組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后的研究

杜亮，金澄宇

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 胸外科，新疆 烏魯木齊 830001)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌中占比高達(dá)85%以上，以腺癌為主要組織學(xué)類型[1]。目前肺葉切除術(shù)在NSCLC早中期治療中被廣泛應(yīng)用，療效確切。而相關(guān)研究報(bào)道，早中期NSCLC患者仍有一定預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)，可能與腫瘤異質(zhì)性、腫瘤大小等多方面因素有關(guān)[2]。而目前臨床尚無有效預(yù)測(cè)手段，不利于術(shù)后治療方案的制定。研究[3]指出，能譜CT作為一種新技術(shù)可有效評(píng)估癌組織特征，被作為術(shù)前診斷鑒別手段，可反映患者病情及預(yù)測(cè)預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。微小RNA(microRNA，miR)參與腫瘤基因表達(dá)調(diào)控，其中miR-25-3p被證實(shí)在肺癌組織中呈異常高表達(dá)，可能與患者生存情況有關(guān)[4]。推測(cè)組織中miR-25-3p水平、能譜CT定量參數(shù)可作為NSCLC患者預(yù)后預(yù)測(cè)的輔助手段，但目前相關(guān)研究報(bào)道較少。基于此，本研究進(jìn)一步觀察組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)預(yù)測(cè)NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后的效能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取我院2017年1月至2019年1月收治的116例NSCLC患者作為研究對(duì)象，年齡50～68歲，平均(58.12±6.30)歲；男67例，女49例；組織學(xué)分型：腺癌79例，鱗癌25例，腺鱗癌12例；分化程度：低分化5例，中分化32例，高分化79例；TNM分期[5]：Ⅰ期98例，Ⅱ期18例。我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)術(shù)前穿刺活檢確診；②均為初次發(fā)??；③符合肺葉切除術(shù)治療的適應(yīng)證：周圍性肺癌或局限于肺葉內(nèi)的不可逆病變；④可耐受能譜CT檢查，且患者病灶實(shí)性部分足夠測(cè)量。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前接受過化療或免疫治療的患者；②患有感染性疾病的患者；③一側(cè)肺部病變，對(duì)側(cè)肺功能也不全的患者；④凝血功能異常的患者；⑤麻醉耐受性差者。

1.3 方法

1.3.1 收集資料 記錄患者年齡、性別、組織學(xué)分型、分化程度、飲酒史、吸煙史、高脂血癥史、糖尿病史、高血壓史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、病灶最大直徑，其中組織學(xué)分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、病灶最大直徑以手術(shù)病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。

1.3.2 組織中miR-25-3p水平 檢測(cè)試劑盒及試劑均由南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供。于治療前檢測(cè)組織中miR-25-3p水平，行穿刺活檢，取腫瘤中外1/3交接處癌組織標(biāo)本，避免鈣化或壞死部分，存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中。用裂解液將凍存標(biāo)本研磨成勻漿狀，使用RNA提取試劑盒提取組織RNA，采用美國(guó)Thermo公司紫外分光光度計(jì)評(píng)估RNA純度和濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)體系總體積20 μl，引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAA-3′，獲得cDNA。采用ABI 7500 Fast Star定量PCR儀檢測(cè)miR-25-3p表達(dá)水平，反應(yīng)條件為:95 ℃ 90 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s,共40個(gè)循環(huán)。上游引物(5′-3′)為GGAATGTTGCTCGGTGA，下游引物(5′-3′)為CAGTGCGTGTCGTGGA。以U6為內(nèi)參：上游引物(5′-3′)為CGCTTCGGCAGCACATA，下游引物(5′-3′)為TTCACGAATTTGCGTGTCAT。采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-25-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 能譜CT定量參數(shù) 應(yīng)用美國(guó)GE公司寶石能譜CT(Discovery CT750 HD)行胸部平掃及雙期增強(qiáng)掃描，患者取仰臥位，掃描參數(shù)：管電壓為高、低能量(80 kVp 與140 kVp)瞬時(shí)(0.5 ms)切換，自動(dòng)毫安，螺距1.375∶1，層間距5.0，層厚5.0 mm，矩陣512×512，準(zhǔn)直64×0.625 mm，機(jī)架旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.6 s，掃描范圍包括肺尖至肋膈角水平。行平掃后經(jīng)肘正中靜脈輸注非離子型對(duì)比劑碘海醇1.6 ml·kg-1，時(shí)間≤30 s，監(jiān)測(cè)胸主動(dòng)脈CT值，到達(dá)150 HU閾值后延遲5.7 s開始掃描，獲得動(dòng)脈期圖像后延遲30 s獲得靜脈期圖像。將所得圖像上傳至GE AW4.6工作站，由2名主治醫(yī)師完成閱片。選取病灶實(shí)性成分作為感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，各期ROI在相鄰3個(gè)層面上各測(cè)量1次，大小、形態(tài)及位置保持一致，取平均值。記錄平掃有效原子序數(shù)(effective atomic number，Eff-Z)，計(jì)算病灶處動(dòng)、靜脈期標(biāo)準(zhǔn)化碘濃度(normalized iodine concentrations，NIC)，NIC=病灶ROI內(nèi)碘含量/主動(dòng)脈碘含量。

1.3.4 預(yù)后評(píng)估 患者均行肺葉切除術(shù)治療，對(duì)術(shù)前穿刺活檢顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者行術(shù)中淋巴結(jié)清掃術(shù)治療，手術(shù)均順利實(shí)施，術(shù)后復(fù)查CT證實(shí)病灶切除干凈。隨訪并指導(dǎo)患者到院復(fù)查，采用CT檢查評(píng)估患者復(fù)發(fā)情況，以復(fù)發(fā)為終點(diǎn)事件，根據(jù)復(fù)發(fā)情況將患者分為預(yù)后不良組與預(yù)后良好組，比較兩組基線資料、組織中miR-25-3p水平及能譜CT定量參數(shù)，分析組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)對(duì)NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后的預(yù)測(cè)效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC患者復(fù)發(fā)情況

隨訪19～24個(gè)月，平均隨訪時(shí)間(20.68±3.59)個(gè)月。116例NSCLC患者中有20例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為17.24%；經(jīng)KM法繪制復(fù)發(fā)曲線顯示，20例復(fù)發(fā)NSCLC患者中位復(fù)發(fā)時(shí)間為18個(gè)月(95%置信區(qū)間：15.809～20.191個(gè)月)。見圖1。

圖1 NSCLC患者復(fù)發(fā)Kaplan-Meier曲線Fig 1 Kaplan-Meier curve of recurrence in patients with NSCLC

2.2 預(yù)后不良組與預(yù)后良好組基線資料、miR- 25- 3p及能譜CT定量參數(shù)比較

兩組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期占比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；預(yù)后不良組miR-25-3p相對(duì)表達(dá)量高于預(yù)后良好組，平掃Eff-Z、靜脈期及動(dòng)脈期NIC低于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組年齡、性別、組織學(xué)分型、分化程度、飲酒史、吸煙史、高血脂史、糖尿病史、高血壓史、病灶最大直徑比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 預(yù)后不良組與預(yù)后良好組基線資料、miR-25-3p及能譜CT定量參數(shù)比較Tab 1 Comparison of baseline data,miR-25-3p and energy spectrum CT quantitative parameters between poor prognosis group and good prognosis group

2.3 NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

將患者預(yù)后作為因變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)，將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-25-3p相對(duì)表達(dá)量、平掃Eff-Z、靜脈期及動(dòng)脈期NIC作為自變量，對(duì)自變量進(jìn)行賦值(表2)。經(jīng)Cox回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-25-3p相對(duì)表達(dá)量、平掃Eff-Z、靜脈期及動(dòng)脈期NIC是NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后的影響因素(P<0.05)，見表3。

表2 自變量說明與賦值情況Tab 2 Description and assignment of independent variables

表3 NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后影響因素的Cox回歸分析結(jié)果Tab 3 Cox regression analysis results of influencing factors of prognosis of patients with NSCLC treated by pulmonary lobectomy

2.4 組織中miR- 25- 3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值

將患者預(yù)后作為狀態(tài)變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)，將miR-25-3p相對(duì)表達(dá)量、平掃Eff-Z、動(dòng)脈期NIC、靜脈期NIC作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC(圖2)，結(jié)果顯示，組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)用于預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC為0.880，有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。ROC相關(guān)參數(shù)詳見表4。

表4 組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC參數(shù)Tab 4 ROC parameters of miR-25-3p level in tissues combined with quantitative parameters of energy spectrum CT in predicting prognosis

圖2 組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線圖Fig 2 ROC curve of miR-25-3p level in tissues combined with quantitative parameters of energy spectrum CT in predicting prognosis

3 討 論

因影像學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)步，NSCLC早中期診斷率提高，利于患者及早實(shí)施治療。但NSCLC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到遺傳、環(huán)境多種因素的相互作用，患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，預(yù)后尚難以有效預(yù)測(cè)[7]。

大量研究[8-9]指出，早期NSCLC患者仍有一定預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)，患者多項(xiàng)病理特征與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，116例NSCLC患者復(fù)發(fā)率為17.24%，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為18個(gè)月，說明NSCLC患者術(shù)后短期預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高，與上述研究結(jié)論一致。初步比較預(yù)后不良組與預(yù)后良好組基線資料、miR-25-3p及能譜CT定量參數(shù)后，經(jīng)Cox回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-25-3p相對(duì)表達(dá)量、平掃Eff-Z、靜脈期及動(dòng)脈期NIC是NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后的影響因素，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期是既往臨床用于預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的常用手段。趙裕歡等[10]研究證實(shí)，NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可增加預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)，盡管部分患者為淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，也可增加術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，影響患者生存率。TNM分期可綜合反映腫瘤原發(fā)病灶、侵襲及轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)而反映腫瘤異質(zhì)性，與患者病情進(jìn)展及預(yù)后均有關(guān)[11]。因此，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期對(duì)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后有一定價(jià)值。而僅通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期評(píng)估NSCLC患者預(yù)后尚有局限，特異度和靈敏度尚不理想。

miR作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)與細(xì)胞信號(hào)通路的非編碼小分子RNA，可通過促進(jìn)腫瘤血管生成、調(diào)控抑癌基因表達(dá)等多種機(jī)制參與腫瘤進(jìn)展，已被作為腫瘤預(yù)后的有效預(yù)測(cè)手段[12]。miR-25-3p是其中一種，可靶向調(diào)節(jié)神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1，而神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1可調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化及凋亡[13]。miR-25-3p在NSCLC中作為致癌因子，在miR-25-3p表達(dá)上調(diào)時(shí)Notch信號(hào)紊亂，Notch同源蛋白1表達(dá)上調(diào)，癌細(xì)胞易發(fā)生生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高[14]。miR-25-3p還可靶向調(diào)控B細(xì)胞易位基因2，促使腫瘤進(jìn)展，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤惡性生物學(xué)行為[15]。此外，相關(guān)研究[16]還指出，miR-25-3p表達(dá)上調(diào)可反饋為NSCLC患者腫瘤分化程度低、惡性程度高、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高，因此與NSCLC患者預(yù)后不良密切相關(guān)。但本研究未能對(duì)miR-25-3p與腫瘤分化程度及轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)性進(jìn)行分析，未來還應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步探討。能譜CT以單源瞬時(shí)kVp切換技術(shù)為基礎(chǔ)，可得到連續(xù)單能量圖像，并行能譜重建，可進(jìn)一步獲取多種定量參數(shù)[17]。平掃Eff-Z、靜脈期及動(dòng)脈期NIC可用于鑒別病灶性質(zhì)，三者低可反映腫瘤生長(zhǎng)、侵襲能力強(qiáng)，新生血管無法滿足腫瘤供血需求，且腫瘤內(nèi)部有較多的黏液、壞死成分，并有微出血發(fā)生，病灶表現(xiàn)為血供不足，進(jìn)一步反映了腫瘤惡性程度高，患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高[18-19]。

進(jìn)一步繪制ROC，結(jié)果顯示，組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)用于預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC>0.85，有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。說明組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)對(duì)NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后有一定預(yù)測(cè)效能。聯(lián)合預(yù)測(cè)可彌補(bǔ)單項(xiàng)預(yù)測(cè)的不足之處，從不同方面反映患者不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，獲得理想的特異度和靈敏度。臨床可將miR-25-3p作為NSCLC患者的新治療靶點(diǎn)，并可對(duì)術(shù)前預(yù)測(cè)為高預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的患者實(shí)施輔助放化療治療。而因本研究未能觀察NSCLC患者細(xì)胞免疫、體液免疫功能及血清腫瘤標(biāo)志物水平，結(jié)論尚有局限，未來還應(yīng)納入NSCLC患者的多項(xiàng)資料，進(jìn)一步分析NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)，為臨床治療提供參考意見。

綜上所述，組織中miR-25-3p水平聯(lián)合能譜CT定量參數(shù)對(duì)NSCLC患者肺葉切除術(shù)治療預(yù)后有一定預(yù)測(cè)效能，可根據(jù)術(shù)前檢測(cè)結(jié)果對(duì)患者實(shí)施針對(duì)性治療。