殺菌劑與無致病力煙草青枯菌對(duì)噬菌體存活的影響

崔曉東 王伊玲 李紅霞 李小勇 蘇鵬飛 潘瑞朋 劉瓊光 胡蓉花

摘 ?要：了解不同噬菌體在不同環(huán)境中的存活情況，探索化學(xué)殺菌劑與噬菌體聯(lián)合防治煙草青枯病的可行性。將P7-1、P1556-1及P1556-2等3種噬菌體與7種化學(xué)殺菌劑混合后，置于4 ℃和30 ℃培養(yǎng)箱，測定噬菌體效價(jià)隨時(shí)間的變化規(guī)律。結(jié)果表明，3個(gè)噬菌體在7種殺菌劑中存活時(shí)間存在明顯差異：3種噬菌體與氫氧化銅和王銅混合后1個(gè)月，其效價(jià)均為0;對(duì)其他5種殺菌劑的耐藥由強(qiáng)到弱為P1556-2>P1556-1>P7-1，其中P1556-2在噻唑鋅、中生菌素、春雷霉素、喹啉銅和辛菌胺醋酸鹽中12個(gè)月測定的效價(jià)對(duì)數(shù)值分別為8.73、7.65、7.93、7.39和8.18。部分噬菌體在30 ℃可存活1～5個(gè)月，但在4 ℃下可存活6～12個(gè)月。噬菌體P1556-2和P1556-1在無致病力青枯菌Trp574中保存，其效價(jià)明顯高于在無菌水中保存。可見，噬菌體在殺菌劑中的存活（效價(jià)）受時(shí)間、溫度、藥劑種類和噬菌體自身特性的影響，氫氧化銅與王銅制劑對(duì)噬菌體具有明顯抑制作用，4 ℃（低溫）下能夠延長噬菌體的存活時(shí)間。無致病力青枯菌Trp574可用于噬菌體P1556-1和P1556-2的保存和大量培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：煙草青枯病;殺菌劑;噬菌體;無致病力青枯菌;存活;效價(jià)

Abstract： The survival of bacteriophages of Ralstonia solanacearum in different environments and the feasibility of combined use of chemical agents and phages in disease control were studied. Three phages P7-1， P1556-1 and P1556-2 were mixed with seven kinds of bactericides and stored at 4 ℃ and 30 ℃ respectively， to determine the change of phage titer with time. The results showed that the survival time of the three phages were significantly different in the seven bactericides. The titers of the three phages were zero after mixing with copper hydroxide and copper oxychloride for one month. The resistance to bactericides of the three phages in the order from strong to weak is as follows， P1556-2 > P1556-1> P7-1， and the titer logarithms of P1556-2 were 8.73， 7.65， 7.93， 7.39 and 8.18 in thiazole zinc， zhongshengmycin， chunramycin， oxine-copper and octylamine acetate at 12 months， respectively. Some phages survived from 1-5 months at 30 ℃， but stayed alive for 6-12 months at 4 ℃. P1556-2 and P1556-1 had higher titers when they were stored in avirulent strain of R. solanacearum Trp574 than in sterile water. So， the titers were affected by time， temperature， bactericides and phages. Copper hydroxide and copper oxychloride showed obvious inhibition on phages. The survival time of phages can be prolonged at 4 ℃ （low temperature）. The avirulent strain of R. solanacearum Trp574 can be used for preservation and culture of P1556-1 and P1556-2.

Keywords： tobacco bacterial wilt; bactericide; bacteriophage; avirulent strain of Ralstonia solanacearum; activity; titer.

茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）（俗稱青枯菌），是引起植物青枯病的病原細(xì)菌，寄主范圍廣泛，能侵染54個(gè)科450多種植物[1-2]。煙草青枯病是我國煙草種植區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重的病害，其防治一直是生產(chǎn)上的難題。化學(xué)防治具有方便快速等優(yōu)點(diǎn)，如20%噻唑鋅懸浮劑、3%中生菌素可濕性粉劑等對(duì)青枯病有一定的防治效果[3-5]。但長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥易導(dǎo)致環(huán)境污染和病菌抗藥性等問題，由此，青枯病生物防治受到國內(nèi)外重視[6-8]，其中包括青枯菌無致病力菌株的應(yīng)用[9，13]，以及利用噬菌體防治作物青枯病[10-12]。1990年，日本報(bào)道利用青枯菌噬菌體防治煙草青枯病，效果較好[13]，從煙田中分離煙草青枯菌噬菌體，具有巨大應(yīng)用潛力[14]。由于青枯菌的遺傳多樣性及噬菌體的高度特異性，導(dǎo)致噬菌體的防治效果和使用范圍受到限制[15]?；瘜W(xué)殺菌劑和生防菌聯(lián)用防控真菌病害，顯示出良好應(yīng)用前景[16]。噻菌銅和生防芽胞菌AR03聯(lián)合使用明顯提高煙草青枯病的防治效果，大幅降低了化學(xué)藥劑的使用量[17]，但化學(xué)殺菌劑與噬菌體聯(lián)合使用防治煙草青枯病研究，迄今尚未見報(bào)道。噬菌體與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合使用，需要明確殺菌劑對(duì)噬菌體存活的影響，尤其要明確噬菌體的保存時(shí)間。此外，利用噬菌體防治植物細(xì)菌性病害，關(guān)鍵技術(shù)是噬菌體的擴(kuò)大繁殖，在培養(yǎng)噬菌體過程中，存在致病宿主菌的風(fēng)險(xiǎn)?；诖?，本研究擬測定3種青枯菌噬菌體在7種細(xì)菌殺菌劑和無致病力青枯菌中的存活情況，為化學(xué)殺菌劑與噬菌體聯(lián)合使用防治煙草青枯病提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試藥劑

選擇目前我國防治農(nóng)作物細(xì)菌病害常用的7種細(xì)菌殺菌劑（表1），均為市售。

1.2 ?供試菌株與噬菌體

宿主青枯菌菌株Tb1546分離自江西贛州煙草患青枯病植株，中等致病力;青枯菌無致病力菌株Trp574分離自江西煙草植株，通過遺傳改造后喪失了對(duì)煙草的致病力[18]。供試噬菌體P7-1，P1556-1，P1556-2，分離自江西省和廣東省煙田，屬于有尾噬菌體目中的不同噬菌體科。以上供試菌株與噬菌體均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院細(xì)菌研究室分離、保存和提供。

1.3 ?培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀2 g，蔗糖15 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L。

半固體培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀2 g，蔗糖15 g，瓊脂粉8 g，蒸餾水1 L。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L。

TTC培養(yǎng)基：水解干酪素1 g，蛋白胨10 g，甘油5 mL，瓊脂32 g，1%三苯基四氮唑（TTC）10 mL，蒸餾水1 L。

1.4 ?青枯菌及噬菌體的培養(yǎng)

用TTC平板活化Tb1546和Trp574，單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，獲得細(xì)菌懸浮液。

以Tb1546為宿主菌，用雙層平板法[18]分別孵化P7-1，P1556-1和P1556-2，戳取噬菌斑，與Tb1546菌液及LB混合，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，獲得噬菌體液。

1.5 ?不同殺菌劑對(duì)噬菌體存活的影響

將噬菌體P7-1（5.07×108 PFU/mL）、P1556-1（1.45×107 PFU/mL）、P1556-2（3.36×108 PFU/mL）分別與7種殺菌劑混合，使各藥劑最終稀釋倍數(shù)為600倍，噬菌體和無菌水混合作為CK對(duì)照。將上述各處理在4 ℃冰箱和30 ℃培養(yǎng)箱中保存，其中4 ℃代表低溫環(huán)境，30 ℃代表亞高溫或常溫環(huán)境，每處理重復(fù)3次。每隔1個(gè)月取樣，參照余成鵬[19]方法，測定噬菌體效價(jià)（PFU/mL），連續(xù)測定12個(gè)月。噬菌體效價(jià)（PFU/mL）為每毫升噬菌體液在平板上所形成的噬菌斑個(gè)數(shù)。

1.6 ?噬菌體在無致病力青枯菌中的存活

將噬菌體液、Trp574菌懸液和無菌水按1：1：8的比例混合，置于30 ℃培養(yǎng)箱保存，噬菌體液和無菌水按1∶9混合為CK對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。按1.5方法，每月測定1次效價(jià)，連續(xù)測定12月。

1.7 ?數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)獲得的效價(jià)進(jìn)行對(duì)數(shù)替換Log（PFU/mL+1），使用IBM SPSS statistic 21對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行DMRT（Duncan’s multiple range test，鄧肯氏復(fù)極差檢驗(yàn)）法的單因素方差分析，比較顯著差異水平（α=0.05）。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?不同殺菌劑對(duì)噬菌體存活的影響

2.1.1 ?殺菌劑對(duì)噬菌體P7-1存活的影響 ?結(jié)果顯示（表2），4 ℃下，在第12個(gè)月檢測，CK、中生菌素、春雷霉素和喹啉銅等處理中噬菌體仍然有存活，但效價(jià)降低了1個(gè)數(shù)量級(jí);噻唑鋅處理效價(jià)降低了4個(gè)數(shù)量級(jí);辛菌胺醋酸鹽、氫氧化銅和王銅處理，噬菌體在前期效價(jià)為0。而在30 ℃條件下，除噻唑鋅外，其他殺菌劑處理在6個(gè)月時(shí)均檢測不到噬菌體?？梢?，殺菌劑對(duì)P7-1的存活具有影響，

P7-1在氫氧化銅、王銅和辛菌胺醋酸鹽中的存活時(shí)間大大縮短，且在30 ℃條件下比在4 ℃下存活時(shí)間更短。

2.1.2 ?殺菌劑對(duì)噬菌體P1556-1存活的影響 ?表3顯示，在4 ℃條件下，CK、噻唑鋅、中生菌素、春雷霉素和喹啉銅等處理中，P1556-1在12個(gè)月后仍有存活，但各處理效價(jià)均比CK明顯降低（p<0.05）;而辛菌胺醋酸鹽、氫氧化銅和王銅等處理，在第1個(gè)月測定，P1556-1效價(jià)為0，表明，這3種殺菌劑對(duì)P1556-1具有明顯的抑制作用（p<0.05）。在30 ℃存放條件下，只有喹啉銅處理的P1556-1在12個(gè)月仍有存活，但效價(jià)比CK降低了5個(gè)數(shù)量級(jí)，噻唑鋅和春雷霉素處理，在1～2個(gè)月內(nèi)噬菌體無存活。

2.1.3 ?殺菌劑對(duì)噬菌體P1556-2存活的影響 ?表4顯示，除了氫氧化銅和王銅處理外，其他處理，在第12個(gè)月檢測，P1556-2仍有存活，其效價(jià)與CK相比，差異不顯著（p>0.05），表明，噻唑鋅、中生菌素、春雷霉素、喹啉銅和辛菌胺醋酸鹽等殺菌劑對(duì)P1556-2影響較小，P1556-2在這些殺菌劑中可以存活1年。

2.2 ?噬菌體在無致病力青枯菌Trp574中的存活

P7-1、P1556-1、P1556-2與Trp574混合后在30 ℃存放，結(jié)果顯示（圖1），第3個(gè)月測定P7-1效價(jià)為0，說明P7-1不易在Trp574中存活，而P1556-1和P1556-2在第12個(gè)月測定其效價(jià)明顯高于CK（圖1），說明在30 ℃下，P1556-1和P1556-2能夠利用Trp574進(jìn)行繁殖，延長噬菌體的保存時(shí)間。

3 ?討 ?論

目前，生產(chǎn)上對(duì)煙草青枯病的防治，仍然廣泛使用化學(xué)殺菌劑[20]，藥劑的減量增效以及化學(xué)農(nóng)藥與生物制劑的結(jié)合是防治作物青枯病新的發(fā)展方向。本研究測定了3個(gè)青枯菌噬菌體在7種細(xì)菌殺菌劑和無致病力青枯菌中的存活情況，其結(jié)果可為噬菌體協(xié)同化學(xué)殺菌劑防治煙草青枯病奠定基礎(chǔ)。

我們前期研究表明，煙草青枯菌噬菌體P7-1、P1556-1及P1556-2具有裂解多個(gè)青枯菌菌株的特性，顯示其良好的應(yīng)用前景[19]，但不清楚它們能與哪些化學(xué)殺菌劑混用。本結(jié)果顯示這3個(gè)噬菌體在不同殺菌劑中存活時(shí)間存在明顯差異，其中P1556-2耐（抗）藥性最強(qiáng)，可以在噻唑鋅、中生菌素、辛菌胺醋酸鹽、春雷霉素、喹啉銅中存活12個(gè)月，但3個(gè)噬菌體在氫氧化銅和王銅中的存活時(shí)間較短，這與84%王銅對(duì)噬菌體有一定滅活作用的研究結(jié)果基本相符[21]?；瘜W(xué)制劑、pH和殺菌物質(zhì)對(duì)噬菌體活性產(chǎn)生不利的影響[14，22]，本文結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，不同噬菌體對(duì)不同殺菌劑的敏感性不同，3個(gè)噬菌體對(duì)殺菌劑敏感性由弱至強(qiáng)表現(xiàn)為P1556-2>P1556-1> P7-1，因此生產(chǎn)上殺菌劑與噬菌體的混用需要謹(jǐn)慎。研究表明，20%噻唑鋅、3%中生菌素以及1.8%辛菌胺醋酸鹽對(duì)青枯病等作物細(xì)菌性病害有較好防治效果[3-5，23]，結(jié)合本文結(jié)果認(rèn)為，生產(chǎn)上可嘗試將噻唑鋅、中生菌素、辛菌胺醋酸鹽、春雷霉素、喹啉銅等藥劑與噬菌體P1556-2混合使用，噻唑鋅與P7-1混用，喹啉銅與P1556-1混用，以擴(kuò)大青枯病防治藥劑的選擇范圍和提高防治效果。而氫氧化銅與王銅制劑對(duì)噬菌體有明顯的抑制作用，不適宜與噬菌體混合使用。最近報(bào)道認(rèn)為，短小芽孢桿菌與化學(xué)殺細(xì)菌劑具有協(xié)同防治煙草青枯病的作用[17]，但噬菌體聯(lián)合化學(xué)殺細(xì)菌劑防治煙草青枯病研究，迄今尚未見報(bào)道，本研究的結(jié)果是初步的，其實(shí)際應(yīng)用還有待于進(jìn)一步的田間試驗(yàn)。

噬菌體是專性寄生菌，不能離開其宿主菌而長期獨(dú)立生存，噬菌體的保存是一項(xiàng)極其重要工作。本研究除了探究噬菌體在化學(xué)殺菌劑中保存的時(shí)間，還比較了噬菌體在4 ℃低溫和30 ℃亞高溫環(huán)境條件下的存活情況，結(jié)果表明，噬菌體在4 ℃低溫下數(shù)量更多，存活的時(shí)間更長，支持前人研究結(jié)果[24]。這是由于噬菌體是一種寄生于活體細(xì)胞內(nèi)的非細(xì)胞生物，低溫可降低其新陳代謝，保持活性，因此，低溫可提高噬菌體的保存效果，而在室溫和亞高溫下，由于噬菌體的代謝活動(dòng)正常，需要消耗宿主菌，在有限的宿主菌情況下，噬菌體將逐漸死亡，導(dǎo)致其數(shù)量下降。

利用噬菌體防治植物細(xì)菌性病害，需要一定數(shù)量的噬菌體。生產(chǎn)出來的噬菌體制劑，在流通、存放和使用過程中保持較高效價(jià)，是噬菌體實(shí)際應(yīng)用要解決的問題。通常，噬菌體在沒有宿主菌條件下保存，隨著時(shí)間的延長，其數(shù)量逐漸下降[25-26]，但在有宿主菌的條件下，噬菌體保存的時(shí)間更長[24]，本研究支持前人研究結(jié)果。P1556-1和P1556-2在青枯菌Trp574中不同時(shí)間的存活數(shù)量，均明顯高于各自沒有青枯菌的對(duì)照，但噬菌體P7-1結(jié)果則相反，原因是青枯菌噬菌體具有一定的寄主范圍，P7-1寄主范圍沒有P1556-1和P1556-2廣泛[19]，它可能對(duì)青枯菌Trp574的侵染能力弱，不適合在Trp574中繁殖，其機(jī)理有待于進(jìn)一步證實(shí)。此外，在培養(yǎng)噬菌體過程中，常出現(xiàn)抗噬菌體的宿主菌[18]，因而在用噬菌體防治植物病害時(shí)，應(yīng)去除未被裂解的宿主病原菌，以免造成對(duì)防治對(duì)象的侵染。但是，去除未被裂解的宿主菌通常較困難[9]，探索噬菌體在無致病力青枯菌中的存活，具有實(shí)際意義。林志堅(jiān)等[9]通過連續(xù)超過20代的培養(yǎng)，獲得青枯菌無致病力菌株，作為噬菌體擴(kuò)大繁殖的宿主。我們?cè)谇捌谕ㄟ^遺傳改造獲得無致病力青枯菌Trp574[18]，本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Trp574可作為噬菌體P1556-1和P1556-2保存和大量繁殖的理想宿主菌，可避免噬菌體在田間應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)。

4 ?結(jié) ?論

試驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體在殺菌劑中的存活受時(shí)間、溫度、藥劑種類和噬菌體自身特性的影響，3個(gè)噬菌體對(duì)化學(xué)藥劑的耐受性由強(qiáng)至弱為P1556-2> P1556-1>P7-1。P1556-2在噻唑鋅、中生菌素、辛菌胺醋酸鹽、春雷霉素和喹啉銅等殺菌劑中可存活12個(gè)月，氫氧化銅與王銅制劑對(duì)噬菌體具有明顯抑制作用。噬菌體在4 ℃（低溫）下比在30 ℃（亞高溫）條件下存活的時(shí)間更長。無致病力青枯菌Trp574可用于P1556-1和P1556-2的保存和大量的培養(yǎng)。

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