多菌靈降解菌的構(gòu)建及對煙葉殘留降解效果評價

陳芊如 余佳敏 胡希好 茍春苗 丁蓬勃 荊常亮 楊英杰 李斌 李義強

摘 ?要：為控制煙葉中多菌靈農(nóng)藥殘留，利用降解酶基因質(zhì)粒載體克隆技術(shù)，合成構(gòu)建了對多菌靈具有較好降解效果的菌株MBC2019，并進一步篩選優(yōu)化了其發(fā)酵條件和最佳濃度，研究了降解菌在煙葉種植、烘烤和打葉復(fù)烤階段對煙葉多菌靈農(nóng)藥殘留降解的效果。結(jié)果表明，降解菌的最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃，最適培養(yǎng)pH為7.0，最優(yōu)接種濃度為3.00%。種植階段，噴施多菌靈和降解菌后3～7 d，未噴施降解菌煙葉中農(nóng)藥殘留降解速度快于降解菌處理，14 d后降解菌的促進效果開始顯現(xiàn)，未使用降解菌的降解率為96.55%，使用降解菌的降解率提高到99.58%;在烘烤和打葉復(fù)烤階段，未使用降解菌的煙葉中多菌靈降解較慢，120 h降解率為8.07%和8.05%，噴施降解菌后，同期降解率分別達到77.97%和45.08%。因此該降解菌可用于煙葉種植，特別是烘烤和打葉復(fù)烤等階段的多菌靈農(nóng)藥殘留降解，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：多菌靈;農(nóng)藥殘留;煙葉種植;烘烤;打葉復(fù)烤;微生物降解

Abstract： In order to control carbendazim pesticide residues in tobacco leaves， the strain MBC2019 with good degradation effect on carbendazim was synthesized and constructed by using the cloning technology of degradation enzyme gene plasmid vector. The fermentation conditions and optimal concentration were screened and optimized， and the degradation effects of carbendazim pesticide residues in tobacco leaves during planting and curing and redrying were evaluated. The results were as follows： the degradation bacteria was successfully synthesized and constructed， the optimal culture temperature was 28 ℃ and pH was 7.0， and the best inoculation concentration was 3.00%. In the field conditions， the pesticide residues in tobacco leaves were degraded rapidly due to photolysis， growth dilution， microbial degradation and other factors in 3-7 days. The degradation-promoting effect of degrading bacteria began to appear 14 days later. At this point， the degradation rates were 96.55% without application and 99.58% with application in tobacco leaves. During curing and redrying stages， the carbendazim degradation rates were 8.07% and 8.05% without application， differing from the degradation rates of 77.97% and 45.08% with application at 120 h. The degradation bacteria could be used to degrade carbendazim residues in tobacco leaves at different stages， especially at the curing and redrying stages， which showed a good application prospect.

Keywords： carbendazim; pesticide residues; tobacco planting; curing; redrying; microbial degradation

多菌靈作為一種內(nèi)吸性殺菌劑，具有高效、低毒、廣譜的特點，對農(nóng)作物的白粉病、根黑腐病、赤星病等[1]有較好的防治效果，在農(nóng)作物生產(chǎn)中使用普遍，煙葉樣品中多菌靈農(nóng)藥殘留檢出率高，對煙葉的品質(zhì)與安全有較大影響[2]。目前煙葉中多菌靈農(nóng)藥殘留量限量值為2 mg/kg，被作為一類風(fēng)險農(nóng)藥管理[3]。為進一步明確多菌靈農(nóng)藥殘留的形成機理與降解對策，國內(nèi)外專家針對煙葉中多菌靈殘留展開了一系列研究[4]，明確了其在煙葉凍干、殺青過程中的降解規(guī)律和有效降解方式。由于微生物降解范圍廣、代謝方式豐富多樣，通過篩選農(nóng)藥降解微生物來降低煙葉中的農(nóng)藥殘留，是一種成本低廉、無毒無害的方法[7]。目前，已經(jīng)報道的多菌靈降解菌有紅球菌屬（Rhodococcus）[6]、芽孢桿菌屬（Bacillus）[8]、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia），以及假單胞菌屬（Pseudomonas）[9]等。然而天然菌株代謝產(chǎn)物復(fù)雜多樣，可能對環(huán)境及人畜安全造成威脅，且培養(yǎng)條件復(fù)雜、生長較慢，容易導(dǎo)致產(chǎn)酶不足、降解效果不佳等問題。為了解決以上問題，本研究將特異性多菌靈降解酶基因與遺傳背景清楚、安全無威脅、不具備多菌靈降解功能的天然菌株相結(jié)合，利用基因質(zhì)粒載體克隆技術(shù)進行多菌靈降解工程菌的構(gòu)建，并進一步優(yōu)化了其培養(yǎng)條件，開展了在煙葉種植階段、烘烤階段和打葉復(fù)烤階段，降解菌對煙葉中多菌靈降解效果的研究評價，為開發(fā)降解烤煙中多菌靈的微生物菌劑提供技術(shù)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

本試驗于2020年7—10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗基地和四川煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司進行。供試烤煙品種為云煙97。供試基因序列KX698097、質(zhì)粒pUC57、質(zhì)粒pHT43、枯草芽孢桿菌WB800N，均來自青島蔚藍生物股份有限公司。供試農(nóng)藥為50%多菌靈可濕性粉劑，購自江蘇省江陰市農(nóng)藥二廠有限公司。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?多菌靈降解菌的構(gòu)建與鑒定 ?以多菌靈降解菌Mycobacterium sp. SD-4[10]為基礎(chǔ)，針對降解酶基因KX698097進行密碼子優(yōu)化，合成適宜在芽孢桿菌中表達的基因，將合成后的基因克隆到pUC57（2.7 kb）質(zhì)粒載體中，再利用枯草芽孢桿菌WB800N和新的質(zhì)粒pHT43進行克隆表達，篩選符合要求的菌株，并進行形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定。構(gòu)建的菌株最終命名為MBC2019。

1.2.2 ?降解菌培養(yǎng)條件優(yōu)化 ?（1）降解菌母液的制備：配制LB液體培養(yǎng)基，接種MBC2019單菌落，于28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即為降解菌母液。（2）降解菌最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化：將母液分別接種到新的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為3.00%（V/V，下同），按上述條件培養(yǎng)36 h后，以菌株生長量OD600值為指標(biāo)，分別測定不同溫度（10、15、20、25、28、30、35、42 ℃）及不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對菌株MBC2019生長的影響。

1.2.3 ?MBC2019菌液對多菌靈殘留最佳降解濃度試驗 ?在50 mL離心管中，加入含有多菌靈殘留的烤后煙葉，加水稀釋，取適量降解菌母液，建立5.00 mg/L農(nóng)藥和不同接種量（0.50%、1.00%、3.00%和10.00%）的降解菌液反應(yīng)體系，混勻后靜置培養(yǎng)。并于2、6、12、24、48、72 h后，取樣測定多菌靈殘留量，評價降解效果。

1.2.4 ?MBC2019菌液對不同階段煙葉中多菌靈殘留降解試驗 ?MBC2019降解菌母液以3.00%的接種量用清水稀釋，備用。多菌靈在常規(guī)作物中登記用量為1125～1500 g a.i./hm2[11]，按照農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則要求，試驗劑量采用登記的最高劑量[12]。選擇進入采烤期且生長整齊一致的煙株，按照多菌靈有效成分1500 g a.i./hm2用量進行葉面噴霧施藥。

（1）煙葉種植階段：在煙草現(xiàn)蕾期—成熟期進行施藥[13]，施藥后3 h，葉片上均勻噴灑3.00%的MBC2019菌液，以在葉片上噴施等量清水作為對照。噴施菌液后1、3、5、7、14、21、30 d，采集鮮煙葉樣品0.5 kg左右，剔除主脈，切碎葉片混勻，四分法縮分為200 g，裝入自封袋中，?20 ℃保存，待測。

（2）煙葉烘烤階段：在煙草成熟期田間噴施降解菌5 d后，采集使用降解菌和未使用降解菌的煙葉樣品，每個樣品采樣點不少于12個（葉片不少于50片）。采用三段式烘烤工藝（不超過68 ℃）烘烤，分別在不同時間（24、48、72、96和120 h）取樣，于烘箱內(nèi)65 ℃烘干后去除主脈，研磨后縮分取200 g，?20 ℃保存，待測。

（3）煙葉打葉復(fù)烤階段：用經(jīng)檢測確認不含多菌靈的烤后煙葉1 kg，煙葉表面噴施多菌靈農(nóng)藥并充分混勻，經(jīng)檢測煙葉中多菌靈殘留量為5 mg/kg。一半樣品噴施降解菌，另一半樣品噴施清水作為對照，按照溫度80 ℃、回潮混合水30%的復(fù)烤工藝[14]進行復(fù)烤，復(fù)烤后煙葉打包捆扎，存于紙箱內(nèi)，并于烤后不同時間（24、48、72、96和120 h）取樣，于烘箱內(nèi)65 ℃烘干后研磨均勻，縮分后取200 g，?20 ℃保存，待測。

1.3 ?農(nóng)藥殘留檢測方法

1.3.1 ?提取凈化和農(nóng)藥殘留檢測 ?參考李義強等[4]的方法，優(yōu)化形成了QuEchERS前處理與HPLC-MS/MS檢測相結(jié)合的煙葉中農(nóng)藥殘留量測定方法，通過0.01、0.1和2 mg/kg 3個水平的添加回收率，驗證方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.3.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線、添加回收試驗 ?參考文獻[15]方法。

1.4 ?數(shù)據(jù)分析

圖表中的數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示（n=3）;各處理之間的差異顯著性分析采用鄧肯法，顯著水平為p≤0.05。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?多菌靈降解菌的構(gòu)建、鑒定與培養(yǎng)條件優(yōu)化

利用人工合成DNA技術(shù)，以多菌靈降解酶基因KX698097為模板，合成適宜在芽孢桿菌中表達的基因，并克隆到pUC57質(zhì)粒載體中，利用引物djlF（AAGGATCCATGGCCAACTTCGT）和djlR（AATGGTGGTGGTAACTAGATCT）擴增得到片段，通過限制性酶切位點BamHI和XbaI連接克隆到表達載體pHT43中（圖1），經(jīng)測序確認序列無誤后，電轉(zhuǎn)到枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵表達。最終利用枯草芽孢桿菌WB800N進行異源表達。

構(gòu)建多菌靈降解菌后，進一步開展大規(guī)模發(fā)酵，對枯草芽孢桿菌WB800N表達系統(tǒng)進行培養(yǎng)條件優(yōu)化。該菌株在LB平板上的菌落形態(tài)為奶白色、表面光滑、不透明、較為粘稠（圖2），根據(jù)菌株的形態(tài)特征和16S rDNA基因序列Blast比對分析，最終菌株鑒定為Bacillus subtilis，并將其命名為MBC2019（現(xiàn)保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC18631）。

菌株MBC2019的培養(yǎng)溫度與pH對其生長的影響如圖3所示，在15～42 ℃之間，隨著溫度的升高，菌株MBC2019生長呈先上升后下降趨勢，生長勢頂點溫度是28 ℃;當(dāng)培養(yǎng)液的pH為6～8時，菌株MBC2019的生長近乎不受影響。通過上述篩選試驗，選定菌株MBC2019的培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)pH為7.0。利用該條件培養(yǎng)菌株MBC2019并制備大量降解菌液，進行后續(xù)多菌靈農(nóng)藥殘留降解試驗。

2.2 ?MBC2019菌液降解多菌靈殘留的最佳濃度篩選

MBC2019菌液濃度對多菌靈殘留降解效果如圖4所示，按照1.2.3方法所述，建立反應(yīng)體系，在反應(yīng)體系培養(yǎng)的前12 h內(nèi)，接種量為10.00%的處理效果最佳。當(dāng)處理時間大于24 h，MBC2019菌液接種濃度為3.00%時，多菌靈降解率均為最高，說明3.00%接種濃度的菌液降解效率穩(wěn)定且效果最佳。因此，在后續(xù)試驗中，選擇3.00%的接種濃度進一步開展煙葉種植、烘烤和打葉復(fù)烤階段多菌靈降解效果試驗。

2.3 ?MBC2019菌液對不同階段煙葉多菌靈殘留降解的影響

2.3.1 ?煙葉種植階段 ?如圖5所示，試驗前期3～7 d內(nèi)，由于降解菌定殖過程對其自然降解存在干擾，未使用降解菌的煙葉中多菌靈殘留降解較快。然而隨著處理時間的延長，MBC2019處理效果逐步顯現(xiàn)，14 d后，使用降解菌的處理降解率可達99.58%，顯著高于未使用降解菌的處理（96.55%）;因此在煙葉種植階段，噴施MBC2019菌液一段時間后對煙葉中多菌靈殘留的降解有明顯促進作用。

2.3.2 ?煙葉烘烤階段 ?如圖6所示，在煙葉烘烤過程中，未使用MBC2019時多菌靈降解緩慢，降解率較低，120 h時多菌靈殘留降解率僅為8.07%;使用降解菌后，多菌靈降解速率加快，在24 h時降解率已顯著高于未使用降解菌處理，120 h時，噴施MBC2019煙葉中多菌靈的降解率可達77.97%，與未使用降解菌的煙葉相比，多菌靈降解率提高了9倍以上。表明MBC2019可以顯著促進烘烤煙葉中多菌靈殘留的降解。

2.3.3 ?煙葉打葉復(fù)烤階段 ?如圖7所示，在打葉復(fù)烤過程中，未使用MBC2019降解菌時多菌靈降解緩慢，120 h時多菌靈殘留降解率為8.05%;使用降解菌后，多菌靈殘留降解速度加快，在復(fù)烤后24 h時降解率顯著高于未使用降解菌的處理;在復(fù)烤后120 h時，使用降解菌處理的煙葉中，多菌靈的降解率達45.08%。表明在打葉復(fù)烤前噴施MBC2019可以顯著降低復(fù)烤后煙葉中多菌靈的殘留量。

3 ?討 ?論

本試驗以多菌靈降解酶基因KX698097為基礎(chǔ)，合成適宜于芽孢桿菌中表達的基因，最終成功轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB800N中并表達，得到了高效降解多菌靈的微生物菌株MBC2019，該菌最佳生長溫度為28 ℃，最佳培養(yǎng)pH 7.0。按照不同濃度使用后，在0～72 h內(nèi)對多菌靈的降解效果差異明顯，其中，12 h內(nèi)，10%接種量的菌液降解效果最佳，24 h以后，3.00%接種量菌液降解效果最佳，在72 h達到峰值，其降解率高達92.32%。

MBC2019菌液對煙葉種植階段煙葉中多菌靈殘留降解結(jié)果顯示，14 d后，田間多菌靈殘留的降解率表現(xiàn)為使用降解菌顯著高于未使用降解菌;而3～7 d內(nèi)的結(jié)果則與之相反，推測原因可能有兩種，一是由于溫度、濕度和光照等外部條件影響，植物體內(nèi)的酶對葉片表面及葉肉組織中的農(nóng)藥殘留可以明顯降解[16];二是由于田間環(huán)境多變且復(fù)雜，MBC2019需要一定時間適應(yīng)環(huán)境，同時煙葉表面存在其他微生物，而噴施MBC2019菌液后干擾了其他微生物的代謝，同時也抑制了光解和風(fēng)逸散等效果[17]，導(dǎo)致降解速率減緩。

烘烤和打葉復(fù)烤階段的多菌靈降解率較低，這是因為烘烤和復(fù)烤期間的農(nóng)藥降解往往是微生物和物理性作用的共同結(jié)果，由于多菌靈是內(nèi)吸性殺菌劑，因而對微生物降解作用不利[18]，同時煙葉烘烤過程水分大量散失，會干擾微生物的作用，煙葉中的農(nóng)藥殘留降解會受到較大程度的抑制[19]，由此造成了烘烤和復(fù)烤期間多菌靈降解緩慢的結(jié)果。試驗結(jié)果顯示，烘烤前使用MBC2019降解菌可以顯著提高烘烤過程中多菌靈殘留的降解率，促進降解效率可達9倍以上。尤其是烘烤前期促進多菌靈降解的效果明顯提升，這是由于在烘烤過程中，前期以高溫高濕為主，煙葉處于變黃期和定色前期，降解菌的活性較高，對農(nóng)藥降解較快[20];而在烘烤中后期高溫和低濕條件使微生物徹底失活[19]。在打葉復(fù)烤階段，噴施降解菌液后，對煙葉中多菌靈的降解有一定的促進作用，但與前兩個階段相比有所放緩，可能與復(fù)烤前期煙葉失水，降解菌活性不能充分發(fā)揮有關(guān)[21]，但相比未使用降解菌的煙葉，使用降解菌后煙葉中多菌靈的降解率顯著提升。

綜上所述，在煙葉種植階段，由于光解、自然降解、生長稀釋等多種因素影響，多菌靈農(nóng)藥殘留在自然狀態(tài)下降解較快。雖然施用MBC2019降解菌，但前14 d的效果不及自然降解效果明顯，14 d后，降解菌的促進降解作用開始顯現(xiàn)。與未施用降解菌的處理相比，降解菌在烘烤階段和打葉復(fù)烤階段，表現(xiàn)出較強的促進降解活性，大大加速了多菌靈的降解[18]。根據(jù)本研究結(jié)果，煙葉種植階段施用降解菌，要早于采烤前14 d施用才能發(fā)揮其效果;烘烤和打葉復(fù)烤階段，只要施用降解菌即可發(fā)揮其降解效果促進煙葉中的多菌靈降解，提升煙葉安全性。

4 ?結(jié) ?論

本研究開發(fā)了一株可以顯著降解多菌靈農(nóng)藥殘留的枯草芽孢桿菌MBC2019，該菌最佳生長溫度為28 ℃，最佳培養(yǎng)pH 7.0。以3.00%的稀釋比例制備的菌液降解效率穩(wěn)定且效果最佳。該降解菌在煙葉采烤前14 d和打葉復(fù)烤前噴施，對多菌靈殘留均有顯著促進降解的效果。

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