痛風(fēng)的自發(fā)緩解與NETs

李志嶺，張劍勇，賈二濤

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518000；2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

急性痛風(fēng)的發(fā)作有兩個必要的條件，一個是單鈉尿酸鹽(MSU)沉積，二是機(jī)體對于晶體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。尿酸從過飽和的關(guān)節(jié)液或血液中析出沉積于關(guān)節(jié)內(nèi)，繼而引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)[1]，臨床往往表現(xiàn)為突發(fā)的、劇烈的疼痛、紅腫。急性痛風(fēng)癥狀多在1周左右不加干預(yù)便可自行消退，但是MSU卻并沒有消失。為什么炎癥反應(yīng)會在刺激因素仍然存在的情況下自行消退？有許多研究者嘗試回答這個問題，目前有許多證據(jù)表明這種情況與中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)(NETs)的形成是呈高相關(guān)性的。下面我們就痛風(fēng)的自發(fā)緩解與NETs相關(guān)機(jī)制作一簡要綜述。

1 痛風(fēng)的自發(fā)緩解

人們目前對于急性痛風(fēng)自發(fā)緩解機(jī)制的了解十分有限，多數(shù)情況下痛風(fēng)會急性發(fā)作，往往在1 d之內(nèi)癥狀達(dá)到頂峰，但是即使不加任何藥物干預(yù)，7～10 d左右癥狀也會緩解[2]。因此研究者們提出了多種假說，但仍沒有形成一個被大多數(shù)研究者認(rèn)可的共識。自發(fā)緩解涉及到的可能不是單一路徑，而是多種機(jī)制共同作用，比如巨噬細(xì)胞、炎癥因子及炎癥小體負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡以及我們要重點論述的NETs[3]。

2 NETosis

2.1 中性粒細(xì)胞與NETosis

首先，MSU晶體激活炎癥小體NALP3，并且巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞先于中性粒細(xì)胞受到刺激，從而釋放出炎癥因子和組胺，使得中性粒細(xì)胞趨化聚集，大量的中性粒細(xì)胞能夠清除引發(fā)炎癥的異物。同時包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的炎癥細(xì)胞釋放大量的炎癥因子和趨化因子，激活更多的炎癥細(xì)胞。為了阻斷這種正反饋循壞，機(jī)體通過中性粒細(xì)胞凋亡的形式進(jìn)行調(diào)控[4]。中性粒細(xì)胞是人含量最多的白細(xì)胞，聚集到炎癥部位，經(jīng)過染色質(zhì)解縮和膜破裂或通過囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞剑怂嵛镔|(zhì)和顆粒蛋白融合并釋放到胞外而形成NETs，這個過程稱為NETosis。目前已知的催化酶主要有蛋白精氨酸脫亞胺酶(PAD)4、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO)等[5]。

中性粒細(xì)胞受到各種刺激導(dǎo)致鈣離子釋放激活鈣離子通道使Ca2+內(nèi)流，在線粒體基質(zhì)中累積的Ca2+激活了非選擇性線粒體孔隙(MPTP)與線粒體活性氧物種(mtROS)的形成，mtROS在蛋白激酶C的參與下明顯激活NADPH氧化酶[6]?；钚匝?ROS)其中一個重要來源是由NADPH氧化酶產(chǎn)生的，ROS激活了PAD4，其在NETs形成過程中扮演了極其重要的角色。PAD屬于Ca2+結(jié)合蛋白，其活性受到Ca2+的調(diào)控[6]。PAD4催化組蛋白的瓜氨酸化，減少組蛋白強(qiáng)正電荷，從而弱化了組蛋白與DNA的結(jié)合，核小體因此解聚[7-8]。隨后NE從嗜天青顆粒釋放轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核處，部分降解特定組蛋白連接物H1，并且修飾了組蛋白核心。隨后MPO很可能是通過次氯酸鹽的合成機(jī)制，二者通過共同作用使染色質(zhì)進(jìn)一步解聚[9-10]。解聚后DNA與瓜氨酸化的組蛋白及相關(guān)酶形成NETs排出到細(xì)胞外，從而發(fā)揮功能。凋亡的中性粒細(xì)胞很可能通過允許趨化因子受體(CCR)5的過度表達(dá)吸附趨化因子配體(CCL)3和CCL5，使其遠(yuǎn)離目標(biāo)而減弱趨化因子信號[11]。

此外，還有一種不依賴于ROS的NETs形成路徑，中性粒細(xì)胞受到刺激后同樣經(jīng)過染色質(zhì)解聚，與相關(guān)的酶通過囊泡的方式釋放到胞外，而殘存有少量細(xì)胞核的中性粒細(xì)胞仍具備一定遷移、吞噬的活性[12]。MSU晶體刺激形成NETs的過程是否依賴ROS仍存在爭議，有的實驗甚至得出了相反的結(jié)論[13-14]。

2.2 MiRNA與NETosis

NETs是以DNA為骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，已有實驗證實NETs會攜帶一些RNA，并且多項研究證明了miRNA在NETs形成過程中的重要調(diào)節(jié)作用。

miRNA142-3p通過調(diào)控PKC通路影響巨噬細(xì)胞的極化、炎癥因子的產(chǎn)生等功能，進(jìn)而與NETs相互作用[15]。研究者在miR-146a對NETs的調(diào)節(jié)的研究上得出了不完全一致的結(jié)果，但兩個陽性結(jié)果至少說明了miR-146a對NETs是有調(diào)節(jié)作用的[16-18]。miR-155與miR-146a類似正負(fù)反饋的模式調(diào)節(jié)NF-κB的活性，進(jìn)而實現(xiàn)對炎癥的控制。miR-155通過3′-UTR區(qū)域富AU元件來調(diào)控PAD4mRNA，從而調(diào)控NETs的形成[18-20]。

還有一些潛在的miRNA可能與NETs的形成相關(guān)，比如miR-505下調(diào)參與ROS產(chǎn)生的一種線粒體蛋白SIRT3，并實驗觀察到了較高的NETs[21]。miR-15b-5p和miR-378a-3p通過抑制Akt/mTOR途徑的活性，從而激活機(jī)制促進(jìn)NETs的形成[22]。

3 NETs與痛風(fēng)炎癥消退的機(jī)制

3.1 aggNETs

必須說明，NETs在整個炎癥過程中并非只參與了炎癥消退的過程，而是非常奇特地表現(xiàn)為促炎與抗炎兩種功能，這種看似矛盾的功能形成的重要原因便是NETs的密度[23]。Schauer等[24]對比野生鼠和NETosis機(jī)制缺陷Ncf1**小鼠足趾墊注射MSU晶體后足趾炎癥反應(yīng)，即野生型小鼠出現(xiàn)與人類似的痛風(fēng)自限過程，而NETosis基因缺陷Ncf1**小鼠相對遲緩，而且炎癥因子水平更高，關(guān)節(jié)炎癥更重且呈現(xiàn)慢性化。在腹腔注射MSU晶體后，野生小鼠同時注射可分解aggNETs的脫氧核糖核酸酶Ⅰ，發(fā)現(xiàn)其炎癥反應(yīng)與基因缺陷小鼠是相似的。同樣的，基因缺陷小鼠在MSU誘導(dǎo)后經(jīng)由過繼轉(zhuǎn)移aggNETs來改善炎癥。NETs可以釋放白細(xì)胞介素(IL)-8，即趨化因子，用以招募中性粒細(xì)胞，當(dāng)中性粒細(xì)胞達(dá)到一定濃度時，NETs相互聚集便形成了aggNETs。有實驗就已經(jīng)觀察到，aggNETs外附著的絲氨酸蛋白酶能夠通過降解炎癥因子如IL-1β和趨化因子，以此來阻斷中性粒細(xì)胞趨化和促使炎癥的消退[23]。

在炎癥早期NETs密度較低，內(nèi)源性大分子抗蛋白酶非常容易達(dá)到細(xì)胞網(wǎng)與相應(yīng)的中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶(NSPs)結(jié)合，這使得NSPs難以發(fā)揮對細(xì)胞因子和趨化因子的水解作用。但是，aggNETs是一種高密度、更大面積的NETs聚集體，它的結(jié)構(gòu)更加緊密。在炎癥區(qū)域與健康組織之間形成屏障，防止了炎癥的蔓延[25]。并且aggNETs能夠有效地阻擋大分子物質(zhì)的進(jìn)入，而像炎癥因子和趨化因子這種小分子蛋白仍然可以進(jìn)入。沒有了抗蛋白酶的抑制，NSPs能夠非常高效地水解促炎因子，阻斷了中性粒細(xì)胞聚集和激活的循環(huán)，從而使炎癥消退[26]。不同誘因誘導(dǎo)的aggNETs在炎癥因子降解能力上是不存在差異的[27]。

3.2 NETs的平衡

由于NETs的成分及結(jié)構(gòu)的特性使其具有抗原性，這意味著NETs與炎癥的持續(xù)狀態(tài)，尤其是自身免疫性炎癥疾病是呈相關(guān)性的。因此，維持NETs含量的平衡對于炎癥反應(yīng)來說也是至關(guān)重要的[26]。其中NETs的原料——中性粒細(xì)胞的凋亡，對維持NETs平衡有著重要的意義[28]。

3.2.1 巨噬細(xì)胞吞噬 炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞的作用同樣不容忽視，聚集的巨噬細(xì)胞可以清除細(xì)胞碎片及異物，已有研究者注意到巨噬細(xì)胞與NETs之間的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)MSU晶體刺激下巨噬細(xì)胞發(fā)生極化，使得具有抗炎作用的酶-血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)合成和分泌增多[29]，并且導(dǎo)致上調(diào)了CIS(SOCS蛋白家族)和SOCS3表達(dá)，進(jìn)而降低了IL-1β和腫瘤壞死因子α。激活了轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ1-)啟動子，TGF-β1是非常重要的限制炎癥因子，巨噬細(xì)胞快速清除凋亡的中性粒細(xì)胞也可以促進(jìn)TGF-β1的分泌。短蛋白吡咯結(jié)構(gòu)域和含caspase結(jié)構(gòu)域能夠干擾凋亡相關(guān)斑點樣蛋白ASC對脂多糖的反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥小體的激活。在人類體外實驗中，損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)誘導(dǎo)的TLR信號的負(fù)調(diào)控因子可以關(guān)閉無菌炎癥的因素[3]。在TGF-β1的相關(guān)作用下，具有抗炎作用的M2型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)了更高的吞噬能力，而人類巨噬細(xì)胞能夠吞噬中性粒細(xì)胞及NETs。巨噬細(xì)胞分泌的很多介質(zhì)均已被證明能夠促使NETs的形成，已經(jīng)有研究者觀測到了巨噬細(xì)胞吞噬NETs的現(xiàn)象，這個過程是通過DNase Ⅰ對NETs的胞外預(yù)處理以及NETs與C1q的調(diào)理來促進(jìn)的，并且這個過程保持了免疫沉默[30-31]，也就是說巨噬細(xì)胞同樣參與到了NETs抗炎過程，而且維持NETs水平的動態(tài)平衡。

3.2.2 中性粒細(xì)胞凋亡 中性粒細(xì)胞壞死性凋亡(necroptosis)是一種受調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，我們對它的了解遠(yuǎn)不如細(xì)胞凋亡。有研究表明,在MSU的刺激下通過激活NADPH氧化酶復(fù)合物的組裝和活性與ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而影響NETs的形成。之后的實驗表明，至少壞死性凋亡與NETosis是呈相關(guān)性的。與壞死性凋亡不同，細(xì)胞凋亡為了限制有害中性粒細(xì)胞的釋放，保持了細(xì)胞膜的完整，并暴露膜上的磷脂酰絲氨酸殘基，以便巨噬細(xì)胞的識別與吞噬。并且凋亡的中性粒細(xì)胞還刺激了巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎因子IL-10和TGF-β1[28]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A1(AnxA1)能夠調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞在關(guān)節(jié)中的募集，通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡和清除而減輕痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)。并且發(fā)現(xiàn)用AnxA1活性N端肽預(yù)處理小鼠可減少關(guān)節(jié)周圍中性粒細(xì)胞內(nèi)流以及IL-1β、CCL1的產(chǎn)生[32]。ω-3脂肪酸是必需脂肪酸，能夠通過G蛋白偶聯(lián)受體GPR40和GPR120特異性地，至少部分性抑制NLRP3炎癥小體激活以及抑制高脂飲食誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活，并且能夠限制中性粒細(xì)胞趨化進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥的消退。還有研究[33]證明，短鏈脂肪酸能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡從而緩解炎癥。

4 中性粒細(xì)胞微囊泡與NETs和炎癥消退

微囊泡(microvesicles，MVs)參與細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與功能調(diào)控，因而在生理及病理狀態(tài)下均可產(chǎn)生[34-36]。中性粒細(xì)胞衍生的微囊泡(NDMVs)被認(rèn)為是位于炎癥局部的中性粒細(xì)胞通過膜的起泡和脫落產(chǎn)生的。有研究[37]發(fā)現(xiàn)瓜氨酸組蛋白H3(H3Cit)與MVs之間結(jié)合，能夠延長H3Cit的壽命，也就是說MVs可能是與NETs結(jié)合并且對NETs起到了一定的保護(hù)作用。

NDMVs能夠通過抑制自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等炎癥基因表達(dá)發(fā)揮抗炎功能。此外，還有研究者在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)NDMVs增加軟骨細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β來減少炎癥關(guān)節(jié)炎軟骨損傷[38]。有實驗發(fā)現(xiàn)MVs能夠下調(diào)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性，通過在早期階段抑制C5a介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體相關(guān)的IL-1β的釋放以及通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1起到抗炎作用[11,39]。

中性粒細(xì)胞衍生痕跡(NDTRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的與NDMVs功能不同的胞外小泡。與抑制炎癥不同的是，NDTRs有更高的促炎miRNAs的表達(dá)，并且誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促炎表型即M1型級化。NDTRs的產(chǎn)生很可能是炎癥過程中非特異性的，雖然NDTRs具有促炎作用，但是卻降低了膿毒癥小鼠的致死率和慢性結(jié)腸炎小鼠模型的病理改變。適度的炎癥反應(yīng)是機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制，并非是絕對有害的，NDTRs就是在早期中性粒細(xì)胞遷移到炎癥過程中產(chǎn)生的促炎因素，NDMVs則抑制過度炎癥，減少對機(jī)體的損害。因此，無論NDTRs還是NDMVs可能都是對機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制[38,40]。

5 小 結(jié)

對急性痛風(fēng)的自然消退機(jī)制的探索至今仍處于初級階段，根據(jù)目前掌握的科研證據(jù)，這個過程是涉及多方面的。NETs無疑是其中重要的環(huán)節(jié)，中性粒細(xì)胞受到各種炎癥因子和趨化因子的作用而聚集于關(guān)節(jié)囊內(nèi)的MSU晶體沉積部位，并且受到酶的剪切等作用而程序性死亡，最終形成NETs，并且隨著炎癥反應(yīng)的進(jìn)行，NETs逐漸聚集而形成aggNETs，從而發(fā)揮抗炎作用，無論是對無菌性炎癥如痛風(fēng)，亦或是感染性疾病都發(fā)揮了一定的積極作用，值得我們關(guān)注[41]。生命體是非常精密的、智能的，懂得矯枉而不過正，因此作者還綜述了機(jī)體維持NETs含量平衡的機(jī)制，包括可能有延長NETs生存長度作用的MVs，這也是多種機(jī)制中不可或缺的一環(huán)，應(yīng)當(dāng)引起我們的重視。