結(jié)香多糖的提取工藝

陳銀華， 吳華芬， 曹鵬飛， 周斌雄， 徐偉忠

(麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000)

結(jié)香(EdgeworthiachrysanthaLindl．)別名黃花結(jié)香，是瑞香科結(jié)香屬植物，始載于《群芳譜》，主要分布在東亞地區(qū)，我國(guó)陜西、江蘇、安徽、浙江、江西、河南等地都有栽培，湖北、湖南、廣東、廣西、四川、云南等省區(qū)亦有種植[1]。結(jié)香一般種植在海拔400～1 000 m的地區(qū)[2]，只要土壤條件良好，結(jié)香生長(zhǎng)狀況無(wú)顯著差異。徐小牛等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，結(jié)香適生于疏松肥沃、排水良好的微酸性至中性的砂質(zhì)土壤。結(jié)香味甘、性溫，歸腎、肝經(jīng)，其根、莖、花可分別入藥，根和莖具有舒筋活絡(luò)，消腫止痛功效；花具有養(yǎng)陰安神、明目、祛障翁的功效[1,4]。隨著研究的深入，結(jié)香品質(zhì)和藥效問(wèn)題日益受到世人重視。越來(lái)越多的科研人員對(duì)結(jié)香的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用這種植物資源提供參考。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，用結(jié)香花研制殺蟲(chóng)藥效果較好[5]。Ohigashi等[6]報(bào)道了結(jié)香植物成分可誘發(fā)EB病毒的活性。Walter等[7]發(fā)現(xiàn)，結(jié)香的根能用來(lái)治療毒蛇咬傷。此外，結(jié)香中所含有的丁香甙具有抗疲勞、抑郁，提高腦部血液循環(huán)、性能力，抑制葡萄糖代謝等其他生理活性[8-9]。王淑芳等[10]報(bào)道結(jié)香中含有的結(jié)香苷C、紫云英苷和蘆丁等化合物還具有抗凝血、抗菌、抗炎和抗氧化作用，可以用于治療糖尿病、血管硬化和視網(wǎng)膜炎，可見(jiàn)結(jié)香全身是寶，對(duì)于研究結(jié)香化學(xué)物質(zhì)的提取有重要的意義。

多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過(guò)10個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，是自然界含量豐富的天然大分子物質(zhì)之一，與人類(lèi)生活緊密相關(guān)，對(duì)維持生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用，和蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)構(gòu)成了最基本的4類(lèi)生命物質(zhì)。結(jié)香含有豐富的VA、VB、VC以及鐵、鉀、鋅、鈣等微量元素。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)結(jié)香化學(xué)成分的研究報(bào)道不多，從本次實(shí)驗(yàn)以及查閱的文獻(xiàn)[5,9]來(lái)看，結(jié)香中含有大量多糖成分，其生理活性具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒、松弛平滑肌、抗凝血等作用。因此，對(duì)于結(jié)香多糖提取工藝的研究具有重要的意義。

目前，植物多糖的提取方法較多，主要有水提法、堿提法、酸提法、酶法、超濾法、超聲提取、CO2超臨界萃取等[11]。其中，熱水提取法是一種比較通用的方法，因其提取工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低而受到廣泛使用。有關(guān)結(jié)香多糖提取工藝條件的優(yōu)化鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究以結(jié)香花為材料，以多糖提取率為考察指標(biāo)，在單因素條件下研究料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度和醇沉比對(duì)多糖提取的影響，再通過(guò)二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)法選出結(jié)香多糖提取的最佳提取工藝，為結(jié)香的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的材料為結(jié)香花，2018年3月采自遂昌縣高坪鄉(xiāng)茶樹(shù)坪村，60～80 ℃烘干，磨成粉末備用。

1.1.2 儀器

Scout SL電子天平(上海申安醫(yī)療器械廠)；HHS型電熱恒溫水浴箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；TDL240B離心機(jī)(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；DHG29053BS2Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；723C可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.3 試劑

5%苯酚、95%乙醇、95%濃硫酸，以上試劑均為分析純。

1.2 結(jié)香多糖的提取工藝流程

稱(chēng)取預(yù)處理后的結(jié)香花的粉末0.5 g分別放入5個(gè)100 mL錐形瓶→加水(蒸餾水)浸提→4 000 r·min-1離心10 min，取上清液放入錐形瓶→加95%乙醇→4 ℃靜置22 h過(guò)夜→10 000 r·min-1離心10 min，取沉淀物(粗多糖)→溶于水?dāng)嚢杌靹颉鷾y(cè)定結(jié)香多糖含量。

1.3 苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精確稱(chēng)取105 ℃干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，得濃度為1 mg·mL-1的葡萄糖貯備液。準(zhǔn)確移取葡萄糖貯備液10 mL，用蒸餾水定容至100 mL，得0.1 mg·mL-1的葡萄糖使用液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取上述0.1 mg·mL-1的葡萄糖使用液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6支10 mL試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸，室溫下放置30 min。另以2.0 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，所有操作均與上述相同，測(cè)定490 nm下吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=7.348 6X-0.098 7(R2=0.978 5)。

1.3.3 多糖含量與提取率的測(cè)定

在粗多糖樣品中加入10 mL蒸餾水，使多糖完全溶解在蒸餾水中。用移液槍精密吸取樣品液100 μL，于490 nm下測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求樣品粗多糖的含量。

1.4 結(jié)香多糖提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 浸提固液比的選擇

稱(chēng)取5份均為0.5 g的結(jié)香粉末，先置于5個(gè)潔凈的錐形瓶中，再按固液比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 g·mL-1加入蒸餾水，標(biāo)記好置于80 ℃水浴鍋中浸提3 h。浸提之后將浸提液在4 000 r·min-1下離心10 min，將上清液按醇沉比3∶1放入4 ℃冰箱醇沉22 h后，在相同轉(zhuǎn)速條件下離心10 min，棄上清，溶于10 mL蒸餾水中，精密吸取樣品液100 μL于490 nm下測(cè)定吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品粗多糖的含量。

1.4.2 浸提溫度的選擇

在其他參數(shù)保持不變的情況下(結(jié)香花粉末0.5 g、固液比40∶1 g·mL-1)分別在60、70、80、90和100 ℃下浸提3 h，再把浸提液離心10 min，取上清液，加入3∶1的醇沉比在4 ℃冰箱中醇沉22 h，4 000 r·min-1下離心10 min，得粗多糖。將粗多糖溶于10 mL蒸餾水中，精密吸取樣品液100 μL于490 nm下測(cè)定吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品粗多糖的含量。

1.4.3 浸提時(shí)間的選擇

稱(chēng)取5份結(jié)香花粉末，每份0.5 g，浸提時(shí)間分別為1、2、3、4和5 h，放入95 ℃水浴鍋中(其他條件同上)進(jìn)行浸提，浸提后的提取液用3倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀，在4 ℃冰箱中醇沉22 h，4 000 r·min-1下離心10 min，得粗多糖。將粗多糖溶于10 mL蒸餾水中，精密吸取樣品液100 μL于490 nm下測(cè)定吸光度，測(cè)量求出提取率以比較不同時(shí)間對(duì)結(jié)香多糖的影響。

1.4.4 浸提醇沉比的選擇

在固液比40∶1 g·mL-1，溫度80 ℃下浸提3 h，浸提液離心后將所得的上清液分別按醇沉比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1放入4 ℃冰箱醇沉22 h，4 000 r·min-1下離心10 min，得粗多糖，將粗多糖溶于10 mL蒸餾水中，精密吸取樣品液100 μL于490 nm下測(cè)定吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品粗多糖的含量。

1.5 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定因素編碼水平范圍，以多糖提取率為指標(biāo)，以料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間、浸提醇沉比為考察因素，進(jìn)行4因素5水平(全實(shí)施)二次正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中各處理的多糖含量通過(guò)方差分析和多重比較，確定處理間的差異。所有數(shù)據(jù)分析均用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件完成[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素

2.1.1 料液比

在浸提溫度為80 ℃，浸提時(shí)間為3 h，醇沉比1∶3的條件下，研究料液比對(duì)結(jié)香花多糖提取效率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。在料液比為1∶20～1∶40 g·mL-1時(shí)，多糖的含量呈增加趨勢(shì)，增加明顯，在料液比為1∶40 g·mL-1時(shí)，多糖含量達(dá)到最大值，可達(dá)到12.22 mg·g-1。但隨著料液比的繼續(xù)減小，多糖的提取效率大幅度下降，在料液比達(dá)到1∶50 g·mL-1時(shí)，隨著料液比減小下降趨勢(shì)逐漸平緩。這是因?yàn)榧铀吭蕉?，樣品在溶液中的分散度越大，接觸面積也越大，有利于提取。但當(dāng)加水量達(dá)到一定程度后，再增加水量時(shí)，多糖提取率卻大幅度下降，可能是多余的提取劑也可以破壞結(jié)香細(xì)胞，使得細(xì)胞膜受到損害，造成細(xì)胞液或者其他的成分溶出，這樣溶液的顏色會(huì)發(fā)生改變而致使測(cè)定結(jié)果降低。顯然隨著料液比的減小，提取多糖的成本也會(huì)相應(yīng)的增大，因?yàn)樗谋壤^(guò)大，增加了濃縮處理的工作量和能耗，不利于實(shí)際操作和生產(chǎn)[13]，因此，結(jié)香花多糖提取的料液比在1∶40 g·mL-1為宜。

圖1 料液比對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響

2.1.2 浸提溫度

在料液比為1∶40 g·mL-1，醇沉比1∶3，浸提時(shí)間為3 h的條件下，研究溫度對(duì)結(jié)香花多糖提取效率的影響，如圖2所示。在60～70 ℃，多糖的提取率基本保持相同水平。隨著水浴溫度的升高，分子的熱運(yùn)動(dòng)加快，糖從結(jié)香細(xì)胞中的溶出率增加，提取含量有明顯的上升趨勢(shì)，而溫度達(dá)到90 ℃以上時(shí)，多糖含量的增加比較緩。由于多糖是活性物質(zhì)，溫度過(guò)高就會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，影響其活性，因此，提取溫度以90 ℃為宜。

圖2 溫度對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響

2.1.3 浸提時(shí)間

在料液比為1∶40 g·mL-1，醇沉比1∶3，浸提溫度為95 ℃的條件下，研究浸提時(shí)間對(duì)多糖提取效率的影響。結(jié)果如圖3所示，在前3 h內(nèi)，多糖的含量呈大幅度上升趨勢(shì)；而在3～4 h多糖提取率上升減緩，4 h時(shí)達(dá)到最大值15.586 1 mg·g-1，4～5 h逐漸下降。這是因?yàn)榻Y(jié)香多糖的提取實(shí)際上是一個(gè)擴(kuò)散的過(guò)程，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，梯度差越來(lái)越小，擴(kuò)散的速度也就越來(lái)越慢，所以一定溫度范圍內(nèi)延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于多糖的充分浸出。但又因?yàn)榻Y(jié)香多糖的還原性比較強(qiáng)，若提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)被空氣中的氧氣氧化，使多糖的氧化加重或發(fā)生降解反應(yīng)，導(dǎo)致提取量下降。因此，選擇4 h的浸提時(shí)間為最佳。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響

2.1.4 醇沉比

在料液比為1∶40 g·mL-1，浸提時(shí)間為3 h，浸提溫度為80 ℃的條件下，研究醇沉比對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響。由圖4可以看出，隨著乙醇與多糖濃縮液比例的增加，多糖得率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)醇沉比達(dá)到5∶1后，多糖得率下降。因此，醇沉比選擇5∶1時(shí)效果最佳。

圖4 醇沉比對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響

2.2 優(yōu)化工藝

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，針對(duì)傳統(tǒng)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)，以多糖提取率為指標(biāo)，取料液比(X2)、溫度(X3)、時(shí)間(X4)和醇沉比(X1)作為考察因素，采用了二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)結(jié)香多糖提取工藝的主要影響因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。因素+2～-2水平編碼值：X1分別為4.5、4.0、3.5、3.0和2.5；X2分別為45、40、35、30和25；X3分別為100、95、90、85和80 ℃；X4分別為4.5、4.0、3.5、3.0和2.5 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 二次回歸方程的建立與檢驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件，建立結(jié)香多糖提取率與影響因素間的二次回歸模型，其回歸方程為：Y=17.692 16+4.223 26X1-0.140 27X2+4.039 37X3-0.062 30X4-0.248 55X12+3.688 06X22+6.609 47X32+4.740 11X42-6.581 41X1X2+5.285 97X1X3+0.234 61X1X4+0.284 80X2X3+0.168 54X2X4-0.051 67X3X4。

經(jīng)方差分析表明，回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F1=2.798 54(P>0.05)不顯著，即方程的擬合性較好；回歸方程的顯著性檢驗(yàn)(F2=657.694 59，P<0.01)極顯著，說(shuō)明方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的配合是可行的。方程回歸結(jié)果可靠，可用于結(jié)香多糖熱水提取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。對(duì)二次回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得到的一次項(xiàng)系數(shù)X1、X3為極顯著，X2、X4不顯著，表明溫度、醇沉比是多糖提取率的主要影響因素，時(shí)間和料液比為次要影響因素。二次項(xiàng)系數(shù)當(dāng)中，X22、X32、X42為極顯著因素，X12不顯著，X1X2、X1X3極顯著，X1X4、X2X3、X2X4、X3X4不顯著。

在α=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，得到簡(jiǎn)化后的回歸方程為：Y=17.692 16+4.223 26X1+4.039 37X3-0.248 55X12+3.688 06X22+6.609 47X32+4.740 11X42-6.581 41X1X2+5.285 97X1X3。

表1 二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及結(jié)香多糖提取結(jié)果

2.2.3 主因素效應(yīng)

根據(jù)回歸方程的一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值來(lái)比較各個(gè)因素之間的主次關(guān)系，可得到醇沉比>溫度>料液比>時(shí)間。因此，醇沉比是影響多糖提取率的最顯著因素。

2.2.4 單因素效應(yīng)

對(duì)單因素效應(yīng)進(jìn)行研究，分析X1、X2、X3、X4對(duì)結(jié)香多糖得率的影響，即固定醇沉比、料液比、溫度及時(shí)間這4個(gè)影響因素中的任意3個(gè)為零，研究其中一個(gè)對(duì)多糖得率的影響。結(jié)果如圖5所示，對(duì)于浸提醇沉比，從低水平到高水平，多糖提取率一直在增加。在低因素水平間，多糖提取率隨著浸提溫度、料液比和浸提時(shí)間的增加而下降，并在0因素水平達(dá)到最小值。在高因素水平間，多糖的提取率又隨醇沉比、料液比、浸提時(shí)間的增加而增加，由此可見(jiàn)，醇沉比對(duì)多糖提取的影響極其顯著。

圖5 各因素對(duì)多糖提取率的影響

2.2.5 兩因素間的互作效應(yīng)

從回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可以看出，由此可直觀地分析醇沉比分別對(duì)料液比和溫度兩因素對(duì)多糖提取率的互作效應(yīng)。

從圖6可以看出，在醇沉比的低水平下，多糖的提取率隨料液比的減小而增加，當(dāng)醇沉比慢慢增大時(shí)，隨著料液比的減小，多糖提取率先降低后升高，而且下降的幅度在明顯增加。當(dāng)醇沉比在高水平時(shí)，隨著料液比的減小，多糖的提取率則一直呈下降趨勢(shì)。當(dāng)料液比在高水平時(shí)，隨著醇沉比的增加多糖的提取率漸漸下降，且下降的幅度越來(lái)越緩，在高水平的料液比時(shí)隨著醇沉比的增加，多糖的提取率則大幅度的增加。從兩個(gè)因素的共同作用可以顯示，隨著料液比的減小和醇沉比的增加，多糖的提取率是在漸漸減少的?？紤]到實(shí)際情況，綜合考慮成本問(wèn)題，選擇低水平的料液比，低水平的醇沉比或者著高水平的醇沉比，低水平的料液比是較合理的。

圖6 料液比與醇沉比的互作效應(yīng)

從圖7可以看出，在高水平的醇沉比時(shí)，隨著浸提溫度的升高，多糖的提取率先緩慢下降，后又大幅度地升高。而當(dāng)醇沉比水平減小時(shí)，隨著浸提溫度升高，多糖提取率的下降幅度越來(lái)越大。當(dāng)醇沉比處與低水平時(shí)，隨著溫度的升高，多糖得率先大幅度下降后又緩慢上升。當(dāng)浸提溫度處于高水平時(shí)，隨著醇沉比的增加多糖的得率呈直線上升趨勢(shì)。而溫度處于低水平時(shí)，隨著醇沉比的增加多糖的得率呈緩慢的下降趨勢(shì)，下降幅度非常小。從兩因素的相互作用可以看出，選擇高水平的浸提溫度和高水平的醇沉比比較合理。

圖7 浸提溫度與醇沉比的互作效應(yīng)

2.2.6 提取條件的優(yōu)化

通過(guò)DPS軟件分析，對(duì)數(shù)學(xué)回歸模型分析后可得最佳提取工藝條件：醇沉比3.6∶1，料液比1∶35 g·mL-1，浸提溫度90 ℃，浸提時(shí)間3.5 h，預(yù)測(cè)值為18.34 mg·g-1。

3 討論

近年來(lái)，對(duì)多糖產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)相當(dāng)熱門(mén)，大量藥理及臨床研究證實(shí)，多糖有調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗肥胖、降膽固醇等生理功能，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及功能食品，作為綠色生物醫(yī)藥產(chǎn)品具有廣闊的市場(chǎng)前景[14]。有關(guān)植物多糖的研究進(jìn)展十分迅速，它的研究已成為糖生物學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)?，F(xiàn)在對(duì)于植物多糖的提取方法很多，水提法、堿提法、酸提法、酶法、超濾法、超聲提取、CO2超臨界萃取等[11]。而熱水提取法作為目前提取多糖比較通用的方法，因其提取工藝簡(jiǎn)單、不需要特殊的設(shè)備、生產(chǎn)成本低適用于工業(yè)化生產(chǎn)而受到廣泛使用。

本文采用的是熱水提取法對(duì)結(jié)香多糖提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比和醇沉比4個(gè)單因素進(jìn)行研究，再通過(guò)二次正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

3.1 料液比對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響

對(duì)于料液比這一影響因素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比的減小，多糖的含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。這是因?yàn)榧铀吭蕉?，樣品在溶液中的分散度越大，接觸面積也越大，有利于提取。但當(dāng)加水量達(dá)到一定程度后，再增加水量時(shí)，多糖提取率卻大幅度下降。顯然隨著料液比的減小，提取該多糖的成本也會(huì)相應(yīng)的增大，因?yàn)樗谋壤^(guò)大，增加了濃縮處理的工作量和能耗，不利于實(shí)際操作和生產(chǎn)。如虎皮蘭多糖提取工藝的優(yōu)化中，最佳的料液比為1∶30 g·mL-1[15]。仙人掌多糖提取工藝研究中，最佳料液比為1∶30 g·mL-1[16]。五味子分離多糖提取工藝的研究中，最佳料液比在1∶40 g·mL-1[17]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，料液比對(duì)結(jié)香多糖的提取有極顯著影響，考慮到生產(chǎn)成本，最終確定最佳浸提料液比為1∶35 g·mL-1。

3.2 溫度對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響

對(duì)于浸提溫度這一影響因素，多數(shù)多糖的提取率在一定溫度范圍內(nèi)是隨著溫度的提高先升高后降低，因此，在選擇溫度時(shí)，溫度不宜過(guò)低。根據(jù)文獻(xiàn)記載的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，長(zhǎng)時(shí)間高溫浸提會(huì)使部分多糖活性被破壞[18]，而不同種類(lèi)的多糖也具有不一樣的耐熱性。如耐熱性較好的豆渣[19]可在120～150 ℃進(jìn)行多糖的提取，而且在這個(gè)溫度水平提取率是最佳的。耐熱性相對(duì)較差的枇杷葉[20]、板栗[21]、葵花籽[22]等要在30～60 ℃進(jìn)行多糖的提取。而結(jié)香的耐熱性也較強(qiáng)，在90 ℃的溫度條件下提取多糖較為適宜。

3.3 時(shí)間對(duì)結(jié)香多糖提取率的影響

對(duì)浸提時(shí)間這一因素，我們知道多糖的溶解需要時(shí)間，一方面浸提的時(shí)間太短，只有表面部分的多糖溶出，材料內(nèi)部需要一定的溶脹時(shí)間，然后內(nèi)部的多糖才會(huì)溶出；另一方面，長(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)有條件上的不穩(wěn)定，增加了提取液中雜質(zhì)的含量，影響多糖的活性。綜合考慮多糖的提取率與能耗的問(wèn)題，本文最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇3.5 h為最佳浸提時(shí)間。

3.4 醇沉比對(duì)結(jié)香多糖提取的影響

醇沉比對(duì)結(jié)香多糖的影響也很顯著，隨著醇沉比的增加，提取率先提高后又降低。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因，可能隨著結(jié)香多糖的溶解，已在乙醇溶液中達(dá)到飽和，到了結(jié)香多糖的最大溶解度后，隨著乙醇溶液的增加不再變化了。因此，我們最后選擇醇沉比為3.6∶1為結(jié)香提取的最佳值。

3.5 結(jié)香多糖提取工藝的二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)

二次正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[23]是正交回歸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種，它具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，計(jì)算簡(jiǎn)便，且能根據(jù)預(yù)測(cè)值直接尋求最優(yōu)區(qū)域的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)精心設(shè)計(jì)、實(shí)施的回歸設(shè)計(jì)，可提供大量的信息，可以從許多角度對(duì)模型進(jìn)行模擬分析，以充分發(fā)掘模型所提供的信息[24]。近年來(lái)，該法雖廣泛用于農(nóng)業(yè)、生物、化工等領(lǐng)域，取得了較好的效果，但關(guān)于結(jié)香水溶性多糖提取工藝條件的優(yōu)化鮮見(jiàn)報(bào)道，本文通過(guò)二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，安排4個(gè)因子作二次正交回歸實(shí)驗(yàn)，獲得結(jié)香多糖的提取率4個(gè)實(shí)驗(yàn)因子的正交回歸模型。運(yùn)用回歸設(shè)計(jì)的理論和方法，通過(guò)DPS數(shù)據(jù)系統(tǒng)處理，最后得到醇沉比、料液比、溫度、時(shí)間與多糖提取率的數(shù)學(xué)模型最終確定了最佳的提取工藝條件：醇沉比3.6∶1、料液比1∶35 g·mL-1、浸提溫度90 ℃，浸提時(shí)間3.5 h，在此條件下提取的結(jié)香多糖的含量平均可達(dá)到18.34 mg·g-1，優(yōu)化了結(jié)香多糖的提取工藝，得到了更為精確的參數(shù)。李昕等[25]同樣在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法得到白術(shù)水溶性多糖最佳提取工藝。與正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)相比，二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)更有利于得到精確的參數(shù)。二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的特點(diǎn)使其在需要高精準(zhǔn)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)中的地位尤為突出。