龍杞方治療糖尿病腎臟病的作用機(jī)制：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和大鼠驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

糖尿?。―M）是我國目前患病率最高的慢性疾病之一，伴隨著我國老齡化的進(jìn)展和生活方式的改變，我國糖尿病的發(fā)病率也不斷升高，在2018年國際糖尿病聯(lián)合會發(fā)布的《IDF全球糖尿病概覽·第九版》中指出截止2019年20～70歲全球糖尿病患者的數(shù)量達(dá)到4.63億，而我國糖尿病患者的數(shù)量達(dá)到1.164億，高居全球第一，其患病率約占總?cè)丝诘?0.9%。糖尿病腎臟?。―KD）是最令人擔(dān)憂的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病（ESRD）的主要原因。DKD患者的全因死亡率約為無腎病的糖尿病患者的30倍。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療DKD的主要方法以控制血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、控制血壓、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子等為主，但是臨床療效欠佳，最終方式以腎臟血液凈化為主，故尋找有效阻止/延緩早期DKD的藥物尤為重要。

龍杞方是郭宏敏教授的經(jīng)驗(yàn)方（專利：ZL201310565771.0），在治療早期DKD患者方面療效顯著，其組成主要為：制黃精、干地龍、紅景天、川芎、荷葉、三七粉、葛根、生地、枸杞，以黃精為君藥。長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)龍杞方能有效改善早期慢性腎功能不全患者的尿蛋白水平，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)龍杞方能有效改善胰島素抵抗、對血管炎癥因子有抑制作用，能起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。但由于龍杞方由多味中藥組成，成分多而復(fù)雜，其靶點(diǎn)多，作用機(jī)制多，目前無法完全闡明龍杞方治療DKD的藥理機(jī)制。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲得龍杞方治療DKD的潛在靶點(diǎn)和信號通路，探討龍杞方治療DKD的可能機(jī)制，并通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證分析，為龍杞方的臨床應(yīng)用以及DKD相關(guān)疾病基礎(chǔ)與臨床研究提供一定的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.1.1 糖尿病腎臟病GEO 芯片篩選差異基因 通過NCBI 基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）中GEO datasets 以“Diabetic kidney disease”作為為檢索詞，獲取GSE30528和GSE30529相關(guān)芯片，其芯片分別對應(yīng)腎小球及腎小管，兩組芯片為同一實(shí)驗(yàn)，兩者的注釋文件為同一平臺GPL571。對獲得的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析，使用limma包對芯片數(shù)據(jù)的差異基因進(jìn)行分析，為了得到更多的差異基因，將顯著差異基因的篩選條件設(shè)定為及校正后的均小于0.05，logFC的絕對值大于1，得到名為“diff”的差異基因文件，運(yùn)用phearmap包，分別篩選出上調(diào)與下調(diào)基因，繪制差異基因的熱圖，運(yùn)用plot包繪制火山圖。

1.1.2 龍杞方潛在活性成分和靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，輸入龍杞方中9味中藥名稱，即三七、地龍、荷葉、紅景天、葛根、地龍、枸杞、川芎、生地黃、黃精，搜索得到各藥化學(xué)成分，通過口服生物利用度（OB）及類藥性（DL）的篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）進(jìn)行篩選。在TCMSP中無法獲取相關(guān)藥物藥物成分和靶點(diǎn)的中藥，使用中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫和PubMed數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲取中藥化學(xué)成分有關(guān)的文獻(xiàn)，搜集其有效化學(xué)成分，使用ChemDraw軟件繪制相關(guān)化合物的分子結(jié)構(gòu)，以sdf（*.sdf）格式保存文件。將獲得的中藥化學(xué)成分的sdf 格式文件上傳到Swiss ADME平臺，對候選化合物和類藥性相關(guān)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)為：Pharmacokinetics項(xiàng)篩選腸胃吸收為“High”，同時Druglikeness項(xiàng)中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge，這5個類藥性預(yù)測中有≥2個以上為“Yes”的化合物，符合上述標(biāo)準(zhǔn)的為類藥性和口服利用度較好的活性化合物。將獲得的活性化合物以sdf 格式文件上傳至SwissTargetPrediction 平臺，“Organism”選擇“Homo Sapiens”，篩選條件為probability＞0.1，預(yù)測潛在靶點(diǎn)，建議活性化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 通過VENNY軟件得到的龍杞方與DKD的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“High confidence(0.400)”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)的tsv文件導(dǎo)入Excel表格，利用R 軟件進(jìn)行可視化處理，并選出核心靶點(diǎn)。

1.1.4 GO和KEGG分析 利用R軟件對上述篩選出的藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，種屬選為“Homo sapiens”，以≤0.01且從小到大排序作為篩選條件，選取符合條件的前20的KEGG通路及GO生物過程、細(xì)胞成分、分子功能，繪制GO和KEGG氣泡圖及柱狀圖。

2.1.1 GEO數(shù)據(jù)庫芯片獲取 依據(jù)上述方法，通過對正?；蚝虳KD腎臟組織標(biāo)本進(jìn)行分析，GSE30528芯片中符合及校正后的均小于0.05，logFC的絕對值大于1為篩選條件的差異基因有542個，其中上調(diào)的基因75個，下調(diào)的基因467個，繪制前40位的差異基因熱圖（圖1A），差異基因火山圖（圖1C）；在GSE30529芯片中符合及校正后的均小于0.05，logFC的絕對值大于1為篩選條件的差異基因有484個，其中上調(diào)的基因303個，下調(diào)的基因181個，繪制前40位的差異基因熱圖（圖1B），差異基因火山圖（圖1D）。

1.2 動物實(shí)驗(yàn)

付玉看看天。天上有幾只鳥雀飛過，像刀片在她記憶里劃了一道黑色的弧線。馬路兩邊的老槐樹上，有蟬在叫，叫聲像白花花的魚鱗，瓦片般在地上滾動。

1.2.2 藥物、試劑與儀器 中藥：龍杞方由干地龍、制黃精、枸杞、葛根、生地黃、紅景天、三七粉、川芎、荷葉組成，為江蘇省中醫(yī)院老年科臨床專用方，其中藥生藥由南京市高淳中醫(yī)院藥劑科提供，按高、中、低劑量制成，其制備方法：將配方量干地龍、制黃精、枸杞、葛根、生地黃、紅景天、三七粉、川芎、荷葉混合，放入3倍質(zhì)量的蒸餾水，浸泡1～2 h左右，再加入3倍質(zhì)量蒸餾水，煎煮1h，將濾液收集，使用同樣的方法再重復(fù)煎煮3次，最后將所有收集的濾液匯總濃縮成浸膏進(jìn)行過濾，按照高、中、低劑量將生藥劑量定為4 g生藥/mL、2 g生藥/mL、1 g生藥/mL，保存在4 ℃冰箱中備用。

鏈脲佐菌素（STZ，Sigma）；染色劑試劑盒、蘇木精染液（BASO）；伊紅染液（BASO）；NF-κB 多克隆抗體（EnoGene）；P-NF-κB多克隆抗體（EnoGene）。

1.2.3 STZ大鼠誘導(dǎo)的糖尿病腎臟病大鼠模型建立及藥物干預(yù)方案 基于國內(nèi)外DKD大鼠模型的造模方法，采用“高脂飼料喂養(yǎng)＋單側(cè)腎切除+STZ腹腔注射”3種措施建立改良型的DKD大鼠模型。

所有大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表將40只大鼠隨機(jī)分為正常組（8只）和造模組（32只）；正常組8只大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠32只大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)。32只造模組大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔內(nèi)注射丙戊酸鈉進(jìn)行麻醉，然后以俯臥位將其固定在鼠板上，消毒后沿大鼠左側(cè)背部肋弓下緣縱向切開約3 cm大小切口，將左側(cè)腎臟充分暴露，之后將腎周組織分離，對左側(cè)腎門血管進(jìn)行結(jié)扎后摘除左側(cè)腎臟，最后將切口逐層縫合。術(shù)后3 d內(nèi)在大鼠腹腔內(nèi)注射青霉素鈉（20萬U/d）以預(yù)防感染。大約7 d后，造模組大鼠手術(shù)創(chuàng)面愈合后，在大鼠右側(cè)腹腔內(nèi)注射STZ（35 mg/kg），72 h后對大鼠尾靜脈進(jìn)行采血，3次隨機(jī)血糖（RBG）監(jiān)測均＞16.7 mmol/L，則提示DKD大鼠模型成功建立。若3次RBG中有＜16.7 mmol/L，再次注射STZ（35 mg/kg），直至DKD大鼠模型成功建立。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 和SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用-test檢驗(yàn)對兩組間均數(shù)進(jìn)行比較，采用One-way Anova（Dunnett）對多組間比較。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差記錄正態(tài)分布定量資料，采用單因素方差分析及LSD法兩兩比較，不滿足方差分析條件時采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，當(dāng)＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

給藥方案：將32只造模大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型組8只，龍杞方高劑量組，中劑量組和低劑量組各8只，模型組自造模成功后不做任何干預(yù)，其余3組大鼠采用“按動物體表面積比率換算等計(jì)量法”計(jì)算出每組藥物的臨床等效劑量。龍杞方高劑量為20 g生藥/kg，中劑量為10 g生藥/kg，低劑量為5 g生藥/kg，龍杞方藥液按高、中、低劑量制成，生藥劑量分別為4 g生藥/mL、2 g生藥/mL、1 g生藥/mL，各組按照設(shè)定的劑量每日灌胃給藥，給藥體積為1 mL/200 g，連續(xù)給藥8周。在最后1次灌胃結(jié)束后1 d取材，取材前隔夜禁食禁水＞10 h。

1.2.5 Wesrtern blot實(shí)驗(yàn) 對獲得大鼠腎臟組織依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行，提取總蛋白→凝膠電泳分離→轉(zhuǎn)膜→抗體孵育→ECL顯色等多重步驟，檢測NF-κB多克隆抗體、P-NF-κB 多克隆抗體蛋白。

1.采油廠層面。實(shí)行培養(yǎng)工作目標(biāo)管理責(zé)任制。將入黨積極分子培養(yǎng)工作情況，納入優(yōu)秀基層黨組織評選推薦和黨組織負(fù)責(zé)人年度考核的參考指標(biāo)。采油廠黨委組織部門利用季度政工檢查、“三基”創(chuàng)建檢查等機(jī)會，通過隨機(jī)抽取人員座談、回答問卷等形式，對基層黨組織入黨積極分子培養(yǎng)工作進(jìn)行檢查，對培養(yǎng)過程記錄和培養(yǎng)工作實(shí)效性進(jìn)行量化，單獨(dú)列入季度政工檢查和“三基”創(chuàng)建排名考核依據(jù)，起到激勵作用。

1.2.4 腎臟組織HE染色流程 大鼠腎臟切除固定后，通過乙醇階梯脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等多個步驟后，使用切片機(jī)制片，片厚5μm，依據(jù)HE染色試劑盒說明進(jìn)行染色，并對腎臟組織進(jìn)行HE評分。

對剛屆不惑之年的宏波而言，年富力強(qiáng)的他已經(jīng)擁有了一些頗有些“耀眼”的光環(huán)：國家一級美術(shù)師、杭州畫院副院長、省美協(xié)理事、市美協(xié)副主席兼秘書長……宏波似乎是有些“大器早成”。然而，藝術(shù)無有窮期，前途無可限量。相信宏波會在他的藝術(shù)之旅上踏出一個又一個扎實(shí)的腳印。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

1.1.5 構(gòu)建“龍杞方-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 通過對獲得20條主要信號通路及其相關(guān)靶點(diǎn)及其映射的龍杞方成分，通過匯入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建“龍杞方-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.2 龍杞方有效成分和靶點(diǎn) 通過檢索TCMSP平臺只獲取了三七、荷葉、葛根、川芎、枸杞、黃精的所有成分，按照OB≥30%，DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩得其對應(yīng)的有效成分，其中三七有效成分7個，荷葉有效成分14個，川芎有效成分6個，枸杞有效成分35個，葛根有效成分3個，黃精有效成分9個。其對應(yīng)的中藥靶點(diǎn)三七223個，川芎39個，枸杞321個，荷葉358個，葛根76個，黃精133個。對于無法獲得的中藥紅景天、地龍、生地黃，我們通過檢索生地黃、地龍、紅景天的相關(guān)文獻(xiàn)檢索其化合物，并通過Swiss ADME平臺獲得紅景天有效成分47 個，地龍有效成分36 個，生地黃有效成分52個。通過SwissTarget Prediction平臺預(yù)測并收集中藥對應(yīng)化合物的靶點(diǎn)，其中紅景天有效成分47個，地龍有效成分36個，生地黃有效成分52個，核心靶點(diǎn)生地黃1008個，紅景天1092個，地龍931個。將所有的中藥靶點(diǎn)經(jīng)過匯總?cè)ブ睾螳@得的靶點(diǎn)760個。

2.1.5 GO和KEGG分析 龍杞方治療DKD的GO功能分析提示，KEGG通路富集分析結(jié)果共37條信號通路，其中主要有AGEs-RAGE、HIF-1、PI3K-Akt，NF-κB、TNF信號通路可能為重要的龍杞方治療DKD的信號通路（圖5）；其中20條與DKD密切相關(guān)的通路（表1）；利用R軟件繪制前20名信號通路氣泡圖（圖6）。

2.1.3 龍杞方-糖尿病腎臟病的共同靶點(diǎn) 將龍杞方的所有靶點(diǎn)與GSE30528、GSE30529的差異基因取交集，獲得龍杞方與DKD相關(guān)發(fā)病機(jī)制的61個交集靶點(diǎn)基因，并通過Venny 2.1.0 軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）繪制韋恩圖（圖2）。

2.1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)及龍杞方治療DKD 的主要靶點(diǎn) 將2.1.3項(xiàng)下得到的龍杞方作用與DKD的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“High confidence(0.150)”，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3）。使用Cytoscape軟件中的Network-Analyzer分析互作節(jié)點(diǎn)的度值，Degree值作為標(biāo)準(zhǔn)，找到排名前30的核心靶點(diǎn)，并使用R語言繪制核心靶點(diǎn)的柱狀圖（圖4）。得到龍杞方治療DKD的核心靶點(diǎn)為MYC、EGF、CASP3、VEGFA、CCL2、SPP1、VCAM1、ICAM1。

Ian是來自南半球的男子。27歲，電腦工程師?？∶?，壯實(shí)，略帶魯莽和天真之氣，此前生活讀書工作一直在小城布里斯班度過。熱衷戶外運(yùn)動，登山，滑板，出海，自助旅行，和漂亮女孩做愛。他是獨(dú)子，備受父母寵愛，未必有過深刻的戀情，不過是18歲開始，與不同異性之間幼獸般的肌膚相親，戲耍玩樂。這一年，他失戀，也不是慘痛經(jīng)歷，只是選擇與人分手。于是給自己一個理由，挑選一個孤僻遙遠(yuǎn)的地點(diǎn)，抵達(dá)老撾。

2.1.7 構(gòu)建“龍杞方-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 通過對獲得20條主要信號通路中38個關(guān)鍵靶點(diǎn)及其映射的主要成分，將其匯入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建“龍杞方-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖10）。

2.2 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 生化指標(biāo)檢測 模型組大鼠血清生化指標(biāo)Scr、BUN、UALB、UACR較正常組大鼠顯著升高（＜0.01），龍杞方各劑量組大鼠經(jīng)治療后，血清生化指標(biāo)Scr，BUN，以及尿蛋白指標(biāo)UALB、UACR較模型組顯著降低（＜0.01），效應(yīng)強(qiáng)度為：龍杞方高劑量組＞中劑量組＞低劑量組（表2、圖8）。

或許我的運(yùn)氣特別好，我指導(dǎo)的9名碩士研究生都非常優(yōu)秀。除其中有3名在職研究生不能參與評選優(yōu)秀畢業(yè)生外，6人中有3人畢業(yè)時被評為上海市優(yōu)秀畢業(yè)生，有3人考取博士研究生，并3人晉升為副研究館員或副教授職稱。而且他們培養(yǎng)的碩士研究生同樣十分優(yōu)秀，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，1人被評為上海市優(yōu)秀畢業(yè)生，3人次獲國家一等獎學(xué)金，1人被評為“上海大學(xué)學(xué)術(shù)啟明星”，1人考取南開大學(xué)博士研究生等。

私人、個體醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以作為我國醫(yī)療體系的重要組成部分，是公有制醫(yī)療機(jī)構(gòu)的補(bǔ)充和完善，不能與公有制醫(yī)療機(jī)構(gòu)享有同等地位。在醫(yī)療領(lǐng)域，不能以市場經(jīng)濟(jì)的觀念來對待公有制醫(yī)療與私營、個體醫(yī)療。生病、看病不能看作是商品，不能由市場來主導(dǎo)，不能通過價(jià)格競爭、獨(dú)特服務(wù)，讓私人或個體醫(yī)療來引導(dǎo)或沖擊公有制醫(yī)療。

2.2.2 Western blot結(jié)果 與模型組對比，藥物濃度在高劑量（4 mg/mL）、中劑量（2 mg/mL）時NF-κB、P-NF-κB蛋白表達(dá)均有所下調(diào)（＜0.01）。與模型組對比，藥物濃度在低劑量（1 mg/mL）時NF-κB、P-NF-κB的蛋白表達(dá)水平有所下調(diào)（＜0.05，表3、圖9）。

1.2.1 動物 SPF 級SD 大鼠40 只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購于南通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0001。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK（蘇）2017-0007。

2.2.3 HE染色結(jié)果 對構(gòu)建DKD大鼠模型，使用不用劑量的龍杞方進(jìn)行干預(yù)，HE染色結(jié)果顯示模型組的腎小管上皮細(xì)胞重度變性壞死，管腔輕微增大，腔內(nèi)見大量透明管型；腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多、毛細(xì)血管擴(kuò)張，系膜基質(zhì)無增生，球囊腔無擴(kuò)大；間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤，無纖維組織增生。龍杞方干預(yù)組與模型組相比，改善明顯，效應(yīng)強(qiáng)度為：龍杞方高劑量組＞中劑量組＞低劑量組（圖10）。

3 討論

DKD是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一定論，但普遍認(rèn)為與炎癥反應(yīng)、遺傳因素、代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血流動力學(xué)等相關(guān)。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)研究，20%～40%的糖尿病患者會出現(xiàn)DKD，預(yù)計(jì)到2030年，世界范圍內(nèi)的DM患者將達(dá)到3.66億，而DKD患者將超過1億，開展防治DKD 的研究工作已經(jīng)刻不容緩?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為DKD的發(fā)病機(jī)制與多重因素有關(guān)，如持續(xù)的高血糖狀態(tài)引起的糖基化合物增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，腎臟血流動力學(xué)的改變?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家仝小林院士認(rèn)為DKD在中醫(yī)上屬于“消渴腎病”的范疇，認(rèn)為其發(fā)病的病機(jī)主要為痰濁、腎虛、血瘀導(dǎo)致，導(dǎo)師郭宏敏教授使用龍杞方治療DKD患者，臨床療效顯著，全方以標(biāo)本同治為治則，具有活血化瘀、升清降濁、益氣養(yǎng)陰、清熱剔絡(luò)之功效，切合DKD患者痰濁、腎虛、血瘀的發(fā)病機(jī)制。目前龍杞方在臨床上使用較為廣泛，但是缺乏有效的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對龍杞方作用于DKD的多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制缺乏客觀的認(rèn)識。本文通過GEO數(shù)據(jù)庫結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過“疾病、藥物、靶標(biāo)、通路”有機(jī)結(jié)合，進(jìn)一步研究龍杞方作用于DKD的研究機(jī)制。

比如，近期關(guān)于人工飼養(yǎng)、出售瀕危野生動物而獲刑的案件就曾引發(fā)廣泛討論。相對應(yīng)的，《規(guī)劃》提到，進(jìn)一步修訂完善涉野生動物和國家重點(diǎn)保護(hù)植物相關(guān)犯罪案件的司法解釋。

本次研究得出龍杞方治療DKD的61個交集靶點(diǎn)，并通過PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析以及R語言軟件獲得龍杞方治療DKD的前8位的主要靶點(diǎn)為MYC、EGF、CASP3、VEGFA、CCL2、SPP1、VCAM1、ICAM1，說明龍杞方可能是通過作用以上靶點(diǎn)從而對DKD發(fā)揮直接或者間接的調(diào)控作用。并通過“龍杞方-成分-靶點(diǎn)-通路-DKD”網(wǎng)絡(luò)圖篩選出龍杞方治療DKD的主要核心成分為槲皮素、山奈酚。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素調(diào)控NF-κB信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，抑制DKD大鼠的腎臟纖維化。Chen等研究發(fā)現(xiàn)山奈酚可以通過抑制NF-κB信號通路減輕高血糖誘導(dǎo)的心臟損傷。

通過GO和KEGG分析龍杞方治療DKD具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)龍杞方可能通過上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控、白細(xì)胞-細(xì)胞粘附等過程發(fā)揮保護(hù)DKD大鼠的作用，其作用機(jī)制可能與PI3KAkt、NF-κB、TNF等炎癥信號通路相關(guān)。

NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子的代表，不僅在正常的生理活動中，其異?；罨才c許多疾病緊密相關(guān)，研究報(bào)道腎病患者中NF-κB表達(dá)的水平的增高顯著，其形成的信號通路表達(dá)水平高低可作為腎病預(yù)后的判斷標(biāo)準(zhǔn)。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，龍杞方通過調(diào)控NF-κB信號通路進(jìn)一步改善DKD的病理生理功能。NF-κB信號通路是多種信號通路的樞紐，NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致促炎因子啟動，導(dǎo)致細(xì)胞炎癥反應(yīng)增加，組織炎癥損傷。在高血糖狀態(tài)下，導(dǎo)致NF-κB激活，參與高血糖誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明通過抑制NF-κB信號通路的磷酸化激活可以有效改善DKD的病程進(jìn)展。通過HE病理染色可以發(fā)現(xiàn)龍杞方可能通過抑制NF-κB信號通路，減輕DKD大鼠的炎癥反應(yīng)，減緩DKD大鼠腎臟纖維化的進(jìn)展。

The mean crystallite size of the line broadening of the(101) plane was evaluated by using the Scherrer formula[17],

本研究通過不同濃度的龍杞方對DKD大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對腎功能損傷指標(biāo)的改善情況。發(fā)現(xiàn)相關(guān)腎功能指標(biāo)Scr，BUN、UALB、UACR均有顯著變化，效應(yīng)強(qiáng)度為：龍杞方高劑量組＞中劑量組＞低劑量組。表明龍杞方可有效改善DKD大鼠的腎功能。通過對DKD大鼠的臨床癥狀有較為明顯的改善，說明龍杞方在改善DKD大鼠的蛋白尿、肌酐、尿素氮以及臨床癥狀上有較為明顯的療效，具有保護(hù)腎臟的作用。

綜上所述，通過GEO數(shù)據(jù)庫與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析龍杞方治療DKD的核心靶點(diǎn)，GO和KEGG分析以及篩選得到龍杞方治療DKD的核心信號通路和分子機(jī)制。通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)龍杞方能有效改善DKD大鼠的腎功能，同時龍杞方可以抑制炎癥信號通路NF-κB，減輕炎癥反應(yīng)，抑制腎臟纖維化起到保護(hù)腎臟的作用。