褪黑素通過(guò)激活自噬抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

褪黑素是松果體分泌的一種胺類(lèi)激素，在生物體中發(fā)揮著重要作用，其中包括調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、睡眠、情緒、生殖和衰老等等?，F(xiàn)如今發(fā)現(xiàn)，褪黑素在體內(nèi)及體外能夠抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)、遷移及侵襲，并促進(jìn)其凋亡，使得褪黑素在腫瘤治療中的應(yīng)用倍受關(guān)注，其潛在作用機(jī)制包括調(diào)節(jié)褪黑素受體MT1和MT2、促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤代謝、抑制血管生成、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)表觀遺傳改變等等。1978年，文獻(xiàn)首次介紹了松果體在乳腺癌病因?qū)W中可能的理論機(jī)制，認(rèn)為松果體功能的降低，以及隨之導(dǎo)致的褪黑素分泌減少，可使乳腺組織處于相對(duì)高雌激素狀態(tài)，最終誘導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生。據(jù)研究報(bào)道，乳腺癌患者中，褪黑素水平明顯下降，在臨床狀態(tài)不佳的晚期乳腺癌患者中，與單獨(dú)接受化療的患者相比，同時(shí)接受褪黑素治療的患者的生存率顯著更高，且褪黑素在較高濃度下也無(wú)明顯的副作用。因此，褪黑素對(duì)乳腺癌的治療可能是一種較好的干預(yù)方法。然而，褪黑素抑制乳腺癌的具體作用和機(jī)制尚不明確。

自噬是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，通過(guò)螯合蛋白質(zhì)和受損老化的細(xì)胞器，最終融合到溶酶體中，導(dǎo)致螯合成分的降解，其對(duì)多種腫瘤的發(fā)生起著重要的影響。自噬既可以抵御環(huán)境變化對(duì)細(xì)胞造成的損傷，起到保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用，又可以降解功能失調(diào)的蛋白，具有抑制腫瘤發(fā)展的作用。關(guān)于褪黑素在自噬方面的作用，有文章稱(chēng)褪黑素可改善PBDE-47所致大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的異常自噬與凋亡增加，此外，褪黑素可協(xié)同順鉑增加自噬，增強(qiáng)對(duì)頭頸鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞毒性，但自噬在褪黑素對(duì)乳腺癌的作用中未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)褪黑素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移的影響，初步探討褪黑素是否通過(guò)自噬影響乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，為深入研究褪黑素抗腫瘤提供一定的參考理論依據(jù)以及進(jìn)一步應(yīng)用于乳腺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（3）具有一定的系統(tǒng)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)能力。編程能力是對(duì)編程思維的訓(xùn)練，系統(tǒng)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)是要求具有較強(qiáng)的邏輯思維能力，能夠站在更高的角度看待問(wèn)題。要分析當(dāng)前的問(wèn)題，設(shè)計(jì)解決問(wèn)題的方案，然后完成系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，最后達(dá)到對(duì)問(wèn)題的解決。系統(tǒng)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)能力是一種綜合能力的體現(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要藥品與試劑 褪黑素、3-MA（MCE），褪黑素溶于無(wú)水乙醇中，無(wú)水乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度不超過(guò)0.1%，3-MA溶于DMSO（二甲基亞砜），在培養(yǎng)基中濃度不超過(guò)0.1%；胎牛血清（BI）；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（Gibco）；Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒（東仁化學(xué)科技有限公司）；Bax、Bcl2、LC3、GAPDH等兔抗單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；P62和Beclin1單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；E-cadherin和Snail兔抗單克隆抗體（Affinity）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（七海生物）；二辛可寧酸（BCA)蛋白定量試劑盒、Tritionx-100、抗熒光衰減封片劑含DAPI（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀（Bio Rad）；熒光倒置顯微鏡（尼康）；流式細(xì)胞儀（Beckman）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，重懸于新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)胞以1×10/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h使其完全貼壁后，通過(guò)參考文獻(xiàn)中褪黑素處理腫瘤細(xì)胞的濃度，分別用含1、3、5 mmol/L褪黑素的培養(yǎng)基處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 24 h和48 h，并用加入0.1%無(wú)水乙醇的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，設(shè)置只含培養(yǎng)基的孔作為空白組。待培養(yǎng)結(jié)束后，更換成新鮮培養(yǎng)基，并加入CCK-8試劑，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm）檢測(cè)各孔的值并與對(duì)照組比較，計(jì)算細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率=（-）/（-）×100%。繪制MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率曲線，即可計(jì)算出褪黑素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（）。

1.2.2 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的集落形成能力 0.25%胰蛋白酶消化MDA-MB-231細(xì)胞，按照5×10/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)4 d后，換為含1、3、5 mmol/L褪黑素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，加入0.1%無(wú)水乙醇的培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組，作用6 d后棄去含藥物的培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，用甲醇固定，1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，最后用PBS洗去多余的染液，晾干后拍照保存，大于50個(gè)細(xì)胞的集團(tuán)作為一個(gè)集落，統(tǒng)計(jì)形成的集落數(shù)量。

與對(duì)照組相比，P62陽(yáng)性蛋白著色減弱，Beclin1陽(yáng)性蛋白著色增強(qiáng)（圖4A）。通過(guò)Western blot 檢測(cè)了LC3、Beclin1和P62的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度的褪黑素處理MDA-MB-231細(xì)胞后，LC3-II/LC3-I 比值隨褪黑素濃度增加呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)；Beclin1的蛋白表達(dá)量增高；P62表達(dá)減低（＜0.05，圖4B）。

劃痕實(shí)驗(yàn)表明，褪黑素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，隨著褪黑素濃度的增加，其抑制遷移的能力加強(qiáng)，表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性（＜0.01，圖2A）。與對(duì)照組相比，褪黑素能夠下調(diào)MDA-MB-231內(nèi)Snail的表達(dá)，值分別為0.0700、0.0065、0.0057，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，值分別為0.0903、0.0108、0.0015（圖2B）。

1.2.5 免疫熒光 將MDA-MB-231細(xì)胞適量接種于6孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入3 mmol/L的褪黑素處理24 h，棄去培養(yǎng)基用PBS洗滌2次后，使用4%的多聚甲醛固定20 min，用PBS 洗滌3 次，每次5 min，利用0.5%Tritonx-100室溫通透10 min，再用PBS洗滌3次，加入5%BSA室溫封閉2 h，棄去封閉液后，加入自噬相關(guān)抗體（P62、Beclin1）4 ℃過(guò)夜，次日使用PBS洗滌殘留一抗3次后，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，清洗未結(jié)合的二抗后，加入含DAPI 的抗熒光衰減封片劑5 min，使用熒光倒置顯微鏡在相應(yīng)波長(zhǎng)下進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白的表達(dá) 1、3、5 mmol/L褪黑素和含0.1%的乙醇溶劑的MDA-MB-231 細(xì)胞處理24 h，以及使用3 mmol/L 的褪黑素聯(lián)合及不聯(lián)合1 mmol/L的3-MA處理細(xì)胞24 h，收集并裂解細(xì)胞，離心后取上清，對(duì)提取的蛋白進(jìn)行蛋白定量；將提取的蛋白采用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，采用5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉，加入各自的一抗在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。用TBST將膜清洗3次，每次5 min。然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，再用TBST 清洗3 次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，以GAPHD 作為參照，成像儀顯影，Quantity One軟件分析各蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤及致死原因，其發(fā)病率占女性總體癌癥發(fā)病的30%。乳腺癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、放療、化療，但都難以有效地控制，常規(guī)療法的有限療效以及嚴(yán)重的副作用，促使人們尋找基于天然產(chǎn)品和草藥提取物的新型抗癌藥物。褪黑素被認(rèn)為是生理性的腫瘤抑制劑，其毒性作用極低。關(guān)于褪黑素抗腫瘤的機(jī)制極為復(fù)雜，本研究通過(guò)研究褪黑素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新視野。

2.2 褪黑素抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和EMT進(jìn)程

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將MDA-MB-231細(xì)胞適量接種于6孔板中，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用3 mmol/L的褪黑素處理24 h，以加入0.1%乙醇溶劑的細(xì)胞作為對(duì)照組，使用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液后，預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，將沉淀按照Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

某體育場(chǎng)屋面鋼結(jié)構(gòu)采用預(yù)應(yīng)力懸索體系，其索結(jié)構(gòu)體系由吊索、脊索、谷索、環(huán)索及前后邊索組成，外環(huán)鋼結(jié)構(gòu)為鋼環(huán)桁架體系，外環(huán)鋼結(jié)構(gòu)平面尺寸為234.32m×267.27m，內(nèi)環(huán)尺寸為196.5m×135.88m，外環(huán)梁吊索、脊索、谷索節(jié)點(diǎn)都為72個(gè)，吊索節(jié)點(diǎn)處有2根吊索相交。體育場(chǎng)共用索17 726m，重732.42t。體育場(chǎng)屋面使用PTFE膜材，膜展開(kāi)面積約為30 000m2。

2.3 褪黑素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡

綜上分析，小花清風(fēng)藤扦插繁殖的最適條件為：選用健康粗壯的2～4年生莖條作為插穗，用150 mg/L生根粉水溶液浸泡30 min，扦插于珍珠巖∶草炭土=1∶1的基質(zhì)中，只要管理得當(dāng)，成活率可達(dá)90%以上，幼苗生長(zhǎng)良好。

2.4 褪黑素促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬發(fā)生

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將MDA-MB-231細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，用無(wú)菌的200 μL槍頭在每孔相同位置劃出劃痕，用PBS清洗掉劃落的細(xì)胞后，加入含有1、3、5 mmol/L褪黑素的無(wú)血清培養(yǎng)基，以加入0.1%乙醇的細(xì)胞作為對(duì)照組。分別在劃痕后的0、24 h，對(duì)細(xì)胞傷口處進(jìn)行拍照，記錄劃痕寬度。

褪黑素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡率增加，（＜0.01，圖3A）。通過(guò)Western blot檢測(cè)不同濃度褪黑素處理后的凋亡相關(guān)蛋白指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)水平隨褪黑素濃度增加而減少，凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平隨褪黑素濃度增加而增多，Bcl2/Bax的比值逐漸減低（＜0.05，圖3B）。

所謂跨文化管理中的文化沖突，是指造成溝通困難、理解錯(cuò)誤等文化沖突問(wèn)題源于不同形態(tài)的文化或者文化要素的載體之間的相互對(duì)立、相互排斥，從而產(chǎn)生不相容的沖突的過(guò)程.它既指企業(yè)在國(guó)際化經(jīng)營(yíng)過(guò)程中與所在國(guó)的文化觀念不同而產(chǎn)生的沖突，又包含了在一個(gè)企業(yè)內(nèi)部由于員工分屬不同文化背景，而造成互相之間的不理解、無(wú)法溝通而產(chǎn)生的沖突[2].文化沖突又常常會(huì)導(dǎo)致懷恨心理、極度保守和非理性反映等不良后果.

2.5 減少自噬可逆轉(zhuǎn)褪黑素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移抑制

從中央層面來(lái)看，政府制定了《民辦非企業(yè)單位登記暫行辦法》《民辦非企業(yè)單位登記管理暫行條例》等若干規(guī)范性文件，地方政府也經(jīng)常直接轉(zhuǎn)發(fā)中央下達(dá)的此類(lèi)文件。同時(shí)，各地方政府為了自身經(jīng)濟(jì)發(fā)展和政績(jī)考慮，也會(huì)試驗(yàn)性地出臺(tái)一些適應(yīng)本地區(qū)特色的政策，制定相應(yīng)的發(fā)展戰(zhàn)略并依此對(duì)社會(huì)組織進(jìn)行管理。隨著實(shí)踐的發(fā)展，相關(guān)的法律法規(guī)、規(guī)章政策也在相應(yīng)地修訂和調(diào)整，政策創(chuàng)新也在不斷進(jìn)行，以適應(yīng)新環(huán)境、新形勢(shì)的需求。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用褪黑素的細(xì)胞相比，自噬抑制劑3-MA和褪黑素聯(lián)合處理細(xì)胞后，Bcl2 表達(dá)增加，Bax、E-cadherin、Beclin1、LC3-II/LC3-I表達(dá)減少，Bcl2/Bax的比值增加（＜0.05），Snail雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其表達(dá)量也呈增加趨勢(shì)（=0.0538，圖5）。

3 討論

與對(duì)照組相比，褪黑素可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，具有濃度依賴(lài)性，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活力也逐漸降低，（＜0.05，圖1A），其24、48 h 的半數(shù)抑制率（）濃度分別是3.34 mmol/L、2.81 mmol/L。同時(shí)，集落形成實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明，與對(duì)照組相比，隨著褪黑素濃度的增加，細(xì)胞所形成的集落數(shù)逐漸減少（＜0.05，圖1B）。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的重要途徑。據(jù)報(bào)道，褪黑素對(duì)卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤具有抑制作用。本研究通過(guò)CCK-8、集落實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)褪黑素作用后的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的活力以及集落形成能力均被抑制，表明褪黑素對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有潛在抑制腫瘤的作用。為評(píng)估褪黑素抑制乳腺癌細(xì)胞是否由凋亡誘導(dǎo)，我們采用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)褪黑素作用后的乳腺癌細(xì)胞凋亡率增加，同時(shí)，通過(guò)Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。由于Bcl2和Bax是細(xì)胞凋亡的必需因子，Bcl2具有抑制凋亡的作用，而B(niǎo)ax可形成同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，Bcl2/Bax的比值被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞凋亡的開(kāi)關(guān)，兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)弱程度的關(guān)鍵因素，當(dāng)Bcl2/Bax 比值上調(diào)，能夠抑制細(xì)胞凋亡，Bcl2/Bax比值下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，比值的大小能夠反映凋亡的程度。本研究中的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)褪黑素處理后，Bcl2和Bax分別隨褪黑素濃度的遞增下調(diào)和上調(diào)，Bcl2/Bax的比值逐漸減低，說(shuō)明隨著褪黑素濃度的增加，褪黑素促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用越明顯，這與前面CCK-8、集落實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，與Nadir等使用褪黑素抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果一致。基于以上結(jié)果，表明褪黑素可通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)褪黑素處理后的細(xì)胞劃痕愈合的能力下降，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)伴隨著E-cadherin表達(dá)的降低和Snail的增加。由于EMT是發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，而EMT最重要的標(biāo)志性變化就是E-cadherin的減少和丟失，E-cadherin作為EMT中最重要的上皮標(biāo)志物，其表達(dá)的減少，被認(rèn)為與癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，Snail作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可直接作用于E-cadherin，通過(guò)直接滯留E-cadherin的表達(dá)，使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT，以上結(jié)果證明，經(jīng)褪黑素處理后的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力受到抑制，這也與Maroufi等使用褪黑素抑制乳腺癌干細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的研究結(jié)果相符合。總之，本研究證實(shí)了褪黑素能夠抑制MDAMB-231乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。

目前自噬在褪黑素抑制腫瘤中起著重大作用，且自噬在褪黑素抑制乳腺癌生長(zhǎng)中的作用尚不清楚。LC3作為自噬標(biāo)志物，LC3-II/LC3-I比值在一定程度上能夠反應(yīng)自噬程度，P62作為自噬降解蛋白參與清除細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚合物、受損的細(xì)胞器，可以與LC3相互作用，并通過(guò)自噬-溶酶體系統(tǒng)降解，Beclin1參與自噬起始階段，是形成自噬體的重要分子?；谝陨显颍狙芯客ㄟ^(guò)使用免疫熒光檢測(cè)了褪黑素處理MDAMB-231后P62和Beclin1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P62蛋白陽(yáng)性著色減弱，Beclin1 蛋白陽(yáng)性著色增強(qiáng)，同時(shí)，我們使用Western blot 檢測(cè)褪黑素作用MDA-MB-231 后LC3、P62 和Beclin1 的變化趨勢(shì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素可誘導(dǎo)LC3-II/LC3-I比值和Beclin1表達(dá)上調(diào)，P62表達(dá)降低，證實(shí)褪黑素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬發(fā)生。由于Beclin1與抗凋亡蛋白Bcl2具有相互作用，這也是細(xì)胞凋亡和自噬相互作用的重要連接點(diǎn)。本研究中，褪黑素通過(guò)下調(diào)Bcl2的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)伴隨著B(niǎo)eclin1的增加，說(shuō)明自噬極可能參與了褪黑素抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這與褪黑素治療睡眠剝奪小鼠模型中通過(guò)激活自噬抑制Bcl2的結(jié)果相似。

為證實(shí)自噬的發(fā)生是否參與褪黑素抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，我們?cè)诖嬖诩安淮嬖谧允梢种苿?-MA時(shí)，用褪黑素處理乳腺癌細(xì)胞，與僅作用褪黑素的細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)3-MA和褪黑素聯(lián)合處理的細(xì)胞中，Bcl2、Snail以及Bcl2/Bax的比值增加，Bax、E-cadherin、LC3-II/LC3-I以及Beclin1的表達(dá)減少，說(shuō)明由褪黑素誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移受抑可得到部分回復(fù)，這一結(jié)果進(jìn)一步提示自噬參與褪黑素抑制乳腺癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。Huang等發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞自噬，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制轉(zhuǎn)移，與本研究結(jié)果一致。

第一是管理會(huì)計(jì)的理論體系落后。當(dāng)前我國(guó)管理會(huì)計(jì)的理論內(nèi)容仍舊停留在上世紀(jì)70年代，而隨著管理會(huì)計(jì)技術(shù)的發(fā)展、企業(yè)生產(chǎn)要素的更新等等，都要求企業(yè)能夠?qū)崿F(xiàn)管理理論的更新?lián)Q代。但是事實(shí)上我國(guó)當(dāng)前仍舊未能夠根據(jù)市場(chǎng)發(fā)展的特點(diǎn)以及我國(guó)企業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀制定其中國(guó)特色的管理會(huì)計(jì)理論體系，從而有效的展開(kāi)大數(shù)據(jù)下的管理會(huì)計(jì)的內(nèi)容管理。

綜上所述，本研究以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了褪黑素在乳腺癌中的作用及潛在機(jī)制，重點(diǎn)在細(xì)胞自噬，結(jié)果表明，褪黑素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)，褪黑素抑制乳腺癌的行為是通過(guò)激活自噬發(fā)揮作用的。鑒于較大濃度褪黑素除使人產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和困倦外，對(duì)其他生理器官等等并無(wú)太大副作用，故本研究對(duì)褪黑素的相關(guān)機(jī)制研究，可為褪黑素治療乳腺癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。