GPR120對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞炎癥損傷及TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路的影響

吳廣飛，王星，王迪，劉波，劉俊茹，婁東輝，劉博偉

(秦皇島市第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 秦皇島 066000)

胰島β細(xì)胞功能受損是2型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，造成胰島β細(xì)胞功能受損的原因主要是脂毒性和糖毒性[1]。深入探討胰島β細(xì)胞功能受損的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)2型糖尿病的治療有重要意義。胰島β細(xì)胞功能受損與免疫炎癥損傷密切相關(guān)[2]。2型糖尿病患者血清中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)表達(dá)水平明顯升高[3]。既往研究[4-5]表明，LPS可激活Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/髓樣分化因子(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路，參與急慢性炎癥的激活，造成胰島β細(xì)胞功能受損。G蛋白偶聯(lián)受體120(G-protein coupled receptor 120，GPR120)以中長鏈脂肪酸為配體，在糖脂代謝和胰高血糖素樣肽(glucagon like peptide 1，GLP-1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，GPR120可以改善脂肪組織炎癥和胰島素抵抗。GPR120對(duì)胰島β細(xì)胞炎癥性損傷既往少有報(bào)道。本研究通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞炎癥損傷模型，分析GPR120在胰島β細(xì)胞炎癥損傷中的作用及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

胰島β細(xì)胞MIN6細(xì)胞株由舜冉(上海)生物科技有限公司提供(貨號(hào)YB-H0390)。DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)NS1123)、胰蛋白酶(NS1672)均購自南京生航生物技術(shù)有限公司。LPS購自美國Sigma公司(貨號(hào)L6529-1MG)；pcDNA3.1-GPR120由上海吉瑪公司提供(貨號(hào)P14905)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(貨號(hào)HZ0146)、凝膠快速制備試劑盒(貨號(hào)HZ00243)、CCK-8試劑盒(貨號(hào)HZ441423-1)和Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)HZ-00101)均購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。IL-6(貨號(hào)EK0411)、IL-1β(貨號(hào)EK0394)和TNF-α(貨號(hào)EK6820)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司。GPR120(貨號(hào)ab5712)、TLR4(貨號(hào)ab7778)、MyD88(貨號(hào)ab1004)、NF-κB p65(貨號(hào)ab1359)抗體和β-actin內(nèi)參抗體(貨號(hào)ab1121)均購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MIN6細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代，用胰蛋白酶消化，以1∶3傳代，每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.3 分組和慢病毒感染

將MIN6細(xì)胞分為control組(細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng))、LPS組(細(xì)胞用含10 μg·ml-1LPS[8]的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng))、LPS+control組(感染陰性對(duì)照慢病毒的細(xì)胞用10 μg·ml-1LPS培養(yǎng)液處理)、LPS+GPR120組(感染pcDNA3.1-GPR120慢病毒的細(xì)胞用10 μg·ml-1LPS培養(yǎng)液處理)，均干預(yù)1 d。當(dāng)胰島β細(xì)胞密度為40 %時(shí)，在細(xì)胞中加入慢病毒，培養(yǎng)12 h 后棄去慢病毒液加入新鮮完全培養(yǎng)液，3 d后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，檢測GPR120蛋白的表達(dá)水平。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測GPR120 蛋白的表達(dá)水平

在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解20 min后再12 000 r·min-1離心15 min，收集細(xì)胞上清液。用BCA法檢測蛋白水平。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(GPR120單克隆抗體，1∶500)，4 ℃過夜后棄去一抗，TBST洗膜3次。隨后室溫孵育二抗，2 h后棄去二抗，TBST洗膜3次。以β-actin作為內(nèi)參，用ECL發(fā)光儀對(duì)蛋白進(jìn)行成像，用Image J軟件分析灰度值。

1.5 CCK- 8法檢測MIN6細(xì)胞增殖情況

將對(duì)數(shù)生長期的MIN6細(xì)胞以1×104個(gè)·孔-1的密度接種于24孔板中，用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后向每孔中添加10 μl CCK-8，培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取吸光度。

1.6 Annexin- V- FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測MIN6細(xì)胞凋亡情況

取對(duì)數(shù)生長期的MIN6細(xì)胞制成1×106個(gè)·ml-1的細(xì)胞懸液,隨后加入5 μl異硫氰酸熒光素，混勻后孵育15 min,再加入2.5 μl碘化丙啶孵育5 min,最后用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.7 ELISA檢測IL- 6、IL- 1β和TNF- α水平

吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r·min-1離心20 min后取上清液，用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測TLR4、MyD88、NF- κB p65蛋白的表達(dá)

檢測步驟同1.4。實(shí)驗(yàn)過程中TLR4、MyD88、NF-κB p65抗體分別稀釋500、1 000、500倍。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組GPR120蛋白表達(dá)量的比較

LPS組GPR120蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.34±0.06，明顯低于control組的1.18±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS+GPR120組GPR120蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.36±0.23，明顯高于LPS+control組的0.39±0.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組MIN6細(xì)胞增殖活力比較

4組間細(xì)胞活力的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.786，P<0.001)，LPS組細(xì)胞增殖活力明顯低于control組(0.67±0.09vs1.23±0.10，P<0.001)，LPS+GPR120組細(xì)胞增殖活力明顯高于LPS+control組(1.45±0.17vs0.70±0.12，P<0.001)，見圖2。

2.3 各組MIN6細(xì)胞凋亡率比較

4組細(xì)胞凋亡率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.223，P<0.001)，LPS組細(xì)胞凋亡率明顯高于control組[(16.78±2.31)%vs(6.09±1.23)%，P<0.001]，LPS+GPR120組細(xì)胞凋亡率明顯低于LPS+control組[(6.34±1.55)%vs(20.13±3.98)%，P<0.001]，見圖3。

2.4 各組細(xì)胞上清液IL- 6、IL- 1β和TNF- α水平比較

4組細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為12.090、31.786、19.241，均P<0.001)。LPS組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平分別為(96.89±8.76)、(76.00±13.23)、(56.23±8.78)pg·ml-1，均高于control組[(71.89±12.13)、(43.23±10.12)、(35.34±9.56)pg·ml-1，均P<0.001]。LPS+GPR120組IL-6、IL-1β和TNF-α水平分別為(96.89±8.76)、(51.11±9.72)、(40.12±7.09)pg·ml-1，均低于LPS+control組[(100.34±16.23)、(68.34±10.23)、(53.26±10.11)pg·ml-1，均P<0.001]。見圖4。

與control組比較，*P<0.05；與LPS+control組比較，#P<0.05圖1 各組GPR120蛋白表達(dá)量的比較

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖2 CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力

2.5 各組TLR4/MyD88/NF- κB p65信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較

4組細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為23.001、18.324、30.181，均P<0.001)。LPS組細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.60±0.12、0.57±0.09、0.67±0.13，均高于control組(0.23±0.05、0.24±0.08、0.32±0.09，均P<0.001)。LPS+GPR120組TLR4、MyD88、NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.06、0.37±0.04、0.39±0.03，均低于LPS+control組(0.60±0.08、0.63±0.06、0.68±0.09，均P<0.001)。見圖5。

3 討 論

慢性炎癥引起的胰島β細(xì)胞損傷在糖尿病的發(fā)病中起重要作用[2]。有研究[9]顯示，2型糖尿病患者胰島組織中炎癥細(xì)胞因子過表達(dá)，并且存在免疫細(xì)胞浸潤、胰島β細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象。LPS是誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的重要分子，LPS誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷模型是糖尿病體外研究的常用模型。本研究用LPS處理MIN6細(xì)胞后，MIN6細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，并且細(xì)胞增殖能力下降、凋亡率明顯增高，這與既往報(bào)道[10-12]一致，說明本實(shí)驗(yàn)成功建立了LPS誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷模型。

GPR120是脂肪酸受體超家族中新的G蛋白偶聯(lián)受體成員，以中長鏈脂肪酸為配體[7]。在小腸內(nèi)分泌細(xì)胞STC1中，中長鏈脂肪酸與GPR120結(jié)合后激活磷脂酶C分解磷脂酰肌醇二磷酸，生成三磷酸肌醇和二酰甘油，而三磷酸肌醇引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)，進(jìn)而控制胰高血糖素樣肽1的釋放，調(diào)控胰島素分泌。另外，中長鏈脂肪酸與GPR120結(jié)合后還可以激活MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和功能，同時(shí)調(diào)控游離脂肪酸引起的細(xì)胞凋亡抑制[13]。GPR120還能夠啟動(dòng)PI3K-Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[13]。GPR120在腸內(nèi)分泌細(xì)胞、味蕾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和胰島β細(xì)胞中表達(dá)較多，可參與調(diào)解激素分泌、脂質(zhì)生成和葡萄糖代謝等一系列代謝過程，作為潛在的、治療多種代謝疾病的靶點(diǎn)備受關(guān)注[7,14]。既往研究[15]發(fā)現(xiàn)，GPR120可以通過抑制巨噬細(xì)胞分泌環(huán)氧合酶-2和促進(jìn)前列腺素E-2分泌等起到抗炎作用，在胰島素抵抗的發(fā)生中起重要作用。

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖3 Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測各組凋亡率

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖4 ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中炎癥因子表達(dá)水平

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量

本研究發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPR120慢病毒后MIN6細(xì)胞增殖活力明顯增高、凋亡率下降，并且IL-6、IL-1β和TNF-α水平也明顯下降，說明GPR120可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞炎癥損傷。類似的是，Wang等[16]發(fā)現(xiàn)激動(dòng)GPR120可以通過胰十二指腸同源盒-1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞炎癥，并且改善了小鼠胰島β細(xì)胞功能。Oh等[17]也發(fā)現(xiàn)，GPR120激動(dòng)劑CpdA可以改善2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗、肝臟脂肪堆積。為了探尋GPR120的可能作用機(jī)制，本研究檢測了TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量。TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路是一條經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，激活后可以誘導(dǎo)免疫炎癥損傷和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，該通路與胰島β細(xì)胞損傷、2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[18-19]。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，LPS可以通過激活TLR4和p38 MAPK抑制巨噬細(xì)胞GPR120的表達(dá)。GPR120對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路的調(diào)控作用既往少有報(bào)道。有研究[21]發(fā)現(xiàn)，GPR120可以通過IκB激酶β抑制NF-κB p65的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPR120慢病毒可以下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)，提示GPR120抗LPS誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與該通路有關(guān)。通過GPR120開發(fā)新藥可能給糖尿病的治療帶來希望。

綜上所述，GPR120在LPS誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞炎癥損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路、促進(jìn)細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果提示，靶向GPR120可能會(huì)為2型糖尿病的治療帶來曙光。未來需要進(jìn)一步闡明GPR120對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。