TaRanGAP2在小麥抵抗葉銹菌侵染中的作用

宋姍姍，張欣婷，王 琦，蘆遠景，侯春燕，2，3，王冬梅，2，3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.省部共建華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室，河北 保定 071000；3.河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室，河北 保定 071000)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國重要的糧食作物，保證小麥的產(chǎn)量對于我國糧食安全具有至關(guān)重要的作用。小麥葉銹病是小麥三大銹病之一，在我國小麥的主產(chǎn)區(qū)均有過發(fā)生，其流行年份可使小麥產(chǎn)量減少30%～40%，嚴重危害糧食安全[1]。因此，研究小麥抵抗葉銹病的分子機制，為小麥抗葉銹病育種給予分子水平的指導(dǎo)，對于小麥葉銹病的預(yù)防和治理具有非常重要的意義。

小麥葉銹病是由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)侵染所引起的小麥真菌性病害[2]。在小麥與葉銹菌互作的不親和組合中，葉銹菌吸器母細胞(Haustorium mother cell，HMC)接觸寄主葉肉細胞后會引起葉肉細胞發(fā)生快速死亡，以阻止葉銹菌對寄主的進一步侵染。這種寄主細胞快速死亡的現(xiàn)象被稱為過敏性反應(yīng)(Hypersentive reaction，HR)。HR屬于植物細胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)現(xiàn)象，是生物體在自身生理病理或受到外界不良環(huán)境刺激時，按照一定程序結(jié)束細胞生命的主動防衛(wèi)過程，受到嚴格調(diào)控[3]。

RanGAP2是一個GTPase激活蛋白，可激活細胞內(nèi)非常保守的一類重要小GTPase蛋白Ran，從而參與細胞內(nèi)一系列重要的生物活動，包括有絲分裂過程中著絲粒的形成、核膜形成等[4-5]。RanGAP2還可以通過結(jié)合GTP或者GDP而與不同細胞因子結(jié)合，形成出入細胞核膜內(nèi)外的不同構(gòu)象，幫助細胞內(nèi)大分子在細胞核與細胞質(zhì)之間運輸和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，RanGAP2通過影響NB-LRR蛋白的胞質(zhì)定位發(fā)揮作用，而NB-LRR蛋白的胞質(zhì)定位對于HR的誘發(fā)至關(guān)重要。如馬鈴薯NB-LRR免疫受體Rx僅定位于細胞質(zhì)時可以發(fā)揮免疫功能，RanGAP2可以影響Rx的核質(zhì)分配，從而決定Rx的功能[6]。馬鈴薯NB-LRR蛋白Gpa2能夠識別孢囊線蟲(Globoderapallida)分泌蛋白RBP-1，誘發(fā)HR反應(yīng)，而與Gpa2互作的RanGAP2是Gpa2防御功能所必需的[7]。這些研究說明，RanGAP2在植物防御中也發(fā)揮重要作用。

在分析小麥與葉銹菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，在親和及不親和組合中TaRanGAP2基因的表達具有明顯差異。在此基礎(chǔ)上，對TaRanGAP2基因在小麥抵抗葉銹菌侵染中的表達情況及其抗病分子機制進行了初步研究。證明TaRanGAP2基因在小麥抵抗葉銹菌侵染的寄主過敏性反應(yīng)發(fā)生具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種：小麥近等基因系TcLr26及其輪回親本Tatcher(Tc)。供試菌種：葉銹菌生理小種260。TcLr26和Tc分別與葉銹菌生理小種260組成不親和(TcLr26×260)及親和(Tc×260)組合[8]。供試煙草：本氏煙草。

1.2 試驗方法

1.2.1TaRanGAP2基因編碼蛋白系統(tǒng)進化分析 使用在線軟件PFAM對TaRanGAP2蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析。為了研究小麥TaRanGAP2與其他物種中同源蛋白之間的進化關(guān)系，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BlastP同源比對，利用 MEGA 7軟件對其氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.2.2 小麥與葉銹菌互作過程中TaRanGAP2轉(zhuǎn)錄水平的表達 當TcLr26和Tc小麥幼苗第2片葉生長至1～2 cm，在其第1片葉上接種葉銹菌生理小種260。在接種后0，8，16，24，48，72 h取樣，取樣質(zhì)量為0.1 g，樣品于液氮速凍后提取 RNA。樣品總RNA的提取方法參照UNlQ-10柱式總RNA 抽提試劑盒說明書。以提取的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA，具體方法參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

根據(jù)TaRanGAP2基因序列，使用TB tools軟件設(shè)計特異性結(jié)合引物(表1)，交由通用生物公司合成。以稀釋后的cDNA為模板，檢測TaRanGAP2基因在小麥Tc/TcLr26品種分別接種葉銹菌生理小種260后不同時間點的相對表達量，每個樣品共3個重復(fù)。采用諾唯贊2×ChamQ Universal SYBR Master Mix試劑盒進行RT-qPCR反應(yīng)。以小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 TaRanGAP2亞細胞定位 去除TaRanGAP2基因CDS區(qū)終止密碼子，利用DNAMAN軟件設(shè)計特異性引物(表1)，并添加SalⅠ和SpeⅠ酶切位點。利用PrimeSTAR?GXLDNA Polymerase高保真酶擴增TaRanGAP2基因序列。PCR擴增的TaRanGAP2基因片段長度為1 662 bp，與pSuper1300-GFP載體連接，構(gòu)建pSuper1300-TaRanGAP2-GFP載體。利用熱激法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中，保存菌液[9]。

培養(yǎng)包含pSuper1300-TaRanGAP2-GFP載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液，用侵染液離心洗滌，去除YEB培養(yǎng)基。使用分光光度計調(diào)懸浮菌液的OD600值在0.6～0.8。使用不帶針頭的注射器注射煙草葉片，40～48 h后，取樣，壓片，使用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察TaRanGAP2-GFP蛋白綠色熒光的分布狀態(tài)。

1.2.4 利用VIGS技術(shù)探究TaRanGAP2基因功能 以大麥條紋花葉病毒(Barleystripemosaicvirus，BSMV)為載體構(gòu)建TaRanGAP2的VIGS載體BSMV∶TaRanGAP2。將該載體以及河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室保存的載體α、β、BSMV∶00、BSMV∶PDS進行酶切線性化，并對線性化產(chǎn)物進行純化，以純化產(chǎn)物為模板進行體外轉(zhuǎn)錄RNA病毒，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-80 ℃保存。待TcLr26小麥幼苗第2片真葉生長至1～2 cm時，對其第1片真葉進行病毒轉(zhuǎn)染，選用各體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒組成不同的組合和硅藻土(FES)混勻(表2)，摩擦接種至第1片真葉。選用八氫番茄紅素脫氫酶基因(Phytoene desaturase，PDS)為沉默指示基因，當該基因被沉默13 d左右時，小麥第3片葉出現(xiàn)漂白現(xiàn)象，表明轉(zhuǎn)染試驗操作成功。此時，分別在轉(zhuǎn)染BSMV∶00和BSMV∶TaRanGAP2植株的第3片葉上接種葉銹菌生理小種260。在接種后48，96 h取樣，進行沉默效率檢測和Fluorescent Brightener染色，用熒光顯微鏡觀察葉銹菌發(fā)育和HR面積，采集并保存圖像。

表2 VIGS試驗體系Tab.2 System of VIGS assay

2 結(jié)果與分析

2.1 TaRanGAP2保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進化分析

使用在線軟件PFAM分析發(fā)現(xiàn)，該TaRanGAP2的CDS長度為1 665 bp，編碼554個氨基酸。包含一個WPP 結(jié)構(gòu)域和4個LRR重復(fù)序列(圖1-A)。

A.保守結(jié)構(gòu)域：綠色為WPP保守結(jié)構(gòu)域；紅色區(qū)域表示LRR亮氨酸重復(fù)序列。B.紅色方框內(nèi)為TaRanGAP2。A.Conserved domain：Green area is the conserved domain of WPP；Red area is the LRR leucine repeat sequence.B.TaRanGAP2 is in the red box.

為了研究TaRanGAP2與其他物種中同源蛋白之間的進化關(guān)系，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BlastP同源比對，利用 MEGA 7軟件對其氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，如圖1-B所示，單子葉植物和雙子葉植物分別聚為一類，TaRanGAP2與單子葉植物處于同一分支，而且與大麥同源關(guān)系最近。

2.2 TaRanGAP2在小麥抵抗葉銹菌侵染過程中的表達分析

小麥Tc、TcLr26品種在接種葉銹菌生理小種260后，利用RT-qPCR技術(shù)檢測TaRanGAP2基因在不同時間表達量的變化。結(jié)果表明，在不親和組合(TcLr26×260)中，TaRanGAP2基因的表達量出現(xiàn)顯著上調(diào)，在接種后16 h達到0 h的7.8倍(圖2)。而在親和組合(Tc×260)中，TaRanGAP2基因的表達在接種后8 h只是輕微上調(diào)，為0 h的2.1倍。說明TcLr26中的TaRanGAP2基因?qū)θ~銹菌的侵染具有更加明顯的應(yīng)激表達。

RT-qPCR值是3個獨立試驗數(shù)據(jù)的平均值±標準誤，利用SPSS軟件對其進行差異顯著性分析，由同一字母表示的平均值無顯著差異(P>0.05)。圖4，6同。

2.3 TaRanGAP2定位于細胞質(zhì)

為進一步研究TaRanGAP2在植物細胞內(nèi)的分布情況，利用煙草瞬時表達系統(tǒng)進行TaRanGAP2亞細胞研究。將包含有pSuper1300-TaRanGAP2-GFP重組載體質(zhì)粒和包含pSuper1300-GFP空白對照質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射煙草葉片。48 h后通過CLSM觀察熒光的分布。如圖3所示，TaRanGAP2-GFP熒光分布在細胞質(zhì)中。

圖3 TaRanGAP2亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of TaRanGAP2

2.4 TaRanGAP2基因沉默對小麥抗葉銹菌侵染的影響

待小麥第2片真葉長為1～2 cm時，在第1片真葉上接種體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA病毒。本試驗以BSMV∶PDS為指示組，轉(zhuǎn)染13 d后，觀察發(fā)現(xiàn)PDS沉默植株的第3片葉出現(xiàn)了預(yù)期的漂白現(xiàn)象。同時轉(zhuǎn)染BSMV∶00、BSMV∶TaRanGAP2病毒植株的第3片葉也均出現(xiàn)了BSMV成功侵染的條紋癥狀，表明病毒轉(zhuǎn)染成功(圖4-A)。

當指示組的植株葉片出現(xiàn)漂白現(xiàn)象時，分別在轉(zhuǎn)染BSMV∶00和BSMV∶TaRanGAP2植株的第3片葉上接種葉銹菌生理小種260，在接種48，96 h后分別取樣，利用RT-qPCR技術(shù)檢測該植株TaRanGAP2基因的沉默效率(圖4-B)，以轉(zhuǎn)染BSMV∶00的植株作為對照組，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染BSMV∶TaRanGAP2植株中TaRanGAP2基因相對表達量顯著下降，表明其被有效沉默。

A.轉(zhuǎn)染病毒后13 d葉片表型觀察；B.利用RT-qPCR技術(shù)檢測TaRanGAP2基因沉默效率。A.Observation of leaf phenotype 13 days after virus transfection；B.The detection of TaRanGAP2 gene silencing efficiency by RT-qPCR.

同時將48，96 h取樣的部分小麥葉片樣品進行Fluorescent Brightener染色處理(圖5)，觀察沉默植株葉片的單侵染點吸器母細胞數(shù)量及HR面積。

隨機統(tǒng)計分析了50個單侵染點的HMC數(shù)量(圖6-A)和HR面積(圖6-B)，從統(tǒng)計結(jié)果可以看出，相比對照組植株，TaRanGAP2基因沉默植株的HR面積顯著增大，其HMC數(shù)量也顯著增多；由于小麥葉肉細胞通過形成HR來限制葉銹菌的發(fā)育，因此，推測沉默TaRanGAP2后，HR發(fā)生進程減慢，小麥抗性減弱，無法阻止葉銹菌的生長，進而使HMC數(shù)量增加，導(dǎo)致誘發(fā)更為嚴重的HR，使得HR面積有所增加。

紫外光激發(fā)觀察HMC個數(shù)；藍光激發(fā)觀察HR面積。Number of HMC observed by ultraviolet excitation；HR area observed by blue-light excitation.

A.接菌后單侵染點的HMC數(shù)量統(tǒng)計；B.接菌后單侵染點的HR面積統(tǒng)計。A.Statistics of the number of HMCs at a single infection site after inoculation; B.Statistics of HR area of single infection site after inoculation.

3 結(jié)論與討論

本研究通過分析小麥與葉銹菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，觀察到在親和及不親和組合中TaRanGAP2基因的表達量具有顯著差異。借助RT-qPCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在不親和組合中TaRanGAP2被顯著誘導(dǎo)表達，提示在不親和組合中TaRanGAP2可能與HR的發(fā)生相關(guān)。因此，利用VIGS技術(shù)沉默TcLr26植株的TaRanGAP2基因，在接種葉銹菌后與對照組相比，沉默TaRanGAP2基因的植株葉片單侵染點HR面積顯著增大，HMC數(shù)量顯著增多。

由于小麥葉肉細胞通過形成HR來限制葉銹菌的發(fā)育，因此，推測沉默TaRanGAP2后，HR發(fā)生進程減慢，小麥抗性減弱，無法阻止葉銹菌的生長，進而HMC數(shù)量增加，增加的HMC接觸到寄主細胞又進一步引起死亡，導(dǎo)致誘發(fā)更為嚴重的HR，使得HR面積增大。以上結(jié)果表明，TaRanGAP2在抵抗葉銹菌侵染時發(fā)揮正調(diào)控作用。

研究表明，植物NB-LRR蛋白的亞細胞定位與抗性激活密切相關(guān)，NB-LRR類蛋白的亞細胞排布狀態(tài)，可能決定其不同的作用，如啟動轉(zhuǎn)錄再編程或啟動細胞死亡信號。許多NB-LRR受體包括擬南芥RPS4、SNC1、煙草N、馬鈴薯Rx、大麥MLA10以及水稻Pb1既定位于細胞質(zhì)也定位于細胞核[10]。大麥MLA10的CC結(jié)構(gòu)域存在于細胞質(zhì)時誘導(dǎo)細胞死亡的活性可進一步得到增強，導(dǎo)致HR的發(fā)生[11]，但當其識別病原微生物(如白粉病菌效應(yīng)子A10)被激活時，在細胞核中的積累量明顯增加，參與調(diào)控防御相關(guān)基因的表達[12]。煙草TIR-NB-LRR蛋白N，其自身的LRR區(qū)域可以與細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子互作，進而激活對煙草花葉病毒的抗性[13]，當其結(jié)合核輸出信號時，N在細胞核中的積累消失，檢測到其對煙草花葉病毒的抗性也隨之消失[14-15]。馬鈴薯Rx同樣為核質(zhì)分布，當馬鈴薯X病毒外殼蛋白(PVX-CP)定位于細胞質(zhì)時，Rx發(fā)生激活并引起強烈的HR。RanGAP2可以影響Rx的核質(zhì)分布狀態(tài)[16]，當Rx與RanGAP2共表達時，它們均勻分布在細胞質(zhì)內(nèi)[17-18]。有研究指出，借助基因沉默手段抑制馬鈴薯RanGAP2的表達，會嚴重削弱Rx蛋白對PVX的抗性反應(yīng)[19-20]。本研究將含有pSuper1300-TaRanGAP2-GFP載體的農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片，利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)TaRanGAP2蛋白定位在細胞質(zhì)中。推測TaRanGAP2可能在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮與馬鈴薯RanGAP2類似的作用，還需要進一步篩選TaRanGAP2的互作蛋白進行深入研究。