膀胱癌組織和血清miR-200b甲基化狀態(tài)與EMT及臨床病理特征的相關(guān)性研究

石小玲，顧葉飛，蔡蕓

(1.如皋市人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，江蘇 如皋 226500；2.如皋市人民醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 如皋 226500；3.如皋市人民醫(yī)院 病理科，江蘇 如皋 226500)

膀胱癌(bladder cancer，BLCA)屬于生物學(xué)異質(zhì)性惡性腫瘤，可分為非肌層浸潤性(non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC)和肌層浸潤性(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)兩個亞型[1]。了解NMIBC向MIBC轉(zhuǎn)變的潛在機(jī)制對于BLCA臨床治療具有重要價值。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是BLCA細(xì)胞發(fā)生肌層浸潤的關(guān)鍵步驟[2]。最近有研究證實，miR-200家族成員表達(dá)的缺失可能是調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的重要事件[3]，且miR-200家族成員多受到甲基化修飾的調(diào)控[4]?；诒碛^遺傳學(xué)的腫瘤標(biāo)志物是檢測、診斷、評估預(yù)后和預(yù)測治療反應(yīng)的有前途的工具，本研究旨在探討B(tài)LCA組織和血清中miR-200b甲基化狀態(tài)與EMT及臨床病理特征之間的關(guān)系，為尋找BLCA惡性化進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在這項回顧性研究中我們收集了126例經(jīng)病理診斷為BLCA患者的腫瘤組織標(biāo)本，包括NMIBC患者65例，MIBC患者61例，所有患者均于2018年9月至2020年10月在我院泌尿外科接受根治性經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)，同期選擇63例經(jīng)病理證實為正常膀胱黏膜組織作為對照組，通過膀胱鏡檢查排除BLCA。126例BLCA患者中男93例，女33例，年齡32～81歲，平均(55.65±13.47)歲，對照組參與者中男49例，女14例，年齡31～83歲，平均(58.13±14.94)歲。所有BLCA患者出現(xiàn)無痛性肉眼可見的血尿，且經(jīng)膀胱鏡檢查、超聲、盆腔CT或MRI進(jìn)行診斷，另外完成體格檢查(包括尿常規(guī)、脫落性尿細(xì)胞學(xué)、尿液以及腹腔和盆腔腫瘤標(biāo)志物檢查)；術(shù)前均未接受過放療、化療、免疫治療等。排除腎癌、腺性膀胱炎反復(fù)發(fā)作、尿石癥患者。另外所有參與者手術(shù)前獲取血液樣本，并提取血清保存在-80 ℃的血液庫中，且均簽署了知情同意書。本研究得到了本院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 甲基化特異性PCR(methylation- specific PCR，MSP)法檢測組織和血清miR- 200b甲基化狀態(tài)

首先分別使用組織和血清DNA 提取試劑盒(德國 Qiagen 公司)對組織和血清基因組DNA進(jìn)行提取，然后通過 EZ DNA 甲基化試劑盒-Gold(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。之后分別加入經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA模板、10×緩沖液、Hotstar Taq DNA聚合酶、上游引物和下游引物、dNTPs進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，最后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。檢測結(jié)果以經(jīng)過甲基化處理的 DNA為陽性對照，以未經(jīng)過甲基化處理的外周血淋巴細(xì)胞DNA(全基因組擴(kuò)增)為陰性對照。miR-200b MSP甲基化引物：正向5′-GCGGGGTTCGGGTTTGCGTTATC-3′，反向5′-GCCCCACACAAATACGAACTCCCG-3′，126 bp；miR-200b非甲基化特異性引物：正向5′-GTTTGTGGGGTTTGGGTTTGTGTTATT-3′，反向5′-CACCCCACACAAATACAAACTCCCA-3′，131 bp。

1.3 實時熒光定量PCR(quantitative real- time PCR，qRT- PCR)法檢測血清miR- 200b水平

使用miRNeasy mini提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取血清miRNAs，用特制的miRNA種子特異性莖環(huán)引物(5′-GTCGTATCCAGTGCGTCGAGTGACACGAGAGCCACCTGGGCAATTTGCACTGGATACGACTCATCA-3′)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣本。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前所有的樣品都被預(yù)先孵育使RNA二級結(jié)構(gòu)變性，并且使引物在60 ℃退火20 min。用cDNA樣本(稀釋25倍)為模板和Taqman 2×Master mix、通用逆轉(zhuǎn)錄引物(5′-TCGTATCCAGTGCGTCGAGT-3′)、miR-200b特異性正向引物(5′-CGCAGTAATACTGCCTGGT-3′)、TaqMan-MGB熒光標(biāo)記探針(5′-CAGAGCCACCTGGGCAATTTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總體積為10 μl。實驗采用7900HTqRT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行，反應(yīng)條件為50 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃反應(yīng)10 min用于初始變性，95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min用作引物退火，沒有cDNA模板的陰性對照同時包括在所有檢測中。用cel-miR-39-3p作為內(nèi)源控制基因，相對表達(dá)水平定量使用2-ΔΔCq方法，取平均值用于分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組組織和血清中miR- 200b甲基化狀態(tài)

BLCA組患者腫瘤組織和血清中miR-200b甲基化率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。來自同一參與者的組織樣本和血清樣本中miR-200b甲基化檢測結(jié)果一致性良好(Kappa=0.715，P<0.001)，經(jīng)McNemarχ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 不同組織和血清中miR-200b甲基化檢測瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis images of tissue and serum miR-200b methylation in different groups

表1 不同組別的組織和血清中 miR-200b甲基化狀態(tài) %Tab 1 Methylation of tissue and serum miR-200b in different groups %

2.2 兩組血清中miR- 200b表達(dá)差異以及與甲基化狀態(tài)的關(guān)系

BLCA組患者血清中miR-200b表達(dá)水平顯著低于對照組(0.75±0.31vs.1.00±0.19)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而且對于BLCA組患者，miR-200b甲基化亞組血清中miR-200b表達(dá)水平顯著低于未甲基化亞組[0.61(0.32，0.82)vs.0.88(0.73，1.07)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 BLCA患者組織和血清miR- 200b甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

BLCA患者組織miR-200b甲基化狀態(tài)與肌層浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05)，同時血清miR-200b甲基化狀態(tài)與肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05)，即MIBC亞型、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或中低級別BLCA患者組織和血清miR-200b甲基化率更高，同時發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者血清miR-200b甲基化率也更高(P<0.05)，見表2。

表2 BLCA患者組織和血清miR-200b甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系 例Tab 2 Relationship between tissue and serum miR-200b methylation and clinicopathological features in BLCA patients cases

2.4 生物信息學(xué)分析BLCA患者組織miR- 200b表達(dá)與EMT的相關(guān)性

基于癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中的 miRNA-seq 數(shù)據(jù)以及miR-200b甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示BLCA患者miR-200b表達(dá)水平較正常膀胱組織顯著升高(P<0.05)(圖2A)；且miR-200b 基因存在多個CpG位點易發(fā)生甲基化(圖2B)，miR-200b高甲基化程度與miR-200b 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖2C)。經(jīng)Kaplan-meier曲線分析顯示,組織miR-200b低表達(dá)水平以及高甲基化狀態(tài)與總體生存率較低有關(guān)(P<0.05)(圖2D)。另外利用TCGA數(shù)據(jù)集，我們還證實了 miR-200b 表達(dá)水平與透明質(zhì)酸合酶2(hyaluronan synthases-2，HAS2)、鋅指 e-box 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(zinc finger E-box-binding homeobox，ZEB)1和ZEB2蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，見圖2E。

3 討 論

BLCA是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國超過30%的患者確診時已發(fā)生肌層浸潤[5]，MIBC屬于一種異質(zhì)性、侵襲性的膀胱癌亞型，具有惡性化程度高、更易發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等特點[6]，然而并非所有的NMIBC都會進(jìn)展至高度惡性表型的MIBC，表明兩者具有異質(zhì)性的分子特征[7]。了解NMIBC向MIBC轉(zhuǎn)變的潛在機(jī)制對于BLCA臨床治療具有重要價值。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，BLCA患者腫瘤組織和血清中miR-200b普遍呈高甲基化狀態(tài)，而且與腫瘤細(xì)胞肌層浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、中低分化程度等臨床病理特征有關(guān)，故而推斷miR-200b表觀遺傳學(xué)改變可能參與了BLCA惡性化進(jìn)展過程。

miRNAs是一類小分子(長度為21～25個核苷酸)非編碼RNA家族，通過6～8個堿基的種子序列與目標(biāo)mRNAs結(jié)合，進(jìn)而阻斷翻譯或降解mRNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)，這個過程取決于與目標(biāo)mRNA序列的互補(bǔ)程度[8]。目前已發(fā)現(xiàn)miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429等5個成員，它們具有共同的種子序列，這些序列通過調(diào)節(jié)上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)來調(diào)節(jié)EMT過程[9]。例如Arunkumar等[10]發(fā)現(xiàn),miR-200a、miR-200b、miR-200c、ZEB1、ZEB2、E-cadherin和波形蛋白(vimentin)等EMT調(diào)控基因表達(dá)失調(diào)是誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥的重要分子機(jī)制。Yeh等[11]報告也證實,miR-200c和miR-141同時沉默可能是肝癌通過激活EMT過程導(dǎo)致膽管轉(zhuǎn)移的原因。然而，miR-200b在BLCA中的特異性作用卻鮮少有研究。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，BLCA組患者腫瘤組織和血清中miR-200b甲基化率均高于對照組(P<0.05)，且來自同一參與者的組織樣本和血清樣本中miR-200b甲基化檢測結(jié)果一致性良好，說明核酸在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的早期就被釋放到血液中，并帶有與腫瘤遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)有關(guān)的異常變化，而且MSP是檢測或評估DNA啟動子區(qū)域甲基化最常用和經(jīng)濟(jì)的方法之一，因此檢測外周血中miR-200b甲基化程度有望成為用于BLCA診斷、具有臨床應(yīng)用前景的候選腫瘤標(biāo)志物。

此外，BLCA組患者血清中miR-200b表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)；而且對于BLCA組患者，miR-200b甲基化亞組血清中miR-200b表達(dá)水平顯著低于未甲基化亞組(P<0.05)，說明BLCA患者血清中miR-200b表達(dá)水平降低主要受到DNA表觀遺傳學(xué)調(diào)控的影響。甲基化誘導(dǎo)抑癌基因沉默是促進(jìn)腫瘤生長和去分化的最重要的表觀遺傳機(jī)制之一。據(jù)報道，具有腫瘤抑制活性的miR-200b被DNA超甲基化沉默，從而導(dǎo)致循環(huán)血中相對表達(dá)水平降低[12]。我們的TCGA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果與之基本一致，基于TCGA數(shù)據(jù)庫的分析證實miR-200b表達(dá)水平在BLCA組織中顯著降低，并且與DNA甲基化程度呈負(fù)相關(guān)性。

A.BLCA腫瘤組織(n=404)和正常膀胱組織(n=19)中miR-200b表達(dá)水平的差異性；B.Infinium BeadChip探針檢測miR-200b基因CpG島的位置(GRCh38/hg38)；C.Pearson法分析BLCA組織中miR-200b 表達(dá)水平與探針DNA甲基化的相關(guān)性(n=345)；D.Kaplan-meier 曲線分析顯示miR-200b 表達(dá)(n=353)和DNA甲基化(n=347)對BLCA患者總生存率的影響；E.miR-200b表達(dá)水平與原發(fā)性BLCA組織中HAS2、ZEB1、ZEB2表達(dá)的相關(guān)性(n=345)圖2 使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析臨床BLCA腫瘤組織中miR-200b表達(dá)和DNA甲基化A.Difference of miR-200b expression between BLCA tissue(n=404)and normal bladder tissue(n=19);B.Infinium BeadChip probe was used to detect miR-200b gene CpG island location(GRCh38/hg38);C.Pearson assay was used to analyze the correlation between miR-200b expression and probe DNA methylation in BLCA tissue(n=345);D.Kaplan-meier curve analysis revealed the effect of miR-200b expression(n=353)and DNA methylation(n=347)on overall survival in patients with BLCA;E.The expression of miR-200b was related with the expressions of HAS2,ZEB1 and ZEB2 in primary BLCA tissues(n=345)Fig 2 Analysis of miR-200b expression and DNA methylation in clinical BLCA tumors using TCGA database

Tamagawa等[13]研究證明miR-200b表達(dá)在癌細(xì)胞中被下調(diào)，與調(diào)節(jié)ZEB1/ZEB2表達(dá)密切相關(guān)。ZEB2反義RNA1(ZEB2-AS1)是一個與ZEB2基因5′端剪接位點重疊的非翻譯區(qū)。ZEB2和ZEB2-AS1作為雙向順式自然反義轉(zhuǎn)錄本表達(dá)，對于下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)是必不可少的。因此miR-200b被認(rèn)為是EMT過程的重要調(diào)節(jié)因子，通過降低E-cadherin的表達(dá)增加vimentin表達(dá)，誘導(dǎo)EMT過程。我們通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的患者數(shù)據(jù)證實，miR-200b表達(dá)水平與HAS2、ZEB1和ZEB2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這也解釋了為何發(fā)生肌層浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的BLCA患者組織或血清中miR-200b甲基化程度更高，說明具有miR-200b低水平的腫瘤患者更具備發(fā)生肌層浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的環(huán)境，而且miR-200b表達(dá)水平降低是通過改變啟動子甲基化事件來實現(xiàn)的。

綜上所述，BLCA患者組織和血清樣本中普遍存在miR-200b高甲基化狀態(tài)，而且發(fā)生肌層浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或中低分化程度的BLCA患者血清miR-200b甲基化率更高，這可能與其上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而激活EMT過程有關(guān)。