丹梔逍遙散對(duì)D-氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷保護(hù)作用機(jī)制研究*

劉尚智，張志強(qiáng)，李昇錦

急性肝損傷(ALI)病情進(jìn)展快且病情極為兇險(xiǎn)，診治不及時(shí)將嚴(yán)重影響肝臟的解毒、合成和轉(zhuǎn)化等功能，甚至進(jìn)展為肝功能衰竭，危及患者的生命健康[1，2]。藥物濫用是引發(fā)肝病的重要原因之一，然而目前臨床上尚缺乏明確的肝功能保護(hù)和促進(jìn)肝細(xì)胞再生的特效方案。近期有文獻(xiàn)研究證實(shí)丹梔逍遙散在肝功能保護(hù)方面具有一定的效果。丹梔逍遙散又被稱為八味逍遙散或加味逍遙散，藥理學(xué)研究證實(shí)其具有疏肝健脾和清熱活血的功效，尤其適用于肝郁血虛生熱癥患者，目前在臨床各科疾病治療上被廣泛應(yīng)用[3，4]。脂多糖(LPS)屬于內(nèi)毒素中的一種，其可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)和全身炎癥反應(yīng)，易致急性肝損傷，而D-氨基半乳糖(D-GaIN)屬于特異性肝損傷藥物，研究證實(shí)其可耗竭肝細(xì)胞內(nèi)三磷酸尿嘧啶核苷，同時(shí)抑制RNA的合成及其蛋白質(zhì)表達(dá)。此外，D-GaIN可促進(jìn)腸道對(duì)內(nèi)毒素的吸收，增強(qiáng)LPS的肝臟毒性[5，6]。本研究采用D-GaIN/LPS誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型，觀察了丹梔逍遙散的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，有望為ALI的有效治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物與試劑 由上海斯萊克生物有限公司提供的健康雄性SD大鼠110只，體質(zhì)量為180～200 g(合格證號(hào)：2012001606577)。購于安徽老百姓大藥房的丹梔逍遙散由牡丹皮、梔子、當(dāng)歸和芍藥等中藥組成，將藥片煎成湯汁、濃縮備用，生藥濃度為2 g/mL，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成所需濃度，用于給大鼠灌胃。上海生工生物有限公司提供的D-GaIN(批號(hào)：A600474)，美國Sigma公司生產(chǎn)的LPS(批號(hào)：L4130)，美國R&D公司提供的ELISA試劑盒(批號(hào)：VAL609)，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的檢測血生化指標(biāo)試劑(批號(hào)：20120819)，南京建成生物工程研究所提供的檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX，批號(hào)：20121222)試劑盒，上海生工生物有限公司提供的檢測白介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號(hào)：20120915)試劑盒和透明質(zhì)酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)和Ⅲ型前膠原(Ⅲ-PC，批號(hào)：20110723)。其余試劑均屬于國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 ALI模型的制備 隨機(jī)將110只大鼠分為對(duì)照組、模型組、小劑量、中劑量和大劑量中藥干預(yù)組，每組22只。給予大鼠D-GaIN 700 mg.kg-1和LPS 1 mg.kg-1腹腔注射，建立ALI模型，給予對(duì)照組大鼠等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)腹腔注射。在建模成功后15 min，分別給予丹梔逍遙散3.83 g.kg-1、7.66 g.kg-1和15.33 g.kg-1(灌藥體積為10 mL/kg)灌胃，而在模型組和對(duì)照組，則給予等體積生理鹽水灌胃。所有大鼠持續(xù)灌胃7 d，1次/d。

1.3 觀察指標(biāo) 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死大鼠，取肝組織，固定于甲醛溶液中，行病理學(xué)檢查。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，采用ELISA法檢測血清MDA、SOD和GSH-PX和IL-6、IL-β和TNF-α水平；采用放射免疫分析法檢測血清肝纖維化指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 模型組肝組織細(xì)胞排列不規(guī)律，存在大量的血管破裂和紅細(xì)胞彌散，細(xì)胞形態(tài)異常；經(jīng)小劑量、中劑量和大劑量丹梔逍遙散干預(yù)后，隨著藥物劑量的增加，肝組織病變程度逐漸減輕(圖1)。

2.2 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較 模型組血清總膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而各劑量藥物干預(yù)組血清AST、ALT、TBIL水平顯著低于模型組(P<0.05，表1)。

2.3 各組血清氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較 模型組血清MDA水平顯著高于，而血清SOD和GSH-PX水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；各劑量藥物干預(yù)組血清MDA水平顯著低于，而血清SOD和GSH-PX水平顯著高于模型組(P<0.05，表2)。

2.4 各組血清細(xì)胞因子水平比較 模型組血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而各劑量藥物干預(yù)組血清細(xì)胞因子水平顯著低于模型組(P<0.05，表3)。

2.5 各組血清肝纖維化指標(biāo)比較 模型組血清HA、LN、Ⅲ-PC顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而各劑量藥物干預(yù)組血清HA、LN、Ⅲ-PC水平顯著低于模型組(P<0.05，表4)。

圖1 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，200×)A：對(duì)照組；B：模型組；C：小劑量干預(yù)組；D中劑量干預(yù)組；E：大劑量干預(yù)組

表1 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較

表2 各組血清氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較

表3 各組血清細(xì)胞因子水平比較

表4 各組血清肝纖維化指標(biāo)比較

3 討論

本研究結(jié)果顯示，ALI模型制備成功，經(jīng)中藥干預(yù)后，動(dòng)物血清AST、ALT、TBIL水平降低，提示丹梔逍遙散可有效減輕肝臟損害，對(duì)大鼠肝功能有一定的保護(hù)作用，與相關(guān)研究報(bào)道基本相符[7-10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示模型組血清MDA、IL-6、IL-β、TNF-α、HA、LN、Ⅲ-PC均呈顯著升高，經(jīng)小劑量、中劑量和大劑量中藥干預(yù)后，血清細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)降低。早期相關(guān)研究表明D-GaIN/LPS對(duì)肝臟損傷主要通過肝細(xì)胞內(nèi)尿苷二磷酸途徑，繼而影響肝細(xì)胞能量代謝和蛋白質(zhì)合成，在增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的同時(shí)，導(dǎo)致谷胱苷苷肽耗竭和TNF-α釋放，繼而引起細(xì)胞凋亡[11，12]。IL-6、IL-1β、TNF-α為常見的炎癥介質(zhì)，通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集活化和炎癥介質(zhì)的釋放，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和炎癥癥狀加重。IL-1β主要通過激活內(nèi)皮細(xì)胞繼而誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子表達(dá)，與TNF-α相互促進(jìn)，而IL-6參與多種生物學(xué)效應(yīng)，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要因素[13，14]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，MDA、SOD、GSH-PX將異常表達(dá)，SOD可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，在機(jī)體抗氧化方面發(fā)揮重要作用，其水平高低間接預(yù)示機(jī)體清除自由基的能力[15]。MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，而GSH-PX則可有效保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[16]。本研究結(jié)果初步提示ALI大鼠存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，推測肝功能損傷和纖維化狀態(tài)或與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果同樣證實(shí)，隨著丹梔逍遙散用藥劑量的加大，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和肝纖維化的改善作用更明顯。丹梔逍遙散主要由柴胡、牡丹皮、炒山梔、芍藥、茯苓、當(dāng)歸、炒白術(shù)和炙甘草組成，方中柴胡有疏肝解郁作用，牡丹皮可清火，炒山梔則由清肝熱的功效，而當(dāng)歸養(yǎng)血和血，白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝緩急，茯苓、白術(shù)、甘草則益氣健脾，全方諸藥聯(lián)用共奏疏肝清熱和養(yǎng)血健脾之功[17，18]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)柴胡對(duì)大鼠肝功能存在明顯的保護(hù)作用，同時(shí)可有效改善大鼠肝纖維化程度。牡丹皮和梔子等均被證實(shí)存在明顯的肝功能保護(hù)作用[19，20]。