新疆藥桑葚酵素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型及其發(fā)酵比速率的研究

呂明珊，袁藝洋，邢軍，王亮，茹先古麗·買買提依明，艾合買提江·艾海提*

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642)

新疆藥桑，屬桑科(Moraceac)、桑屬(MorusL.)、黑桑種(MorusnigraL.)，是新疆特有生長(zhǎng)環(huán)境下的原始桑種資源[1]。藥桑葚是其成熟果實(shí)，性寒、無(wú)毒，有消炎、補(bǔ)血、鎮(zhèn)靜等功效，對(duì)治療耳眼不靈、內(nèi)熱消渴、精神狀態(tài)不佳、便秘、風(fēng)濕導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛均有療效[2]。桑葚是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的漿果果實(shí)，其富含多酚類化合物[3-4]，有研究表明新疆藥桑葚的營(yíng)養(yǎng)成分如多糖、黃酮[5]含量都高于其他桑葚?，F(xiàn)今，由果蔬汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵得到的酵素產(chǎn)品逐漸受到眾人的關(guān)注。果漿在經(jīng)過發(fā)酵后富含各種有機(jī)酸[6]、多酚類化合物、超氧化物歧化酶等。且果蔬汁經(jīng)過發(fā)酵后較好地豐富了其原本的口感，發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物還能起到調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)消化、抗炎、抗氧化[7]等作用。

目前，以藥桑葚為原料的產(chǎn)品有藥桑罐頭、藥桑果汁、果酒、果醋和果醬等，但藥桑葚酵素這種生物發(fā)酵制品卻極為罕見，與之相關(guān)的文獻(xiàn)也寥寥可數(shù)，并且對(duì)于藥桑葚酵素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究也未見報(bào)道。藥桑葚果味濃厚、香氣濃郁，含糖量及總酸含量均高于其他桑葚，但是藥桑葚果實(shí)屬于季節(jié)性收獲的，結(jié)構(gòu)脆弱且極易受到擠壓和易腐爛[8]，不過這些看似不利的條件使藥桑葚有著非常杰出的發(fā)酵基礎(chǔ)。利用藥桑葚制成酵素不但能滿足人們對(duì)于營(yíng)養(yǎng)和保健的需求，還能解決藥桑葚貨架期短、不易運(yùn)輸?shù)葐栴}[9]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)藥桑葚酵素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究，對(duì)探索和優(yōu)化藥桑葚酵素混菌發(fā)酵的優(yōu)良釀造工藝、混菌發(fā)酵酵素的擴(kuò)大化生產(chǎn)和質(zhì)量把控及市場(chǎng)開發(fā)有著積極的意義。

在食品發(fā)酵領(lǐng)域，研究者們采用數(shù)學(xué)模型來(lái)描述和預(yù)測(cè)發(fā)酵過程中的菌密度、生成物濃度和底物濃度等主要代謝指標(biāo)的變化規(guī)律，例如，Logistic 模型[10]、SGompertz[11]模型和Boltzmann模型[12]，從而為發(fā)酵液的發(fā)酵過程工藝優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)工業(yè)生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的放大提供了理論基礎(chǔ)。本研究以乳酸菌為發(fā)酵菌株，將藥桑葚果漿酶解后進(jìn)行乳酸菌無(wú)氧發(fā)酵并測(cè)定發(fā)酵過程中乳酸菌生長(zhǎng)變化、還原糖和總酸含量變化，采用Logistic模型、Boltzmann模型、SGompertz模型和DoseResp模型對(duì)藥桑葚酵素發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、總酸生成、還原糖消耗情況進(jìn)行擬合，并依據(jù)相關(guān)系數(shù)判斷其可靠性，為進(jìn)一步擴(kuò)大化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葚：新疆阿克蘇地區(qū)庫(kù)車市生產(chǎn)；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)bio-52962、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)bio-114001：中國(guó)微生物菌種保藏中心；MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶：諾維信有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KX-101恒溫干燥箱、RH-QG全溫振蕩器(搖床) 江蘇科析儀器有限公司；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；1004分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；LS-150LD立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺(tái) 上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；UV752紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥桑葚酵素工藝流程

新鮮的藥桑葚→預(yù)處理→破碎機(jī)打漿→酶解→85 ℃滅酶30 min→冷卻至37 ℃→菌種經(jīng)活化擴(kuò)大培養(yǎng)后接種→37 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)發(fā)酵→終止發(fā)酵(110 ℃滅菌20 min)→室溫下冷卻→生產(chǎn)線罐裝→4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏。

1.3.1.1 菌種活化及培養(yǎng)

乳酸菌：MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)乳酸菌24 h，將乳酸菌繼續(xù)傳代2次，備用。

1.3.1.2 藥桑葚發(fā)酵液的發(fā)酵過程

選取紫色成熟的藥桑葚，剔除病害部分。使用破壁機(jī)打漿，將果汁放入1000 mL三角瓶中，酶添加量0.4 °Brix(果膠酶∶纖維素酶∶半纖維素酶為2∶1∶1)，然后放置在55 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)酶解3.5 h，85 ℃滅酶30 min，冷卻至37 ℃接種，在1 L補(bǔ)料瓶?jī)?nèi)接種，接種量為藥桑葚發(fā)酵液內(nèi)菌密度6×106CFU/mL。密封隔絕空氣進(jìn)行厭氧發(fā)酵定時(shí)于無(wú)菌室超凈間內(nèi)取樣檢測(cè)。

1.3.2 乳酸菌計(jì)數(shù)

在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將發(fā)酵液取出0.5 mL用無(wú)菌水稀釋10倍，用無(wú)菌移液槍移取稀釋發(fā)酵液滴于血球計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.3 總酸含量測(cè)定

參照GB 12456-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》測(cè)定總酸含量[13]。

1.3.4 還原糖含量的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖的質(zhì)量濃度[14]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=5511x-0.0126，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3個(gè)平行，結(jié)果取其平均值，采用 Origin 9.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖分析，選取合適的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)乳酸菌體生長(zhǎng)、還原糖基質(zhì)消耗和總酸產(chǎn)量生成情況進(jìn)行非線性擬合，并利用每個(gè)模型的擬合系數(shù)R2作為可靠性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選出擬合度高的動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行定量描述。

1.4.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

乳酸菌菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型擬合：乳酸菌菌體的生長(zhǎng)呈S形曲線，故采用Logistic、SGompertz和 DoseResp模型進(jìn)行非線性擬合，選取擬合系數(shù)R2最大的模型用于描述乳酸菌體生長(zhǎng)規(guī)律。

總酸產(chǎn)量生成動(dòng)力學(xué)模型擬合：有機(jī)酸是乳酸菌轉(zhuǎn)化糖類代謝而生成的產(chǎn)物。有機(jī)酸生成速率與乳酸菌生長(zhǎng)速率的相關(guān)性屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型，其增長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)出與乳酸菌菌體生長(zhǎng)相似的S形曲線，故選用Logistic、SGompertz和DoseResp模型對(duì)其進(jìn)行非線性擬合，選用擬合系數(shù)最大的模型描述總酸產(chǎn)量生成。

還原糖含量消耗動(dòng)力學(xué)模型擬合：乳酸菌發(fā)酵藥桑葚酵素過程中，還原糖在乳酸菌發(fā)酵過程中主要被轉(zhuǎn)化成乳酸等有機(jī)酸，因此選用模型中的Logistic、Boltzmann和DoseResp模型進(jìn)行非線性擬合，選用擬合系數(shù)R2最大的模型描述還原糖消耗情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥桑葚酵素發(fā)酵過程中乳酸菌密度、還原糖含量和總酸含量變化趨勢(shì)

乳酸菌混菌發(fā)酵藥桑葚果漿過程中，乳酸菌數(shù)、還原糖含量和總酸含量變化見圖 1。

圖1 藥桑葚酵素發(fā)酵過程中乳酸菌生長(zhǎng)、還原糖基質(zhì)含量和發(fā)酵液內(nèi)總酸含量變化趨勢(shì)Fig.1 The change trend of lactic acid bacteria growth, reducing sugar substrate content and total acid content of fermentation liquid during the fermentation process of Morus nigra L. enzyme

由圖1可知，發(fā)酵初期6 h前，乳酸菌產(chǎn)酸速度緩慢，發(fā)酵4～6 h，還原糖消耗2.43 g/L，總酸增長(zhǎng)0.21 g/L，這可能是因?yàn)槿樗峋M(jìn)入新的生長(zhǎng)環(huán)境需要適應(yīng)與培養(yǎng)基不同的pH和單糖濃度[15]。酵素發(fā)酵6 h后，乳酸菌生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)期，還原糖迅速在2 h內(nèi)消耗11.07 g/L，總酸含量在2 h內(nèi)迅速增加了0.44 g/L。經(jīng)歷指數(shù)生長(zhǎng)期后，發(fā)酵時(shí)間16 h末時(shí)生物量從初始值5×106CFU/mL增加到最高值8.47×108CFU/mL。發(fā)酵液中的還原糖含量從初始值123.33 g/L降至90.12 g/L，從而使有機(jī)酸產(chǎn)生，總酸從初始值26.17 g/L增加至27.79 g/L。16 h后由于還原糖含量下降，總酸含量過高，pH值過低，抑制菌群生長(zhǎng)，乳酸菌比生長(zhǎng)速率下降，乳酸菌于18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，乳酸菌數(shù)量最高達(dá)8.66×108CFU/mL。

2.2 藥桑葚酵素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.2.1 乳酸菌菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

乳酸菌數(shù)在不同模型下的擬合方程及擬合系數(shù)見表1。Logistic 模型、SGompertz 模型和DoseResp 3種模型對(duì)乳酸菌菌體生長(zhǎng)情況的非線性擬合結(jié)果見圖2。

表1 乳酸菌生長(zhǎng)擬合方程及相關(guān)系數(shù)

由表1可知，擬合模型的相關(guān)系數(shù)R2值均接近1，其中Logistic模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.99975，SGompertz 模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.99945，DoseResp模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.99925。最接近1的Logistic模型能更好地預(yù)測(cè)藥桑葚酵素中乳酸菌的生長(zhǎng)狀況，其擬合曲線見圖2中a。

a.Logistic模型擬合曲線

2.2.2 還原糖基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型

采用Logistic模型、DoseResp模型和 Boltzmann 模型對(duì)藥桑葚酵素發(fā)酵過程中還原糖基質(zhì)消耗情況進(jìn)行擬合，擬合曲線見表2和圖3。

表2 還原糖消耗擬合方程及擬合系數(shù)Table 2 Reducing sugar consumption fitting equation and fitting coefficient

a.Logistic模型擬合曲線

由圖3可知，3種模型擬合下的還原糖消耗曲線趨勢(shì)基本一致，其中DoseResp模型和Boltzmann模型驗(yàn)證所得參數(shù)相同，且其相關(guān)系數(shù)R2=0.99512相較于Logistic模型的R2=0.9948更接近于1，故DoseResp模型和 Boltzmann 模型均可用于定量描述和預(yù)測(cè)藥桑葚酵素發(fā)酵過程中還原糖基質(zhì)消耗情況，擬合曲線見圖3中b和c。

2.2.3 總酸含量動(dòng)力學(xué)模型

采用Logistic模型、DoseResp模型和SGompertz 模型對(duì)藥桑葚酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化情況進(jìn)行擬合，由表3可知，Logistic模型和DoseResp模型擬合曲線趨勢(shì)相似且R2都在0.997以上，SGompertz模型擬合曲線相較前兩種模型擬合效果欠佳，故選用R2最接近1的Logistic模型對(duì)藥桑葚酵素發(fā)酵過程中總酸生成情況進(jìn)行定量描述，擬合曲線見圖4中a。

表3 總酸生成擬合方程及擬合系數(shù)

a.Logistic模型擬合曲線

2.3 藥桑葚酵素發(fā)酵過程中比生長(zhǎng)速率、比消耗速率和比增長(zhǎng)速率的研究

由圖5可知，在限制性條件下發(fā)酵的乳酸菌菌體生長(zhǎng)的初期受發(fā)酵液pH和底物濃度影響使其菌體生長(zhǎng)速度緩慢，適應(yīng)期結(jié)束后菌體生長(zhǎng)速度變快，隨后乳酸菌生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，接著比生長(zhǎng)速率逐漸降低甚至菌體停止生長(zhǎng)，乳酸菌比生長(zhǎng)速率呈鐘形曲線。乳酸菌比生長(zhǎng)速率表示每小時(shí)單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量[16]。由圖5可知，酵素內(nèi)總酸含量的生成與菌體生長(zhǎng)顯現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性系，為生長(zhǎng)偶聯(lián)型關(guān)系[17]。由圖1可知，乳酸菌在0～16為快速生長(zhǎng)期，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，乳酸菌數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)增加無(wú)明顯變化，此時(shí)發(fā)酵結(jié)束。結(jié)合圖5還原糖比消耗速率曲線可知，乳酸菌在生長(zhǎng)穩(wěn)定期，其葡萄糖的比消耗速率隨發(fā)酵時(shí)間的增加而變化，其比消耗速率與乳酸菌比生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。

圖5 藥桑葚酵素發(fā)酵過程中比生長(zhǎng)速率、還原糖消耗速率和總酸生成速率隨時(shí)間的變化曲線Fig.5 The specific growth rate, reducing sugar consumption rate and total acid production rate during the fermentation process of mulberry enzymes with time

3 結(jié)論

目前發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)小罐生產(chǎn)方面的應(yīng)用愈發(fā)廣泛，但對(duì)于藥桑葚酵素相關(guān)產(chǎn)品的研究較少，利用多種乳酸菌混菌發(fā)酵制備藥桑葚酵素的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以新疆藥桑葚為原料，打漿酶解后放入多種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液色澤呈紫紅色，果香濃厚，酸甜可口。在藥桑葚酵素發(fā)酵過程中對(duì)菌生長(zhǎng)量、總酸含量和還原糖含量進(jìn)行測(cè)定，在整個(gè)酵素發(fā)酵過程中菌生長(zhǎng)量、總酸含量和還原糖含量互相關(guān)聯(lián)，發(fā)酵進(jìn)行到6 h后菌生長(zhǎng)量迅速增長(zhǎng)，總酸含量也隨之增加,而還原糖含量在同一時(shí)期下降。發(fā)酵結(jié)束后(18 h)酵素中還原糖含量降至90.12 g/L，發(fā)酵液內(nèi)總酸含量增加至27.79 g/L。利用Logistic 模型、SGompertz 模型、DoseResp模型和Boltzmann 模型對(duì)菌生長(zhǎng)量、總酸含量和還原糖含量進(jìn)行非線性擬合，發(fā)現(xiàn)Logistic 模型、DoseResp模型和Boltzmann 模型能夠較好地對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)、總酸生成和還原糖基質(zhì)消耗進(jìn)行非線性擬合，并采用相關(guān)系數(shù)R2對(duì)擬合模型進(jìn)行可靠性評(píng)價(jià)，所選模型能夠較好地描述藥桑葚酵素的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征。通過對(duì)比生長(zhǎng)速率、總酸比合成速率與還原糖基質(zhì)比消耗速率研究，研究三者在整個(gè)發(fā)酵過程中隨時(shí)間的變化情況，可知總酸的生成與菌體生長(zhǎng)是生長(zhǎng)偶聯(lián)型的。研究藥桑葚酵素既解決了藥桑葚不易運(yùn)輸、難儲(chǔ)存的弊端，又滿足了人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)保健方面的需求，研究藥桑葚發(fā)酵動(dòng)力學(xué)能了解發(fā)酵過程中生理生化及動(dòng)力學(xué)特征，也能反映出酵素發(fā)酵過程中底物和產(chǎn)物之間的關(guān)系，為藥桑葚酵素工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論指導(dǎo)，為擴(kuò)大化生產(chǎn)提供了可能性。