基于UHPLC-QTOF-MS/MS技術的駱駝蓬化學成分分析及其神經(jīng)保護活性

王寧寧，魏冠華，張智軍，房建國，Mohammad Umar Farooq，Imtiaz Ahmad Qamar，劉映前，楊志剛*

基于UHPLC-QTOF-MS/MS技術的駱駝蓬化學成分分析及其神經(jīng)保護活性

王寧寧1，魏冠華1，張智軍1，房建國2，Mohammad Umar Farooq3，Imtiaz Ahmad Qamar3，劉映前1，楊志剛1*

1. 蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000 2. 蘭州大學化學化工學院，甘肅 蘭州 730000 3. 巴基斯坦農(nóng)業(yè)研究中心，巴基斯坦 伊斯蘭堡

基于UHPLC-QTOF-MS/MS技術對駱駝蓬化學成分進行分析，并探討其神經(jīng)保護活性。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫；體積流量0.3 mL/min；進樣體積2 μL；柱溫35 ℃。質譜系統(tǒng)采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式下檢測。利用過氧化氫（H2O2）和6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導的PC12細胞氧化損傷模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的BV2細胞神經(jīng)炎癥模型，探討駱駝蓬全草和種子的甲醇提取物以及去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿和去甲哈爾滿4種駱駝蓬中主要生物堿的神經(jīng)保護活性。從駱駝蓬中共鑒別32個化學成分，全草中主要含有脫氧鴨嘴花堿、鴨嘴花醇等喹唑酮類生物堿，而種子中主要含有去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿等β-咔啉類生物堿。駱駝蓬全草、種子甲醇提取物和4種生物堿對LPS刺激誘導BV2細胞一氧化氮（NO）生成具有一定的抑制活性，并對H2O2和6-OHDA誘導的PC12細胞損傷均具有明顯的保護作用（＜0.01)。駱駝蓬全草和種子中的生物堿成分存在差異，而且其所含的生物堿類化合物具有一定的神經(jīng)保護作用，為駱駝蓬的質量控制及藥效物質基礎研究提供了參考。

駱駝蓬；UHPLC-QTOF-MS/MS；生物堿；神經(jīng)保護活性；去氫駱駝蓬堿；駱駝蓬堿；哈爾滿；去甲哈爾滿

駱駝蓬L.為蒺藜科駱駝蓬屬多年生草本植物，其味苦、性溫、有毒，在我國西北干旱地區(qū)廣泛分布[1]。駱駝蓬全草和種子在維吾爾族、哈薩克族、蒙古族、藏族的傳統(tǒng)醫(yī)藥中均可入藥，具有祛風止痛、鎮(zhèn)咳平喘、溫身通竅的功效，臨床主治關節(jié)骨痛、筋脈軟弱、偏癱健忘、神昏頭痛、月經(jīng)不調等癥[2]。駱駝蓬在巴基斯坦民間傳統(tǒng)醫(yī)藥中也有應用，主要用于血液凈化、止痛麻醉、促進傷口愈合、糖尿病等[3]。《中國民族藥志》中記載，駱駝蓬能解郁補腦，用于精神郁悶、癱瘓、健忘、癲癇，對神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病具有一定的治療作用[4]。駱駝蓬全草和種子中主要含有β-咔啉和喹唑酮類生物堿成分，且總生物堿是駱駝蓬子改善小鼠學習記憶的有效部位[5]。張曉雙等[6]研究表明駱駝蓬總堿通過下調促凋亡蛋白Bax的表達，上調抑凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達，抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡，從而改善血管性癡呆性大鼠的學習記憶能力。此外，諸多研究表明駱駝蓬屬及其活性生物堿成分對神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛藥理作用，包括鎮(zhèn)痛作用、幻覺作用、興奮作用、神經(jīng)保護作用[7]，以及對膽堿酯酶和單胺氧化酶具有較強的抑制作用[8]。

LC-MS具有分離性能強、選擇性好、靈敏度高的優(yōu)勢，且QTOF獲得的高分辨質譜信息有助于快速檢索以鑒定代謝物，對藥用植物中復雜的微量成分分離分析具有重要的意義[9]。為深入分析駱駝蓬不同部位的生物堿成分和活性差異，本研究首先通過UHPLC- QTOF-MS/MS技術對駱駝蓬全草及種子中的化學成分進行鑒別分析，并通過建立過氧化氫（H2O2）和6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細胞氧化損傷模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小膠質BV2細胞神經(jīng)炎癥模型，用駱駝蓬全草和種子的甲醇提取物，及其去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿4種生物堿干預，探討其神經(jīng)保護活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 6560離子淌度飛行時間質譜儀（美國Agilent公司）；無水甲醇（分析純），天津市富宇精細化工有限公司，甲酸（質譜級）和乙腈（質譜級），德國Merck公司；去離子水，屈臣氏。UHPLC-QTOF-MS分析對照品：去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿（質量分數(shù)≥98%），由蘭州大學藥學院劉映前教授提供。

本實驗所用駱駝蓬全草樣品采集于巴基斯坦和中國甘肅，種子樣品采集于中國新疆，經(jīng)蘭州大學藥學院楊志剛副教授鑒定為蒺藜科駱駝蓬L.的種子及全草，樣品標本（202010001）保存于蘭州大學藥學院。

1.2 駱駝蓬的成分分析

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿各1.00 mg，甲醇溶解后配成10 μg/mL的溶液，用0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 將駱駝蓬全草和種子粉碎后過50目篩，得到粉末樣品；精密稱取各樣品粉末0.20 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇，稱定質量；超聲處理30 min（功率600 W，頻率40 kHz），放冷，再稱定質量，用甲醇補足質量；靜置30 min后取上清液1.5 mL，13 000 r/min離心2 min后，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。剩余樣品溶液濾過，濃縮至干，用DMSO配制成相應的濃度，用于活性測試樣品。

1.2.3 UHPLC-QTOF-MS/MS條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm），流動相由0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）組成。梯度洗脫：0～1 min，3%～5% B；1～3 min，5%～7% B；3～7 min，7%～20% B；7～15 min，20%～40% B；15～22 min，40%～100% B；22～25 min，100% B；25.1～30 min，100% B；體積流量0.3 mL/min；進樣體積2 μL；柱溫35 ℃。

質譜系統(tǒng)采用電噴霧離子源（ESI），QTOF操作模式為Auto MS/MS，掃描范圍/50～1700。ESI源參數(shù)：干燥氣（N2）體積流量10 mL/min；干燥氣溫度225 ℃；霧化氣壓力172 kPa；毛細管電壓3500 V；噴嘴電壓500 V；毛細管出口電壓400 V；碰撞能10、20、40 eV；正離子模式下檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)采集與處理 液質數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Agilent MassHunter（B.08.00，美國安捷倫公司），Profinder（B.08.00，美國安捷倫公司），Mass Profiler Professional（B.14.9，美國安捷倫公司）。

1.2.5 化合物的鑒定 將Agilent MassHunter軟件采集的數(shù)據(jù)導入Profinder軟件進行數(shù)據(jù)預處理，然后用Mass Profiler Professional軟件進行MS數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，對每組樣品化合物出現(xiàn)頻率過濾。根據(jù)精確的相對分子質量，計算化合物可能的元素組成；根據(jù)各成分的相對保留時間、二級特征碎片離子信息、質譜裂解規(guī)律，并結合對照品指認和文獻數(shù)據(jù)及Metlin、MassBank、PubChem等數(shù)據(jù)庫比對二級質譜數(shù)據(jù)，對化合物進行鑒定。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng) BV2細胞和PC12細胞的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)液，在含5% CO2和95%空氣的飽和水培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.3.2 MTT實驗 采用MTT法評估細胞生存率。分別取對數(shù)期生長的PC12、BV2細胞混懸液100 μL接種于96孔板中進行細胞培養(yǎng)。待細胞貼壁后，每孔中加入10、20 μg/mL濃度的藥物樣品（駱駝蓬全草及種子甲醇提取物浸膏及其4種主要的生物堿：去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿）培養(yǎng)24 h，再加入MTT 20 μL培養(yǎng)4 h，加入提取緩沖液（由10%十二烷基硫酸鈉、5%異丁醇、0.1% HCl水溶液組成），孵育過夜。甲瓚結晶充分溶解后，用酶標儀在570 nm下測定吸光度（）。

1.3.3 BV2細胞抗炎活性 通過抑制NO生成實驗評價抗炎活性。待BV2細胞貼壁后，每孔加入LPS（1 μg/mL）誘導神經(jīng)炎癥模型，同時加入不同濃度的藥物樣品培養(yǎng)24 h。取各孔細胞上清培養(yǎng)液50 μL置于96孔板中，加入Griess試劑，混勻后靜置。室溫下避光反應10 min，用酶標儀在570 nm波長處測定。

1.3.4 PC12細胞氧化損傷保護活性 通過檢測細胞活力變化評價藥物對H2O2、6-OHDA誘導的PC12細胞氧化損傷模型的保護作用。PC12細胞貼壁后，每孔加入不同濃度的藥物樣品培養(yǎng)24 h。更換細胞培養(yǎng)液，每孔加入H2O2（終濃度500 μmol/L)、6-OHDA（終濃度200 μmol/L）建立PC12細胞氧化損傷模型。加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔再加入100 μL提取緩沖液，甲瓚結晶充分溶解后于570 nm波長處測定。

2 結果與討論

2.1 化學成分鑒定

駱駝蓬樣品正離子模式下的總離子色譜圖如圖1，所鑒別的化合物見表1。此外，將Agilent Mass Hunter軟件采集一級質譜數(shù)據(jù)導入Profinder軟件，進行數(shù)據(jù)預處理后以cef格式文件導入MPP軟件進行分子特征提取（molecular feature extraction，MFE），得出巴基斯坦、中國甘肅和新疆的駱駝蓬樣品中化學成分數(shù)量，結果見圖2。

a-巴基斯坦和中國甘肅駱駝蓬全草、中國新疆駱駝蓬種子樣品的總離子流圖 b-3個樣品的總離子流圖對比分析圖

表1 駱駝蓬中鑒別的主要化學成分

Table 1 Main compounds in P. harmala

編號化合物名稱分子式tR/min主要二級碎片離子（m/z）[M＋H]+（m/z）檢測歸屬理論值實測值S1S2S3 1駱駝蓬酸C6H11NO30.953128.071 3, 100.076 3, 82.066 2146.081 2146.082 5√√√ 2L-pipecolateC6H11NO21.25084.071 0130.086 3130.086 7√√√ 3indole-3-acetaldehydeC10H9NO2.309132.081 3, 117.057 9160.075 7160.076 0√√√ 4vasicinolC11H12N2O22.838187.087 3, 169.077 7205.097 2205.098 1√√√ 5鴨嘴花堿C11H12N2O3.495161.106 5, 120.044 6, 70.065 9189.102 2189.102 6√√√ 6鴨嘴花醇C11H12N2O3.981171.092 9, 154.066 3, 144.081 3, 118.066 2, 91.055 2189.102 2189.102 6√√√ 7鴨嘴花堿二糖苷C23H32N2O114.491351.154 3, 189.101 5, 171.091 8513.207 9513.208 1√√√ 8鴨嘴花堿糖苷C17H22N2O64.591189.094 3, 171.084 0351.155 1351.157 1√√√ 9pegaharmine IC13H14N2O24.722215.119 5, 188.094 2, 172.097 7, 160.065 1, 144.069 1231.112 6231.112 7√√√ 10luotonin EC19H13N3O24.840301.119 0, 283.104 5, 261.983 4, 231.112 3, 188.090 9316.108 1316.108 5——√ 112-carboxyl-3,4-dihydroquinazolineC9H8N2O24.923149.912 5, 131.060 1, 106.034 6177.065 9177.065 8√√√ 12脫氧鴨嘴花堿C11H12N25.221144.069 7, 118.058 1, 106.067 3, 91.055 1173.107 3173.107 4√√√ 13glycosides vasicinolC18H18N2O36.226205.098 3, 188.073 5, 171.092 1367.151 3367.151√√√ 14脫氧鴨嘴花酮堿C11H10N2O6.301171.090 5, 144.081 0, 118.064 2187.086 6187.086√√√ 15peganumalineFC14H16N2O36.590231.112 1, 188.089 0, 170.079 0261.123 4261.125√√√ 16tetrahydroharmaneC12H14N26.603171.090 3, 144.077 5187.123 0187.124 3√√√ 17鴨嘴花酮堿葡萄糖苷C17H21N2O77.069203.048 3, 185.035 9365.134 3365.134 6√√√ 18鴨嘴花酮堿C11H10N2O27.003185.072 6, 130.066 2203.081 5203.081 8√√√ 19去甲駱駝蓬堿C12H12N2O7.135185.072 6, 160.076 7201.102 2201.103 8√√√ 20二氫路因堿C19H24N2O77.204231.113 7, 215.079 3393.165 6393.166 1√√√ 21路因堿C19H22N2O77.235229.093 3, 214.057 2391.150 0 391.150 6√√√ 22哈爾醇C12H10N2O7.499184.065 9, 181.076 6199.086 6199.087 2√√√ 23去甲哈爾滿C11H8N28.163142.066 1, 115.054 3169.076 0169.075 8√√√ 24去氫駱駝蓬堿氮氧化物C13H12N2O28.342214.074 4, 187.082 6229.097 2229.099 2√√√ 25哈爾滿C12H10N28.824168.078 1, 144.081 4, 115.055 3183.091 7183.092 8√√√ 26dihydroharmaneC12H12N28.874170.084 4, 144.081 5, 130.066 2185.107 3185.108 8——√ 27駱駝蓬堿C13H14N2O9.929200.095 8, 174.092 6215.117 9215.119 4√√√ 28去氫駱駝蓬堿C13H12N2O10.012198.080 2, 170.084 9, 144.080 6213.102 2213.103 6√√√ 293-hydroxylated harmineC13H12N2O210.510215.076 9229.097 2229.098 8√√√ 30脫乙?；橊勁钴誄40H52O2411.072447.133 8, 285.074 8917.292 1917.290 7√√√ 31駱駝蓬苷C42H54O2512.310651.203 5, 447.130 1, 285.076 5959.302 7959.301 9√√√ 32harmalacidineC12H12N2O212.792189.102 2, 162.091 7, 146.063 8, 128.999 5217.097 2217.097 0——√

S1-巴基斯坦全草 S2-中國甘肅全草 S3-中國新疆種子；√表示檢測到該成分 —表示未檢測到該成分

S1-the herbs from Pakistan S2-the herbs from Gansu of China S3-seeds from Xinjiang of China; √detected —not detected

2.1.1 β-咔啉類生物堿結構鑒定 β-咔啉類生物堿是駱駝蓬中最主要的生物堿，包括去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、去甲駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿、哈爾醇等[2]。此類結構母核為吡啶并吲哚類，正離子模式下易發(fā)生母核側鏈CH3（－15）和CO（－28）等中性碎片丟失，母核裂解丟失HCN（－27），丟失C2H4（－28）、丟失NH3（－18）、丟失C2H3N（－41）等[10,16]。

圖2 駱駝蓬全草和種子的化學成分數(shù)量韋恩圖

化合物23、25、27、28的保留時間分別為8.163、8.824、9.929、10.012 min，正離子模式下分別產(chǎn)生/為169.075 8、183.092 8、215.119 4、213.102 2 [M＋H]+的準分子離子峰，和對照品的保留時間、碎片信息及特征峰一致，分別確定為去甲哈爾滿、哈爾滿、駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿。

化合物19、20、21、22和文獻報道[11-12]的準分子離子峰、二級特征質譜數(shù)據(jù)一致，分別推測為去甲駱駝蓬堿、二氫路因堿、路因堿、哈爾醇。

化合物9的保留時間為4.722 min，根據(jù)準分子離子峰/231.112 7 [M＋H]+，推測其分子式為C13H14N2O2，在進一步的質譜裂解中，可以看到有/為198.925 4（－31，-OCH3）、214.119 5（－17，-OH）、188.098 2（－26，-CN）、172.097 7（－16，-NH2）、144.069 1（－28，-C2H4）等二級碎片離子，結合文獻報道[13]，推測其為pegaharmine I。

化合物15的保留時間為6.590 min，根據(jù)準分子離子峰/261.123 7 [M＋H]+，推測其分子式為C14H16N2O3，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為231.112 1（－30，-CH2O)、188.089 0（－43，-CH3CO）、170.0790（－18，-NH3）等，結合文獻獻報道[14]，推測其為peganumaline F。

化合物16的保留時間為6.603 min，根據(jù)準分子離子峰/187.123 1 [M＋H]+，推測其分子式為C12H14N2，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為171.090 3（－16，-NH2）、144.077 5（－27，-CH2CH)，118.065 8（－26，C8H8N+）、106.064 4（C7H8N+）等二級碎片離子，結合文獻報道[15]，推測其為tetrahydro norharmane。

化合物24保留時間為8.342 min，根據(jù)準分子離子峰/229.098 8 [M＋H]+，推測其分子式為C13H12N2O2。進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為214.074 4（－15，-CH3）、187.082 6（－42，-COCH3）等二級碎片離子，結合文獻報道[16]，推測為去氫駱駝蓬堿氮氧化物。

化合物26的保留時間為8.874 min，根據(jù)準分子離子峰/185.108 8 [M＋H]+，推測其分子式為C12H12N2，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為170.084 4（－15，-CH3）、143.073 3（－27，-HCN）等二級碎片離子，結合文獻報道[11]，推測其為dihydroharmane。

化合物32的保留時間為12.792 min，根據(jù)準分子離子峰/217.097 0 [M＋H]+，推測其分子式為C12H12N2O2，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為189.102 2（－28，-CO）、162.091 7（－27，-HCN）、146.063 8（－16，-NH2）、128.999 5（－18，-H2O）等二級碎片離子，結合文獻報道[17]，推測其為harmalacidine。

2.1.2 喹唑酮類生物堿結構鑒定 喹唑酮類生物堿是駱駝蓬全草及種子中另一類重要的生物堿，如鴨嘴花堿（vasicine）、去氧鴨嘴花堿（deoxypeganine）、鴨嘴花堿酮（vasicinone）、去氧鴨嘴花堿酮（deoxyvasicinone）、駱駝寧堿等[2]。

化合物4的保留時間為2.838 min，根據(jù)準分子離子峰/205.098 1 [M＋H]+，推測其分子式為C11H12N2O2，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為187.084 3（－18，-H2O）等二級碎片離子，結合文獻報道[13]，推測其為vasicinol。

化合物5和6保留時間為3.945 min和3.981 min，正離子模式下首先產(chǎn)生/189.103 0 [M＋H]+準分子離子峰，推測其分子式為C11H12N2O，對母離子進行碰撞誘導解離產(chǎn)生/為171.092 9（－18，-H2O），144.081 2（C10H10N+），118.066 2（C8H8N+），91.055 2（C7H7+）等二級碎片離子，化合物5與文獻報道數(shù)據(jù)一致[18]，推測其可能為鴨嘴花堿，而6為鴨嘴花醇。

化合物7的保留時間為4.491 min，根據(jù)準分子離子峰/513.208 1 [M＋H]+，推測其分子式為C29H42N2O16，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生丟失1分子葡萄糖/為351.154 3（－162，-Glu）的離子碎片，再丟失1分子葡萄糖/為189.101 5（－162，-Glu）的二級碎片離子，結合文獻報道[19]，推測其為二糖苷鴨嘴花堿，但糖具體的連接位置通過質譜尚無法確定。

化合物8的保留時間為4.591 min，根據(jù)準分子離子峰/351.147 1 [M＋H]+，推測其分子式為C17H22N2O6，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為189.094 3（－162，-Glu），[M＋H－Glu－H2O]+171.084 0（－18，-H2O）等二級碎片離子，結合文獻報道[19]，推測其為鴨嘴花堿糖苷。

化合物10的保留時間為4.840 min，根據(jù)準分子離子峰/316.128 5 [M＋H]+，推測其分子式為C19H13N3O2，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為301.119 0（－15，-CH3），283.104 5（－18，-H2O），261.983 4（－55，-C4H7），231.112 3（－30，-NH2CH2），188.090 9（－128，-C8H2NO）等二級碎片離子，結合文獻報道[19]，推測其為luotonin E。

化合物11的保留時間為4.923 min，根據(jù)準分子離子峰/177.065 8 [M＋H]+，推測其分子式為C9H8N2O2，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為149.912 5（－28，-CO），131.060 1（－18，-H2O），106.034 6（－43，-CH3CO）等二級碎片離子，結合文獻報道[21]，推測其為2-carboxyl-3,4-dihydroquinazoline。

化合物17的保留時間為7.069 min，根據(jù)準分子離子峰/365.111 4 [M＋H]+，推測其分子式C17H21N2O7，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為203.048 3（－162，-Glu），185.035 9（－18，-H2O）等二級碎片離子，結合文獻[19,21]，推測其為鴨嘴花酮堿葡萄糖苷。

化合物12、14、18和文獻報道[10]的準分子離子峰、二級特征質譜數(shù)據(jù)一致，推測為脫氧鴨嘴花堿、脫氧鴨嘴花酮堿、鴨嘴花酮堿。

2.1.3 其他 化合物1和文獻報道[16]準分子離子峰、二級特征質譜數(shù)據(jù)一致，推測其為駱駝蓬酸。

化合物2的保留時間為1.400 min，根據(jù)準分子離子峰/130.086 7 [M＋H]+，推測其分子式為C6H11NO2，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為112.063 7（－18，-H2O）二級碎片離子，通過比對MassBank數(shù)據(jù)庫，推測其為-pipecolate。

化合物3的保留時間為2.181 min，根據(jù)準分子離子峰/160.076 0 [M＋H]+, 推測其分子式為C10H9NO，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為132.081 3（－28，-CO），117.057 9（－15，-CH3）等二級碎片離子，通過比對MassBank數(shù)據(jù)庫，推測其為indole-3-acetaldehyde。

化合物13的保留時間為6.226 min，根據(jù)準分子離子峰/367.151 0 [M＋H]+，推測其分子式為C18H18N6O3，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為205.098 3（－162，-Glu）碎片離子，結合文獻報道[21]，推測其為glycosides vasicinol。

化合物30的保留時間為11.072 min，根據(jù)準分子離子峰/917.295 9 [M＋H]+，推測其分子式為C40H52O24，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為447.133 8，285.074 8二級碎片離子，結合文獻報道[16,20]，推測其可能為脫乙?；橊勁钴?。

化合物31的保留時間為12.312 min，根據(jù)準分子離子峰/959.307 7 [M＋H]+，推測其分子式為C42H54O25，進一步的質譜裂解中產(chǎn)生/為651.203 5，447.130 1，285.076 5等二級碎片離子，結合文獻報道[16]，推測其可能為駱駝蓬苷。

從表1和圖1中可以看出，-pipecolate、indole-3-acetaldehyde首次在駱駝蓬中檢測發(fā)現(xiàn)，luotonin E、dihydroharmane、harmalacidine僅在種子中發(fā)現(xiàn)，巴基斯坦和中國產(chǎn)駱駝蓬全草，以及全草和種子間的成分差異較大，鴨嘴花堿、鴨嘴花醇、脫氧鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿、駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、脫乙酰基駱駝蓬苷、駱駝蓬苷等生物堿的含量差異較大。此外，從駱駝蓬全草和種子的化學成分韋恩圖（圖2）中可以看出，巴基斯坦產(chǎn)地和中國甘肅產(chǎn)駱駝蓬全草，以及中國新疆產(chǎn)駱駝蓬種子中的特有的代謝產(chǎn)物數(shù)量分別為183、171和229，而3者共有的代謝物數(shù)量是70，進一步說明不同部位、不同產(chǎn)地駱駝蓬成分差異較大。根據(jù)二級質譜數(shù)據(jù)對3個產(chǎn)地樣品的化學成分進行鑒別，已鑒別出的32個化合物的詳細信息見表1。中國和巴基斯坦在駱駝蓬全草傳統(tǒng)藥效的應用上有差異，不同部位的應用也有差異[21]，可能和這些生物堿類有效成分的種類和含量相關，但仍需要擴大樣本量深入探討其藥效物質成分-生物活性-作用機制之間的關聯(lián)。

2.2 細胞活性實驗結果

2.2.1 BV2細胞活性結果 BV2細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的免疫細胞，炎癥反應在神經(jīng)退行性疾病進程中發(fā)揮重要作用[22-23]。BV2細胞存活率結果顯示（圖3-a），與空白組相比，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、去甲哈爾滿、種子總浸膏在10、20 μg/mL時，對BV2細胞均無明顯的損傷作用；哈爾滿和全草總浸膏在20 μg/mL時，BV2細胞存活率下降，有明顯的損傷作用。LPS作用于BV2細胞后NO的釋放量會增加，所有樣品對LPS誘導的BV2細胞表現(xiàn)出一定的濃度依賴性抑制炎癥相關因子NO釋放（圖-3b）。

2.2.2 PC12細胞活性結果 PC12細胞常用于研究多巴胺能神經(jīng)元病理和藥理作用，神經(jīng)毒素6-OHDA和H2O2可誘導PC12細胞氧化應激凋亡，可用于模擬誘導帕金森病[24]。PC12細胞MTT活性結果如圖4-a所示，與空白組相比，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、去甲哈爾滿、種子總浸膏和全草總浸膏在10、20 μg/mL時，對PC12細胞均無明顯的損傷作用，哈爾滿則對PC12細胞有較為明顯的損傷作用。不同樣品對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷結果如圖4-b所示，與H2O2誘導組相比，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、去甲哈爾滿、種子總浸膏和全草總浸膏在20 μg/mL質量濃度下，對H2O2誘導的PC12細胞均具有明顯保護作用（＜0.01)。不同樣品對6-OHDA誘導的PC12細胞氧化損傷結果如圖4-c所示，與6-OHDA模型組相比，去氫駱駝蓬堿、種子總浸膏和全草總浸膏在20 μg/mL下，對6-OHDA誘導的氧化損傷的PC12細胞均具有明顯的保護作用（＜0.01)。

與空白組比較：*P＜0.05

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與H2O2或6-OHDA誘導組比較：ΔΔP＜0.01

3 討論

本研究采用UHPLC-QTOF-MS/MS技術，對駱駝蓬不同部位全草、種子的甲醇提取物分別進行了正、負離子模式的質譜掃描，結果發(fā)現(xiàn)，其中主要的生物堿類化學成分在正離子模式下的響應優(yōu)于負離子模式，篩選的化合物數(shù)量更多，故主要對正離子模式下采集的二級質譜數(shù)據(jù)中化合物成分進行了分析。從駱駝蓬樣品中共鑒別出32個化學成分，巴基斯坦和中國產(chǎn)駱駝蓬全草，以及駱駝蓬全草和種子間的成分存在差異。全草中主要含鴨嘴花醇、脫氧鴨嘴花堿等喹唑酮類生物堿，而種子中主要含有去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿等β-咔啉類生物堿，這與文獻報道一致[25]。結果證實駱駝蓬提取物及部分β-咔啉類化合物在細胞水平上具有一定的神經(jīng)保護活性。但也有研究表明β-咔啉類生物堿對PC12細胞能夠產(chǎn)生細胞毒作用，且其細胞毒性作用機制與2、9位的甲基化具有一定的相關性[26]。駱駝蓬種子提取物、駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及去甲哈爾滿對LPS誘導的BV2細胞炎癥因子NO的生成具有抑制作用，但是哈爾滿和全草總浸膏在20 μg/mL有一定的細胞毒性。張曉雙等[27]研究表明駱駝蓬總生物堿可通過上調海馬突觸素（synaptophysin，syn）、微管相關蛋白-2（microtubule-associated protein-2，MAP-2）蛋白表達，并且抑制一氧化氮合酶活性，改善血管癡呆性大鼠的學習記憶能力。

本研究建立的駱駝蓬化學成分分析的液質方法，有助于了解駱駝蓬不同藥用部位生物活性成分及其神經(jīng)保護活性。然而，由于種子中2種主要的生物堿駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的含量較高且結構相近, 通過優(yōu)化梯度條件、改變柱溫等而未能將其分開。此外，駱駝蓬具有神經(jīng)保護活性和神經(jīng)毒性更深層次的機制仍需通過更多的實驗進一步論證。綜上所述，本研究為駱駝蓬的質量控制及藥效物質基礎研究提供了一定的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents inbased on UHPLC-QTOF-MS/MS and its neuroprotective activities

WANG Ning-ning1, WEI Guan-hua1, ZHANG Zhi-jun1, FANG Jian-guo2, Mohammad Umar Farooq3, Imtiaz Ahmad Qamar3, LIU Ying-qian1, YANG Zhi-gang1

1. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 3. Pakistan National Agricultural Research Center, Islamabad , Pakistan

To analyze the chemical constituents ofbased on UHPLC-QTOF-MS/MS and explore its possible neuroprotective activities.The chromatographic column was ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1mm, 1.6 μm). The mobile phase consisted of 0.1% formic acid aqueous solution (A) and 0.1% formic acid acetonitrile solution (B), followed by gradient elution. Volume flow was 0.3 mL/min; The injection volume was 2 μL. Column temperature was 35 ℃. The mass spectrometry system used electrospray ion source (ESI), which was detected in positive ion mode. Then, the oxidative damage model induced by H2O2and 6-OHDA in PC12 cells and the BV2 neuroinflammation model induced by LPS were established. The extracts of the aerial parts and seeds of, and the four main alkaloids of harmine, harmaline, harman and norharman, were investigated on their neuroprotective activities.A total of 32 chemical constituents were identified from. The aerial parts mainly contained quinazolone alkaloids, such as peganol and deoxypeganine, while the seeds mainly contained β-carboline alkiods, such as harmine and harmaline. The methanol extracts from the aerial parts, seeds and four main alkaloids showed certain inhibitory activity on NO production in BV2 cells stimulated by LPS. They also had obvious protective effects on PC12 cells induced by H2O2and 6-OHDA (< 0.01).The alkaloid components in the aerial parts and the seeds are quite different, and the alkaloid compounds have certain neuroprotective effects. This study provides some reference for the quality control and the basic research of pharmacological substances of.

L.; UHPLC-QTOF-MS/MS; alkaloids; neuroprotective activity; harmine; harmaline; harman; norharman

R284.1

A

0253 - 2670(2022)06 - 1688 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.011

2021-11-23

國家重點研發(fā)計劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點專項（2016YFE0129000）；甘肅省重點研發(fā)計劃（18YF1WA115）；甘肅省自然科學基金項目（20JR5RA311）

王寧寧（1996—），女，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質基礎及代謝組學研究。Tel:18095859563 E-mail: wangnn19@lzu.edu.cn

楊志剛，副教授，主要從事中藥藥效物質基礎及代謝組學研究。Tel: (0931)8915202 E-mail: yangzg@lzu.edu.cn

[責任編輯 王文倩]