HPLC-ELSD 法測定心榮顆粒中黃芪甲苷的含量

張士妍，劉曉瑜，沈 倩

（無錫市藥品安全檢驗檢測中心，江蘇 214028）

心榮顆粒是由黃芪、地黃、麥冬、五味子、赤芍及桂枝共6 味傳統(tǒng)中藥材經(jīng)過提取、濃縮成一定密度的清膏后，與蔗糖、糊精等輔料制備而成的中藥顆粒劑，因其具有助陽、益氣、養(yǎng)陰等功效，被廣泛用于心陽不振、氣陰兩虛型冠心病。黃芪作為該方君藥，具有補(bǔ)氣升陽，益腎活血等功效［1-3］。黃芪甲苷作為黃芪的主要活性成分，具有強(qiáng)心降壓、抗心肌細(xì)胞缺氧缺血、改善新生血管、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等功效，心榮顆?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-015（Z-015）-2005（Z），該標(biāo)準(zhǔn)未對黃芪甲苷含量進(jìn)行控制，對藥品質(zhì)量體現(xiàn)不足。因此建立一種快速準(zhǔn)確測定心榮顆粒中黃芪甲苷含量的方法，對心榮顆粒產(chǎn)品質(zhì)量控制有重要意義［4-6］。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器與設(shè)備 Agilent1260 高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Technologies Inc.）；蒸發(fā)光散射檢測器（Agilent Technologies Inc.）；XPE56 電 子 天 平（METTLER TOLEDO）；XSE205 電子天平（METTLER TOLEDO）；Elmasonic 超聲儀（Elma）；Millipore 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）。

1.2 主要試藥 黃芪甲苷對照品（純度96.9%，批號110781-201717，中國食品藥品檢定研究院）；心榮顆粒（安徽某制藥有限公司，批號分別為200502、200602、200702，規(guī)格：10 g/袋）；心榮顆粒陰性對照（自制，缺黃芪）。乙腈（色譜純，Merck），試驗用水為超純水（自制），甲醇、正丁醇等其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Waters X-Bridge BEH Shield RP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（32∶68）；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；蒸發(fā)光散射檢測器，設(shè)置漂移管溫度:70 ℃，載氣流速:2.0 L/min。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取15.294 mg 黃芪甲苷對照品，放置于20 ml 棕色量瓶中，緩慢加入10 ml甲醇輕輕振搖使其溶解，并且用甲醇定容至刻度，振搖至均勻，制得濃度為0.741 0 mg/ml 的黃芪甲苷對照品儲備液。精密量取黃芪甲苷對照品儲備液適量，稀釋成濃度為0.370 5 mg/ml 的對照品溶液，即得到對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取10 袋供試品，將內(nèi)容物混合均勻，然后研磨成粉末狀，精密稱取9.887 9 g，放置于100 ml 的具塞錐形瓶中，緩慢加入甲醇40 ml，蓋緊瓶塞，輕輕振搖錐形瓶，使內(nèi)容物完全被甲醇浸潤，超聲處理 30 min（200 W，40 kHz），待溶液冷卻到室溫后再濾過，將所得濾液用水浴緩緩加熱濃縮至稠膏狀，加溫水10 ml，邊加熱邊輕輕攪拌使浸膏溶解，使用正丁醇（水飽和）振搖提取，每次40 ml，共3 次；將提取液全部合并，用新制的氨試液充分洗滌4 次以去除酸性及弱酸性雜質(zhì)，每次40 ml，將氨液全部棄去。在沸水浴上將洗滌后的正丁醇液蒸發(fā)近干，用適量的甲醇把殘渣充分溶解，并且轉(zhuǎn)移到5 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖至均勻，使用0.45 μm 濾膜進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 除黃芪外，取處方中的其余5 種中藥材，制備陰性顆粒劑，按“2.2.2”項的方法制備成無黃芪的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 依照“2.1”項下色譜條件，分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl，依次進(jìn)行色譜分析測定。結(jié)果顯示黃芪甲苷峰形良好，主成分峰與雜質(zhì)峰分離良好，供試品中雜質(zhì)不干擾樣品測定，在黃芪甲苷相應(yīng)的保留時間處陰性樣品溶液無色譜峰出現(xiàn)，表示無陰性干擾，見圖1。

圖1 對照品（A）供試品（B）陰性對照（C）HPLC 色譜圖

2.4 線性范圍試驗 精密量取“2.2.1”項下黃芪甲苷對照品儲備液適量，配制成濃度分別為0.370 5、0.185 2、0.092 6 和0.046 3 mg/ml 的溶液，將上述溶液與原濃度對照品儲備液各精密量取20 μl，分別注入液相色譜儀，依照“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定分析，記錄黃芪甲苷峰面積，以對照品溶液濃度的對數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，黃芪甲苷峰面積的對數(shù)（lgA）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到線性回歸方程為：lgA=1.897lgC+3.850（r=0.999）。試驗結(jié)果表明，在 0.046 3～0.741 0 mg/ml 范圍內(nèi)，黃芪甲苷濃度與峰面積取對數(shù)后呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件，精密量取黃芪甲苷對照品溶液（0.370 5 mg/ml）20 μl，進(jìn)行色譜分析測定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。黃芪甲苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.56%。試驗結(jié)果表明，儀器精密度良好，能滿足試驗要求。

2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號樣品6 份（批號為200702），依照“2.2.2”項下的試驗方法平行制備供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件進(jìn)行測定分析，記錄主成分峰峰面積，分析檢測重復(fù)性。根據(jù)“2.4”項下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算黃芪甲苷含量。結(jié)果表明，平均含量為 0.154 9 mg/g，RSD 為 1.08%，本試驗方法測定黃芪甲苷的含量重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取本品內(nèi)容物一份，精密稱定，依照“2.2.2”項下的試驗方法制備供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件，于 0、2、4、6、8 和 12 h 分別進(jìn)行測定分析，記錄主成分峰峰面積，分析黃芪甲苷穩(wěn)定性。結(jié)果表明，黃芪甲苷在12 h 內(nèi)峰面積RSD為0.39%，穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取6 份供試品（已知含量），分別加入濃度為0.741 0 mg/ml 的黃芪甲苷對照品儲備液2 ml，依照“2.2.2”項下的試驗方法制成供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件進(jìn)行分析測定，計算回收率。結(jié)果表明，平均回收率為97.60%，RSD 為1.04%（n=6）。該試驗方法準(zhǔn)確可靠，可用于心榮顆粒中黃芪甲苷的含量測定。見表1。

表1 黃芪甲苷回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定 取3 批樣品，依照“2.2.2”項下的試驗方法制成供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件進(jìn)行分析測定，記錄主成分峰峰面積，并計算黃芪甲苷含量。批號為200502、200602、200702 的心榮顆粒，黃芪甲苷檢測結(jié)果分別為1.542 5、1.520 3和1.502 5 mg/袋。見表2。

表2 心榮顆粒樣品中黃芪甲苷的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 測定黃芪甲苷方法的選擇 近年來，對黃芪甲苷含量主要通過TLCS 法、HPLC-UV 法或HPLCELSD 法［7］進(jìn)行測定。TLCS 法易受薄層板條件等多種外界因素影響、且操作步驟繁雜、重現(xiàn)性差。因黃芪甲苷最大紫外吸收波長僅在200 nm 附近，不適用于HPLC-UV 法準(zhǔn)確測定黃芪甲苷含量［8］。而 HPLC-ELSD法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，常應(yīng)用于如人參皂苷、黃芪甲苷等紫外吸收較弱的天然皂苷類活性物質(zhì)。結(jié)合查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料［9-12］，本文采用 HPLC-ELSD 法測定心榮顆粒中黃芪甲苷含量，可為心榮顆粒中黃芪甲苷的測定提供可靠參考。

3.2 提取方式及時間的選擇 前期試驗顯示，將供試品進(jìn)行加熱回流提取3 h 與超聲提取30 min 黃芪甲苷含量無明顯區(qū)別，超聲提取相比于加熱回流提取，時間短，效率高、節(jié)能環(huán)保，還對超聲處理時間進(jìn)行了考查，超聲提取30、45 與60 min 效果相當(dāng)，所以確定超聲處理30 min 為供試品溶液的處理方法。

3.3 純化方式的選擇 預(yù)試驗比較了將供試品在正丁醇液蒸干后，殘渣加水溶解并通過大孔吸附樹脂柱進(jìn)行凈化，洗脫液蒸干，殘渣用甲醇溶解定容后再進(jìn)樣與正丁醇液殘渣直接用甲醇溶解定容后進(jìn)樣的效果，結(jié)果表明，本檢測方法省去大孔吸附樹脂凈化步驟，黃芪甲苷峰的分離度及檢測仍可滿足要求。

3.4 流動相的選擇 HPLC-ELSD 法所采用流動相一般為乙腈-水或者甲醇-水系統(tǒng)。預(yù)試驗中，本文分別采用不同配比的乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)作為流動相，進(jìn)行多次篩選，經(jīng)考查比較，乙腈-水（32∶68）為流動相，流速為1.0 ml/min 時，供試品溶液中黃芪甲苷出峰時間適中、峰形理想、與相鄰雜質(zhì)峰分離度良好，專屬性好。

3.5 載氣流速和漂移管溫度的選擇 采用ELSD 檢測器時，檢測結(jié)果會受到載氣流速和漂移管溫度的影響，不同的流速將會影響峰面積和保留時間；不同的漂移管溫度將會影響基線的穩(wěn)定性［13-14］。文獻(xiàn)中多采用較高的載氣流速與漂移管溫度進(jìn)行黃芪甲苷的測定［15-16］。經(jīng)過多次優(yōu)化，確定載氣流速為2.0 L/min，漂移管溫度為70 ℃時峰形良好無干擾，為最佳色譜條件。

黃芪甲苷為心榮顆粒的有效成分，但目前未見有關(guān)心榮顆粒中黃芪甲苷的有效測定方法的報道。試驗證明，本研究采用HPLC-ELSD 法測定心榮顆粒中黃芪甲苷的含量，黃芪甲苷可與其他成分有效分離，測定結(jié)果重復(fù)性好，測定方法簡單，高效，節(jié)能環(huán)保，可作為評價該藥品中黃芪質(zhì)量的有效方法。