基于代謝組學(xué)的特發(fā)性肺纖維化中醫(yī)藥研究思路與方法?

劉妍彤，呂曉東△，龐立健，臧凝子，劉勇明，張浩洋，

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種病因尚不明確的進(jìn)行性、纖維化性的慢性間質(zhì)性肺疾病[1]，該病常起病隱匿，表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難、厭食、消瘦、乏力，合并感染時(shí)可伴發(fā)熱、急性干咳伴少量黃痰及血痰、Velcro音，導(dǎo)致進(jìn)行性低氧血癥，最終因呼吸衰竭而致死，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的難題[2]。國(guó)內(nèi)外調(diào)查研究顯示，我國(guó)IPF平均發(fā)病年齡為66歲，發(fā)病高峰在70至80歲之間[3]。IPF患者確診后生存率隨時(shí)間推移顯著下降，平均生存時(shí)間不足3.5年，3年生存率為50%，5年生存率僅為20%[4]。西醫(yī)治療包括支持性氧療、肺康復(fù)訓(xùn)練、肺移植，藥物治療主要推薦吡非尼酮、尼達(dá)尼布，然而上述藥物靶點(diǎn)單一、可能存在不良反應(yīng)事件[5]，同時(shí)藥品價(jià)格昂貴。近年來(lái)，中醫(yī)藥在IPF的治療方面進(jìn)行了很多有益探索，能有效緩解臨床癥狀，且不良反應(yīng)少、價(jià)格低，尋求有效、安全的中醫(yī)藥治療方法成為目前主要的研究目標(biāo)。

代謝組學(xué)是通過(guò)機(jī)體終端的代謝產(chǎn)物來(lái)揭示生命活動(dòng)最本質(zhì)變化的一種現(xiàn)代科學(xué)分析方法，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥方劑、病證等領(lǐng)域[6，7]。既往IPF證候?qū)W大多采用理論溯源結(jié)合經(jīng)驗(yàn)分析的研究方法，近年來(lái)伴隨著系統(tǒng)生物學(xué)的出現(xiàn)，定量化、客觀化、規(guī)范化的研究方法陸續(xù)出現(xiàn)，對(duì)IPF的研究逐漸從理論向分子方向進(jìn)一步延伸，本文意在進(jìn)一步探討基于代謝組學(xué)的IPF中醫(yī)藥研究思路及方法。

1 代謝組學(xué)的研究?jī)?nèi)容

代謝組學(xué)(metabolomics)是由英國(guó)Nicholson教授在1999年提出的，建立在基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上，主要研究生物體自身代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及變化規(guī)律，分析生物系統(tǒng)表達(dá)的一門新興組織學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[8]。代謝組學(xué)以研究對(duì)象的體液(主要是血液和尿液)為樣本[9]，用液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用、核磁共振、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜等現(xiàn)代分離技術(shù)進(jìn)行分析[10]。通過(guò)以上技術(shù)對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行逐層分析處理，通過(guò)追蹤代謝標(biāo)記物找到其中潛在的靶點(diǎn)信息，再通過(guò)富集分析等手段進(jìn)一步找出代謝的通路及途徑，發(fā)掘其生物學(xué)過(guò)程及意義[11]。代謝組學(xué)對(duì)最終代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析研究，找出有代表性的標(biāo)記物，從代謝途徑來(lái)追溯更深層次的病理機(jī)制及病理生理改變，能夠更加直觀地展現(xiàn)機(jī)體代謝的狀態(tài)，將抽象的理化指標(biāo)以更加整體性、客觀性的方式進(jìn)行展現(xiàn)，有利于對(duì)復(fù)雜性整體進(jìn)行全面的分析認(rèn)知。其應(yīng)用范圍包括研究基因的解析、疾病病理的闡述、藥物的設(shè)計(jì)與研發(fā)、疾病標(biāo)志物的篩選和疾病的診斷及治療效果的預(yù)測(cè)等，對(duì)于探究疾病發(fā)生發(fā)展的生理變化和病理改變有著重要意義，亦有助于發(fā)掘后續(xù)的治療手段和方法。

2 將代謝組學(xué)引入中醫(yī)藥研究中的意義

隨著近年來(lái)系統(tǒng)生物學(xué)的不斷發(fā)展，中醫(yī)學(xué)復(fù)雜理論體系的價(jià)值及內(nèi)涵逐步得到完善。作為后基因時(shí)代的新興技術(shù)手段，代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)通過(guò)對(duì)人體體液中的組成成分變化進(jìn)行分析，以反映機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)的整體變化規(guī)律，其精髓在于構(gòu)建生物體系中分子族之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，具有融整體、動(dòng)態(tài)、整合分析的特點(diǎn)[12]。中醫(yī)學(xué)“證候”體現(xiàn)的是人體疾病某一階段臟腑經(jīng)絡(luò)陰陽(yáng)、氣血津液輸布的動(dòng)態(tài)變化以及與外界環(huán)境的交互作用，是全身功能關(guān)系失調(diào)的外在表現(xiàn)，涉及人體多系統(tǒng)、多層面的物質(zhì)變化，辨證的過(guò)程是從機(jī)體宏觀的外在表象來(lái)觀察生命活動(dòng)和疾病變化過(guò)程。因此應(yīng)用代謝組學(xué)來(lái)研究疾病的發(fā)生發(fā)展具有“整體性”和“系統(tǒng)性”的特點(diǎn)，與中醫(yī)的整體思維不謀而合，兩者在方法論原理上具有統(tǒng)一性，為中醫(yī)診療疾病提供了新的研究思路與平臺(tái)。

3 基于代謝組學(xué)IPF中醫(yī)藥研究思路與方法——病、證、方、效

3.1 辨“病”應(yīng)包括宏觀證候與微觀病理基礎(chǔ)

疾病的發(fā)生發(fā)展模式是一種動(dòng)態(tài)的演變過(guò)程，IPF患者表現(xiàn)于外的宏觀證候與表現(xiàn)于內(nèi)的微觀病理基礎(chǔ)是導(dǎo)致多系統(tǒng)疾病產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。IPF在疾病的不同階段表現(xiàn)出不同的病理表現(xiàn)以及臨床特征，故不同階段的IPF可在代謝產(chǎn)物方面顯示出差異性。因此基于代謝組學(xué)，從IPF代謝網(wǎng)絡(luò)終端的整體角度探索生物體液、組織中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，對(duì)IPF的代謝特點(diǎn)進(jìn)行多層次、多靶點(diǎn)的整合分析，有助于體現(xiàn)出IPF下的整體狀態(tài)以及生物體產(chǎn)生的整體效應(yīng)，對(duì)IPF進(jìn)行辨“病”分析。研究表明，肺纖維化代謝通路以神經(jīng)酰胺酶、磷脂酶為代表的鞘磷脂類代謝為主，神經(jīng)酰胺酶、磷脂酶類代謝通路的差異性是肺纖維化炎癥等癥狀存在的基礎(chǔ)，也是參與肺纖維化疾病發(fā)展過(guò)程中的主要通路所在[13]。ZHAO等[14]應(yīng)用質(zhì)譜法檢測(cè)8例IPF患者和8例健康受試者的肺組織，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，IPF組存在鞘脂、精氨酸、能量代謝、血紅素和谷氨酸/天冬氨酸代謝的信號(hào)通路改變，反映了IPF存在能量代謝紊亂、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、細(xì)胞增殖增加、肺結(jié)構(gòu)重塑及氧化應(yīng)激增加，該研究可從代謝組學(xué)角度解讀IPF的發(fā)病機(jī)制。

因此在IPF的中醫(yī)診療中，從宏觀層面調(diào)節(jié)臟腑、平衡陰陽(yáng)的同時(shí)，還應(yīng)注意對(duì)微觀損傷的緩解作用，其中包括疾病狀態(tài)下的病理學(xué)基礎(chǔ)以及分子層面的生物學(xué)信息。

3.2 辨“證”意在建立證型的客觀化判別標(biāo)準(zhǔn)

證是中醫(yī)學(xué)對(duì)疾病發(fā)展到某一階段時(shí)機(jī)體整體狀態(tài)的概括，是受機(jī)體內(nèi)因與環(huán)境外因綜合作用的結(jié)果。中醫(yī)學(xué)的核心理念是從系統(tǒng)全面的角度，以整體動(dòng)態(tài)的觀念對(duì)疾病進(jìn)行辨證論治，這與代謝組學(xué)全面性、系統(tǒng)性的作用原理具有一致性。因此，將代謝組學(xué)引入中醫(yī)證候?qū)W的研究中，其評(píng)價(jià)具有整體性和客觀性。

目前代謝組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于多種疾病的證型研究之中，證明了代謝組學(xué)研究手段在揭示中醫(yī)臨床證本質(zhì)研究中的可行性[15]。簡(jiǎn)維雄等[16]基于代謝組學(xué)探討心血瘀阻證的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，提示血瘀證不同時(shí)期分別存在脂質(zhì)代謝紊亂、尿素循環(huán)紊亂以及糖代謝障礙。徐舒等[17]運(yùn)用氫核磁共振(1 H nuclear magnetic resonance,1 H NMR)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)“肝郁證”狀態(tài)下的代謝生物群，以此闡釋肝郁證的本質(zhì)。朱萱萱等[18]基于氣相層析飛行時(shí)間式質(zhì)譜術(shù)(gas chromatography tandem time-of flight mass spectrometry,GC-TOF-MS)，對(duì)氣虛血瘀型和痰阻心脈型進(jìn)行區(qū)分。

總之，通過(guò)建立數(shù)據(jù)模型，從大量來(lái)自不同個(gè)體的樣本信息中得到同一證型的共同代謝指標(biāo)，即可作為客觀化的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)偏離出正常范圍的特征性代謝表達(dá)圖譜，則判定為多維多息圖譜的形式在代謝物表達(dá)上的客觀反映，即不同證候的差異性物質(zhì)基礎(chǔ)，這為日后研究中醫(yī)證候及其生物學(xué)本質(zhì)提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。通過(guò)代謝組學(xué)的研究手段，發(fā)現(xiàn)IPF不同證候之間的差異性代謝產(chǎn)物，推測(cè)出與之有關(guān)的代謝途徑，即可建立IPF不同證候識(shí)別模式的客觀化及量化的依據(jù)。

3.3 辨“方”意在闡明藥效基礎(chǔ)及有效性機(jī)制

中藥方劑成分多樣、靶點(diǎn)不一以及給藥形式的特殊性、方證對(duì)應(yīng)的專屬性，決定了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)鑒別的復(fù)雜性。因此，尋求一種可靠、客觀的研究手段是中藥復(fù)方研究的首要任務(wù)。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新興學(xué)科，可以從終端反映生命的整體信息，被認(rèn)為是挖掘藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、闡明作用機(jī)制的有效辦法。目前，代謝組學(xué)在中藥復(fù)方作用機(jī)制以及物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中得到了廣泛的應(yīng)用[19]。王喜軍[20，21]創(chuàng)建并建立了中醫(yī)方證代謝組學(xué)“Chinmedomics”，為基于代謝組學(xué)的IPF辨“方”提供了導(dǎo)向作用，提示通過(guò)血清學(xué)代謝產(chǎn)物的變化反映出方劑作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。Yang B[22]、Wang XJ[23]、耿放[24]等分別利用代謝組學(xué)方法，探討酸棗仁湯防治失眠、溫心方治療心肌缺血、逍遙散治療急性肝損傷的作用機(jī)制以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，主要涉及糖酵解、脂肪酸代謝、氨基酸代謝等代謝途徑。

以上結(jié)果表明，代謝組學(xué)能客觀地反映中藥方劑作用于人體后機(jī)體產(chǎn)生的生物學(xué)指標(biāo)，進(jìn)而對(duì)其產(chǎn)生的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行客觀化反映。將其作為藥物的有效性、安全性的物質(zhì)基礎(chǔ)及療效判定指標(biāo)，是一種具有系統(tǒng)性、整體性的研究方法。因此，在中藥方劑臨床應(yīng)用有效性的前提下，將證候?qū)?yīng)的內(nèi)源性生物標(biāo)記物與外源性方劑有效成分相關(guān)聯(lián)，能夠說(shuō)明方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，闡明效性機(jī)制，揭示方劑配伍規(guī)律及其科學(xué)內(nèi)涵。

3.4 辨“效”意在尋找IPF治療效果的客觀化反應(yīng)

目前，已有一定研究將代謝組學(xué)引入IPF生物標(biāo)志物的研究當(dāng)中。研究顯示，應(yīng)用超高效液相色譜聯(lián)合高分辨率質(zhì)譜的方法，顯示溶血磷脂酰膽堿(Lyso PC)可以作為IPF患者血清中的潛在生物標(biāo)志物[25]。呼出氣冷凝液(exhaled breath condensate,EBC)由于濃度低和方法學(xué)限制，分析潛在的生物標(biāo)志物很困難。通過(guò)使用非靶向代謝組學(xué)方法，可以有效識(shí)別IPF患者以及健康對(duì)照組的差異性代謝譜[26]。Montesi SB等[27]通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了11個(gè)肺纖維化患者的血漿和呼出氣冷凝液脂質(zhì)組學(xué)，在EBC中鑒定出9種溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,LPC)，其中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)顯著升高，被認(rèn)為是肺纖維化進(jìn)展的生物標(biāo)記物。1項(xiàng)研究納入22例未接受治療的IPF患者和18例健康受試者的血液樣本，經(jīng)超高效液相色譜結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)，提示2組之間存在62種差異脂質(zhì)，其中6種(R7、R9、R13、R16、R17和R21)可作為潛在的生物標(biāo)志物，經(jīng)接受者操作特性曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析可區(qū)分IPF患者與健康人群[28]。亦有研究顯示，在IPF肺組織中乳酸代謝增加[29]。在IPF呼出的氣體中，氨基酸水平增加[30]，兩者皆可被用做IPF的生物標(biāo)志物。

因此，脂質(zhì)、溶血磷脂酰膽堿、乳酸以及氨基酸是目前經(jīng)代謝組學(xué)研究出IPF的幾種生物標(biāo)志物?；诖朔椒蓪?duì)IPF的其余生物標(biāo)志物進(jìn)一步發(fā)掘探討，同時(shí)這些代謝標(biāo)志物可作為IPF治療效果的客觀化判定指標(biāo)。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上，代謝組學(xué)以系統(tǒng)方法研究為模式，切合中醫(yī)理論中的整體觀念，切合中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)IPF中醫(yī)藥研究科學(xué)化、客觀化和規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化的重要方法。通過(guò)代謝產(chǎn)物的整合與分析，能更加直觀地反映IPF狀態(tài)下分子層面的內(nèi)在表現(xiàn)，幫助“辨病”；了解IPF不同證候下的差異代謝譜，掌握不同證候下的客觀化判別指標(biāo)，幫助“辨證”；掌握方劑在體內(nèi)的化學(xué)成分變化，探尋方劑的作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，幫助“辨方”；尋找篩查出藥物或臨床相關(guān)的生物標(biāo)記物，從微觀角度對(duì)機(jī)體的整體信息進(jìn)行全面解讀，幫助“辨效”，形成IPF辨“病”“證”“方”“效”診療模式，最終形成基于代謝組學(xué)的IPF中醫(yī)藥研究思路與方法。并基于此模式，對(duì)其他疾病的中醫(yī)藥診療思路進(jìn)行研究及探討，一方面可以豐富中醫(yī)理論的科學(xué)內(nèi)涵，另一方面可以促進(jìn)中西醫(yī)的有效結(jié)合，促進(jìn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化、國(guó)際化，讓系統(tǒng)生物學(xué)成為中醫(yī)走向國(guó)際化的通用語(yǔ)言。