐冷級(jí)別相關(guān)，3個(gè)與成苗率相關(guān)。與芽期耐冷級(jí)別相關(guān)的2個(gè)QTL是qCTB1和qCTB3，其LOD值分別為2.92和4.50，表型貢獻(xiàn)率分別為8.45%和10.34%，增效等位基因分別來(lái)源于WD和彩稻。與成苗率相關(guān)的3個(gè)QTL分別是qCTP1-1、qCTP1-2和qCTP3，可解釋的表型變異分別為6.41%，16.17%和10.15%。qCTP1-1與qCTP3的增效等位基因來(lái)源于親本彩稻，qCTP1-2的增效等位基因來(lái)源于親本W(wǎng)D(表4)。

qLTG3、qMLIT3-1、qCTB3、qCTP3位于同一區(qū)間，即這個(gè)區(qū)間與發(fā)芽期和芽期的4個(gè)指標(biāo)均相關(guān)。qCTB1、qCTP1-2和qLTG8未有前人報(bào)道，可能是新發(fā)現(xiàn)的QTL(表4)。

2.4 上位性QTL定位

本研究檢測(cè)到2對(duì)與芽期耐冷相關(guān)的上位性位點(diǎn)，其中芽期耐冷級(jí)別檢測(cè)到1對(duì)上位性位點(diǎn)，存在于3號(hào)染色體的C3_5775496～6680588和9號(hào)染色體的C9_9364678～9568588之間，LOD值為5.70，貢獻(xiàn)率為13.22%，上位性效應(yīng)為-0.23。成苗率檢測(cè)到1對(duì)上位性位點(diǎn)，存在于10號(hào)染色體的C10_13739532～16910523和C10_17164368～18300828之間，LOD值為5.55，貢獻(xiàn)率為39.87%，上位性效應(yīng)為0.19。發(fā)芽期未檢測(cè)到上位性位點(diǎn)(表5)。

表5 水稻芽期耐冷性的上位性位點(diǎn)Tab.5 Epistasis loci of rice cold tolerance at bud stage

3 結(jié)論與討論

低溫冷害貫穿于水稻的各個(gè)生育時(shí)期。作為冷敏感作物，不同時(shí)期的冷害會(huì)對(duì)水稻造成不同的影響，但最終都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量的降低。近年來(lái)，為了提高經(jīng)濟(jì)效益，減少勞動(dòng)成本，直播稻越發(fā)流行。然而，我國(guó)東北地區(qū)氣候寒冷，直播稻常常遭受發(fā)芽期和芽期的低溫，導(dǎo)致種子發(fā)芽時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)芽率下降，成苗率和整齊度降低。因此，研究水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性，對(duì)于穩(wěn)定產(chǎn)量、提高生產(chǎn)力是十分必要的[25]。前人利用不同的作圖群體，對(duì)水稻進(jìn)行了不同時(shí)期的低溫試驗(yàn)，共檢測(cè)到250多個(gè)與低溫相關(guān)的QTL[2]，然而精細(xì)定位的QTL僅有13個(gè)[26]，包括1個(gè)控制發(fā)芽期低溫的qLTG-9[27]，1個(gè)控制發(fā)芽期與苗期低溫的qSV-5c[28]，5個(gè)控制苗期低溫的qCTS4[29]、qCTSS11[30]、qSCT1[31]、qSCT11[31]和qLOP2/q[32]，5個(gè)控制孕穗期低溫的qLTB3[33]、qCTB7[34]、qCTB8[35]、qCT-3-2[36]和qCTB10-2[37]，1個(gè)控制苗期與成熟期低溫的qRC10-2[38]，其中與發(fā)芽期相關(guān)的僅有2個(gè)，與芽期有關(guān)的暫時(shí)還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。因此，挖掘發(fā)芽期和芽期耐冷QTL，對(duì)于耐冷基因挖掘、培育適合直播的水稻品種具有重要意義。

前人大多采用14，15 ℃[39-40]的低溫進(jìn)行發(fā)芽期耐冷試驗(yàn)。為確定親本間差異最明顯的溫度，本研究共設(shè)置了12，13，14 ℃等 3個(gè)溫度梯度，研究表明，14 ℃條件下整個(gè)群體發(fā)芽率普遍極高，差異?。?3 ℃條件下兩親本差異最明顯；12 ℃條件下整個(gè)群體發(fā)芽率都較低，所以本研究最終采用13 ℃作為發(fā)芽期鑒定溫度。在芽期耐冷試驗(yàn)中，前人大多以成苗率為鑒定指標(biāo)，然而該方法無(wú)法對(duì)不同恢復(fù)程度的秧苗進(jìn)行劃分，因此本研究還采用了姜樹(shù)坤等[23]的方法，將不同單株對(duì)耐冷的抗性細(xì)分為5個(gè)級(jí)別，并進(jìn)行加權(quán)計(jì)算。結(jié)合成苗率和抗性分級(jí)的結(jié)果，相互驗(yàn)證定位的QTL。

在發(fā)芽期低溫試驗(yàn)中，共檢測(cè)到5個(gè)相關(guān)的QTL，分別位于第3,5,8號(hào)染色體的C3_799335～1393131、C3_9190945～12803492、C5_3760897～5338999和C8_4706534～5480331區(qū)間。其中，qLTG3和qMLIT3-1位于同一區(qū)間，與王棋等[41]、Fujino等[42]檢測(cè)到與低溫發(fā)芽率相關(guān)的QTL位于相同的區(qū)間，且該區(qū)間包含已克隆基因qLTG-3-1。該基因編碼一個(gè)功能未知的蛋白，在胚中特異性表達(dá)從而調(diào)節(jié)組織的液泡化，進(jìn)而控制水稻的低溫發(fā)芽力。qMLIT3-2位于C3_9190945～12803492區(qū)間，與詹慶才等[43]發(fā)現(xiàn)的控制低溫條件下苗期株高的QTL位置重疊，說(shuō)明該QTL可能在發(fā)芽期和苗期都有所表達(dá)。Jiang等[44]在15 ℃條件下進(jìn)行發(fā)芽期低溫試驗(yàn)，以發(fā)芽率為指標(biāo)，在9～11 d重復(fù)檢測(cè)到qLTG5-3，該區(qū)間包含本研究測(cè)到的qMLIT5。潘招遠(yuǎn)[45]以染色體單片段代換系(SSSL)為試驗(yàn)材料，對(duì)15 ℃下控制水稻低溫發(fā)芽力的QTL進(jìn)行鑒定，并在8號(hào)染色體上鑒定到2個(gè)相關(guān)QTL，物理距離分別為36.5～43.0 cM，82.6～91.7 cM，與本研究檢測(cè)到的qLTG8在同一條染色體上，但并沒(méi)有重合區(qū)間，因此，推測(cè)qLTG8是一個(gè)前人尚未發(fā)現(xiàn)的控制水稻低溫發(fā)芽力的QTL。

在芽期低溫試驗(yàn)中，共檢測(cè)到5個(gè)相關(guān)QTL，分別位于第1，3號(hào)染色體的C1_14622465～15919601、C1_22079910～22491288和C3_799335～1393131區(qū)間。周勇等[46]檢測(cè)到一個(gè)控制苗期耐冷的QTL，位于RM129～RM11356區(qū)間，該區(qū)間包含本研究檢測(cè)到的qCTP1-1，但由于區(qū)間過(guò)大，且檢測(cè)時(shí)期也不同，暫時(shí)無(wú)法確定這2個(gè)QTL之間的關(guān)系。任永梅[26]以回交重組自交系為試驗(yàn)材料，進(jìn)行發(fā)芽期、芽期和苗期的低溫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)QTL簇在3個(gè)時(shí)期不同指標(biāo)間穩(wěn)定表達(dá)，說(shuō)明少數(shù)QTL存在著“一因多效”。本研究芽期檢測(cè)到的qCTB3、qCTP3與發(fā)芽期檢測(cè)到的qLTG3、qMLIT3-1位于同一區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明該QTL在發(fā)芽期和芽期均表達(dá)，并且在同一時(shí)期不同性狀上都有所體現(xiàn)，存在“一因多效”。qCTB1和qCTP1-2位于同一區(qū)間，前人尚未在該區(qū)間發(fā)現(xiàn)芽期耐冷相關(guān)QTL，因此，推測(cè)該位點(diǎn)可能是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的QTL。芽期低溫試驗(yàn)中還檢測(cè)到2對(duì)上位性位點(diǎn)，但與本研究檢測(cè)到的加性位點(diǎn)區(qū)間不一致，可能這幾個(gè)加性位點(diǎn)間并不存在互作。

綜上所述，本研究利用彩稻與WD雜交衍生的RIL群體為試驗(yàn)材料，結(jié)合978個(gè)Bin標(biāo)記進(jìn)行發(fā)芽期與芽期低溫試驗(yàn)。共檢測(cè)到5個(gè)與發(fā)芽期耐冷相關(guān)的QTL，位于3，5，8號(hào)染色體上，可解釋6.62%～17.17%的表型變異，增效等位基因來(lái)自2個(gè)親本。檢測(cè)到與芽期耐冷相關(guān)的5個(gè)QTL，位于1號(hào)和3號(hào)染色體上，可解釋6.41%～16.17%的表型變異，增效等位基因來(lái)自彩稻和WD。qLTG3在發(fā)芽期與芽期試驗(yàn)中均被檢測(cè)到，而且在5個(gè)發(fā)芽期QTL中表型貢獻(xiàn)率最高。qCTP1-2在5個(gè)芽期QTL中表型貢獻(xiàn)率最高。qLTG8、qCTB1和qCTP1-2等3個(gè)QTL未見(jiàn)報(bào)道。