外源H2S緩解小麥苗期干旱脅迫的生理生化基礎(chǔ)

闞文杰，姚緣圓，蘇鵬飛，李明浩，王大成，曹明輝，鐘文玲，湯才國，吳麗芳

(1.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽 合肥 230039；2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 離子束生物工程與綠色農(nóng)業(yè)研究中心，安徽 合肥 230031；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230031；4.中科太和試驗站，安徽 阜陽 236626)

小麥(TriticumaestivumL.)是全球三大主食之一，中國是世界小麥生產(chǎn)大國及消費大國[1]，2020年我國小麥種植面積占全年糧食種植總面積的20.02%，達(dá)2.338×107hm2，小麥產(chǎn)量占全年糧食總產(chǎn)量的20.05%，達(dá)1.342 5×108t[2]，小麥的穩(wěn)產(chǎn)和增產(chǎn)對我國糧食安全戰(zhàn)略起到了重要作用.隨著全球氣候變化，極端天氣頻發(fā)，當(dāng)前小麥生產(chǎn)仍然面臨病蟲害及各種外部非生物的威脅，且有常發(fā)、重發(fā)趨勢[3-7].干旱脅迫是主要的非生物脅迫因子，對小麥的生長發(fā)育具有重大的威脅，是全球主要小麥產(chǎn)區(qū)產(chǎn)量不穩(wěn)定的主要原因，據(jù)估計其年不穩(wěn)定性約為40%[8].中國水資源稟賦條件較差，人均水資源量僅2 100 m3，是世界上13個貧水國之一，其中農(nóng)業(yè)水資源也只有全世界平均水平的75%[9].例如黃淮冬麥區(qū)是我國小麥生產(chǎn)的重要產(chǎn)區(qū)，該麥區(qū)小麥種植面積占全國小麥種植總面積的70%，然而，該麥區(qū)地下水水位有不斷下降的趨勢，其中江蘇、河南、山西、河北及甘肅地區(qū)處于我國人均水資源中低水平(穩(wěn)定)，安徽處于我國人均水資源中低水平(不穩(wěn)定)[10-11].因此研究提升小麥苗期抗旱能力及抗旱機(jī)制對于應(yīng)對小麥干旱脅迫具有重要意義.

大量研究表明H2S在植物逆境脅迫中具有重要作用[12].H2S具有臭雞蛋氣味，是繼NO和CO之后在動植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子[13].在動物體內(nèi)H2S起著重要的信號傳導(dǎo)作用[14]，內(nèi)源H2S的含量影響著心血管及肺部功能[14-15]，同時H2S在多種癌癥及心血管疾病的臨床治療中作用顯著[16-17]，目前開發(fā)的可釋放H2S的多種藥物被應(yīng)用于臨床試驗[18].H2S在植物的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用[13]，如內(nèi)源H2S參與種子萌發(fā)、氣孔調(diào)節(jié)及果實發(fā)育等過程[19]；H2S與植物激素及其他植物體內(nèi)信號分子具有復(fù)雜的調(diào)控作用，如與植物激素脫落酸(abscisic acid，簡稱ABA)、茉莉酸(jasmonic acid，簡稱JA)，以及與氣體信號分子NO和CO都有重要的聯(lián)系[20-24].外源施加H2S在植物響應(yīng)滲透脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫、溫度脅迫及紫外脅迫等眾多非生物脅迫和條銹病等生物脅迫中起到了正調(diào)節(jié)作用[25-29].H2S在動物中被看作是磷酸酶活性重要的上游調(diào)控分子，H2S通過影響磷酸酶的活性來影響磷酸酶下游信號的作用[30].而在植物中，多種磷酸酶被看作是應(yīng)對環(huán)境脅迫的重要成分[31-32].

磷酸酶廣泛存在于動植物體內(nèi)，是一類將底物去磷酸化的酶.磷酸酶按發(fā)揮作用所需酸堿環(huán)境可以分為酸性磷酸酶(acid phosphatase，簡稱ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，簡稱ALP)；按所催化的底物特異性可分為酪氨酸特異性磷酸酶(protein tyrosine phosphatase-1B，簡稱PTP1B)、絲氨酸/蘇氨酸特異性磷酸酶(serine/threonine phosphatases，簡稱PSPs)、雙特異性磷酸酶(dual-specific phosphatase，簡稱VHR)和組氨酸磷酸酶(histidine phosphatase，簡稱PHP)等；按所依賴的活性位點可分為半胱氨酸依賴的磷酸酶和金屬磷酸酶.磷酸酶被報道定位于植物細(xì)胞的液泡、葉綠體、線粒體、過氧化物酶等多個位置[31].多種磷酸酶被證明對多種植物激素、氣體信號分子以及MAPK基因等具有重要的調(diào)節(jié)作用[33-36].例如，多種紫色酸性磷酸酶被證明在植物抵御逆境脅迫中同時起到了重要作用[37]，部分研究推測紫色酸性磷酸酶在活性氧(ROS)代謝中也發(fā)揮了重要作用[38].植物細(xì)胞液泡中存在大量酸性磷酸酶調(diào)控液泡形態(tài)[31]，而液泡對植物細(xì)胞的滲透壓具有調(diào)控作用，因此磷酸酶的活性可能影響著植物細(xì)胞的滲透壓.同時植物體內(nèi)源H2S的主要生成方式是通過半胱氨酸脫硫酶及脫巰基酶分解半胱氨酸而產(chǎn)生[39]，而多種磷酸酶需要與半胱氨酸結(jié)合形成中間體后才能被激活，這意味著植物內(nèi)源H2S的合成和磷酸酶發(fā)揮酶活性之間可能存在競爭調(diào)節(jié)機(jī)制.可以說，H2S與植物體內(nèi)磷酸酶可能存在著多種調(diào)節(jié)機(jī)制幫助植物抵御非生物脅迫.Ou等[40]設(shè)計了一種可同時探測細(xì)胞內(nèi)磷酸酶和H2S含量的熒光探針，并發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中存在一個H2S臨界水平來控制磷酸酶的活性，H2S含量在臨界值附近的微小偏差將顯著降低磷酸酶的活性.然而在植物中磷酸酶與H2S在逆境脅迫中的作用暫無報道.

筆者以NaHS為外源H2S供體，探究外源H2S在干旱脅迫下對小麥幼苗在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及生化水平上的影響，并在植物中首次發(fā)現(xiàn)外源H2S在干旱脅迫下促進(jìn)小麥葉片中的磷酸酶活性，為進(jìn)一步研究H2S調(diào)控小麥抵御干旱脅迫機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥品種百農(nóng)207(TriticumaestivumL. cv. Bainong 207)，由筆者實驗室留種.3 g NaHS·nH2O(購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)溶于500 mL純水，配制成75 mmol·L-1的母液后于4 ℃冰箱中儲存.200 g PEG-6000(購自生工生物工程，上海)溶于純水后定容至1 000 mL，配置成20% PEG-6000溶液.

1.2 試驗設(shè)計與方法

取籽粒大小一致，均勻飽滿健康的百農(nóng)207小麥種子，使用5%的次氯酸鈉溶液浸洗2 min，再用雙蒸水反復(fù)沖洗6次，將小麥種子置于潔凈培養(yǎng)皿(直徑150 mm)中加純水培養(yǎng)12 h后置于4 ℃冰箱中6 h，使小麥種子萌發(fā)一致.在潔凈培養(yǎng)皿中平鋪6層濾紙，加入純水至濾紙浸透，選取露白一致的小麥種子，腹部朝下均勻放置在濾紙上(50粒/皿)，置于光照培養(yǎng)間(100 μmol·m-2·s-1，25 ℃，16 h光照/8 h黑暗)中培養(yǎng)，每天使用移液槍注入20 mL純水保持濾紙的浸濕狀態(tài).待小麥幼苗第1片葉片長至4～5 cm時，將小麥幼苗重新移植到含有500 mL 1/2 Hoagland營養(yǎng)液(海博生物技術(shù)有限公司，青島)的黑色塑料盒中(規(guī)格為14 cm×9 cm×5 cm)，繼續(xù)光照水培養(yǎng).

待小麥幼苗生長至兩葉一心期，選取長勢一致的小麥幼苗，分為4組：(1)對照組(CK)：1/2 Hoagland營養(yǎng)液+葉面噴施純水培養(yǎng)；(2)對照組+H2S組(CK+H2S)：1/2 Hoagland營養(yǎng)液+葉面噴施1.0 mmol·L-1NaHS培養(yǎng)；(3)干旱脅迫(PEG)：1/2 Hoagland營養(yǎng)液+20% PEG-6000(w/v)+葉面噴施純水培養(yǎng)；(4)干旱脅迫+H2S組(PEG+H2S)：1/2 Hoagland營養(yǎng)液+20% PEG-6000(w/v)+葉面噴施1.0 mmol·L-1NaHS培養(yǎng).其中，(CK+H2S)組的小麥幼苗在干旱脅迫后立即噴施純水至小麥幼苗每個葉片掛滿水珠；(PEG+H2S)組的小麥幼苗在干旱脅迫后立即噴施1.0 mmol·L-1NaHS至小麥幼苗每個葉片掛滿水珠；(PEG)和(PEG+H2S)組的幼苗用20% PEG-6000模擬干旱進(jìn)行脅迫處理.4個處理每個處理各設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，每組30株小麥幼苗.各組處理1，3，7，10 d時取樣，樣品分別裝入2 mL離心管后置于液氮中冷凍，將樣品放入-80 ℃冰箱保存.

1.3 測定項目和方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定

(1) 生長指標(biāo)測定：取各處理組處理10 d時的小麥幼苗，用純水清洗，并擦干植株表面水分后，測量株高和根長，將植株地上部分和地下部分分開，立即稱重記為地上部分鮮重和地下部分鮮重.隨后，將小麥幼苗地上部分及地下部分放于牛皮紙袋中置于烘箱內(nèi)，105 ℃殺青1 h，80 ℃下烘干48 h至恒重后稱重，記為地上部分干重及地下部分干重.

(2) 葉片相對含水量測定：小麥葉片含水量(relative water content, 簡稱RWC)的測定參照Wang等[41]的方法，略有修改.取所有處理組處理10 d時的小麥幼苗，用純水清洗，擦干植株表面水分后，將小麥幼苗葉片稱重，記為鮮重.將葉片浸入雙蒸水中浸泡過夜充分吸水后取出，用吸水紙擦干葉片表面水分，稱重，記為結(jié)合水重.最后，小麥幼苗葉片置于烘箱中，105 ℃殺青1 h，80 ℃下烘干48 h至恒重后稱重，記為干重，每個處理重復(fù)4次.RWC計算公式為：RWC(%)=(鮮重-干重)/(結(jié)合水重-干重)×100.

1.3.2 小麥內(nèi)源H2S含量測定

小麥內(nèi)源H2S含量測定采用Sekiya等[42]的方法，略有修改.取小麥幼苗第2片功能葉，擦干表面水分后，稱取0.1 g置于液氮中速凍后在離心管中加入鋼珠放入打樣機(jī)(高通組織研磨儀Tiss-24，上海凈信)中磨碎，磨碎后加入1.5 mL 20 mmol·L-1的Tris-HCl(pH 7.4)并充分渦旋為勻漿，在4 ℃、12 000×g 條件下離心1 min，收集上清液；取0.5 mL上清液，將裝有醋酸鋅的吸收井置于內(nèi)盛上清液的測試管內(nèi)，加入100 μL 20 mmol·L-1N,N-二甲基-對苯二胺(溶于7.2 mol·L-1HCl)和 100 μL 30 mmol·L-1FeCl3(溶于1.2 mol·L-1HCl)，迅速封口，于37 ℃水浴30 min；測定670 nm波長吸光度，通過相同的程序以未使用的醋酸鋅溶液制備空白.每次測定時，用已知濃度的Na2S溶液繪制校準(zhǔn)曲線.

1.3.3 光合效率測定

光系統(tǒng) II(photosystem Ⅱ complex, 簡稱PSⅡ)的最大光化學(xué)效率Fv/Fm(Fv為可變條件下的熒光值，F(xiàn)m為暗適應(yīng)條件下的最大熒光值)測定前將小麥幼苗置于暗室中暗適應(yīng)20 min，然后使用植物光合效率現(xiàn)場測定儀(中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所)測定其PSII光能轉(zhuǎn)化效率.

1.3.4 抗氧化酶活性測定

小麥幼苗超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, 簡稱SOD)、過氧化物酶(peroxidase, 簡稱POD)活性的測定分別參照總超氧化物歧化酶測定試劑盒、過氧化物酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)的說明進(jìn)行；小麥幼苗抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，簡稱APX)活性的測定參照APX比色法測試盒(Elabscience，武漢)的說明進(jìn)行.

1.3.5 過氧化氫和丙二醛含量測定

小麥幼苗過氧化氫(H2O2)、丙二醛(malondialdehyde, 簡稱MDA)含量的測定分別參照過氧化氫測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)的說明進(jìn)行.

1.3.6 脯氨酸含量測定

小麥幼苗脯氨酸(proline, 簡稱Pro)含量的測定參照脯氨酸比色法試劑盒(Elabscience，武漢)的說明進(jìn)行.

1.3.7 堿性磷酸酶及酸性磷酸酶含量測定

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,簡稱ALP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)的活性分別按照堿性磷酸酶測定試劑盒、酸性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)的說明測定.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，實驗數(shù)據(jù)為每個處理組含3次生物學(xué)重復(fù)測定值的平均值，并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，試驗所得數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差分析，采用Ducan’s測驗分析在p≤0.05水平上的顯著性，使用GraphPad Prism 8作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源葉面噴施NaHS對干旱脅迫抑制小麥幼苗生長的緩解作用

形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)是衡量小麥抵御干旱脅迫能力的重要指標(biāo)[43].干旱脅迫使得(PEG)組小麥幼苗葉片卷曲萎蔫、部分葉片出現(xiàn)黃化.與(PEG)組相比，外施NaHS 10 d時，(PEG+NaHS)組小麥幼苗的干旱癥狀得到明顯緩解，葉片頂端未發(fā)生黃化現(xiàn)象，葉片卷曲程度較小，葉片整體萎蔫程度有所緩解(圖1)；(PEG+NaHS)組小麥株高顯著增加9.63%(圖1，圖2(a)).當(dāng)植物在受到干旱脅迫時，根部將會最先感受到并迅速向植物發(fā)出訊號以做出對干旱脅迫的反應(yīng)，根系自身也會做出形態(tài)上的反應(yīng)以應(yīng)對干旱脅迫[44]，因此根長與小麥的抗旱性密切相關(guān)[45].與(PEG)組相比，(PEG+NaHS)組小麥根長顯著增加了19.7%(圖1，圖3(a))，這表明施加外源H2S改善了干旱脅迫下小麥幼苗的根部形態(tài)，提升了小麥幼苗抗旱性能.與(PEG)組相比，(PEG+NaHS)組小麥幼苗整株、地上部分及地下部分的干重及鮮重都呈現(xiàn)出顯著增加的趨勢(圖2～3).其中地上干重與對照組相比增加了17.63%，地下部分增加了12.58%；地上部分鮮重與對照組相比增加了22.67%，地下部分鮮重增加了21.94%(圖2)，這可能與H2S調(diào)控植物的生長發(fā)育過程有關(guān)，大量研究表明H2S對植物根的生長及葉片衰老過程起著重要的作用[46].

圖1 不同處理下小麥幼苗的生長狀況(比例尺：1 cm)

相對含水量是衡量植物脫水耐受性最有意義的指標(biāo)[47]，抵御失水可有效幫助植物提高自身抗旱性[48].干旱脅迫下葉片相對含水量顯著降低，與(PEG)組相比，處理10 d后，(PEG+NaHS)組小麥幼苗葉片的相對含水量顯著增加了2.47%(圖2(d)).當(dāng)小麥遭受干旱脅迫時，外源NaHS幫助小麥氣孔收縮，減少蒸騰作用，同時減少CO2的吸收來維持植物相對含水量，提升了小麥葉片抗脫水的能力，增加植物的光合作用速率，從而緩解了干旱脅迫對小麥幼苗生長的影響[49].

(a)株高，(b)地上部分干重，(c)地上部分鮮重，(d)葉面相對水含量；圖柱上不同小寫字母(a,b,c,d)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖2 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗地上部分生長狀況

(a)根長，(b)地下部分干重，(c)地下部分鮮重；圖柱上不同小寫字母(a,b,c,d)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖3 對干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗地下部分生長狀況

2.2 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS對小麥幼苗葉片內(nèi)源H2S含量的影響

葉片內(nèi)源H2S含量體現(xiàn)出小麥幼苗葉片H2S的整體水平.與(CK)組相比，(PEG)組及(PEG+NaHS)組小麥內(nèi)源H2S的含量均有所提升(圖4).小麥幼苗內(nèi)源H2S含量隨干旱脅迫時間的推移而不斷增加(圖4)，而外源葉面噴施NaHS后，小麥幼苗內(nèi)源H2S含量在干旱脅迫導(dǎo)致的內(nèi)源H2S提升的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高，在處理3 d時達(dá)到顯著差異水平(圖4(b)).各組處理7 d時，(PEG+NaHS)組小麥幼苗葉片內(nèi)源H2S較(PEG)組顯著增加了43.76%(圖4(c)).這表明外源葉面噴施NaHS提高小麥幼苗葉片中內(nèi)源H2S的水平，并隨著時間的延長內(nèi)源H2S的含量一直維持在較高水平.內(nèi)源H2S的上升，可在植物體內(nèi)進(jìn)一步放大H2S的信號，促進(jìn)半胱氨酸、谷胱甘肽及含硫蛋白質(zhì)的產(chǎn)生及下游各類信號分子的啟動[13]，在植物抗旱中發(fā)揮積極作用.

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖4 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗葉片的內(nèi)源H2S含量

2.3 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS對小麥幼苗光合指標(biāo)的影響

植物光合作用對干旱脅迫極其敏感[50]，干旱破壞了光捕獲和光利用之間的平衡，導(dǎo)致葉綠體中活性氧積累，從而導(dǎo)致類囊體膜解體和PSⅡ失活，進(jìn)一步使葉綠素含量下降以及光合速率下降，從而影響植物生長發(fā)育[51]，F(xiàn)v/Fm可以有效地反映PSⅡ的最大量子產(chǎn)率，表達(dá)植物光合作用的能力，是光合作用的敏感指標(biāo)[52].干旱顯著降低了小麥的光合速率(圖5)，而外源葉面噴施NaHS緩解了小麥幼苗的光合速率的下降，各組處理7 d時(PEG+NaHS)組較(PEG)組增加了3.02%.這一結(jié)果證明外源H2S幫助小麥幼苗緩解了干旱脅迫導(dǎo)致的PSII的光化學(xué)反應(yīng)的降低，降低了干旱脅迫對PSⅡ反應(yīng)中心的破壞.總而言之，研究結(jié)果表明了干旱脅迫下外源噴施H2S可提高小麥幼苗的光合效率.

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖5 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的光合速率

2.4 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS對小麥幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

干旱對植物細(xì)胞代謝反應(yīng)產(chǎn)生多種不利影響，活性氧(reactive oxygen species,簡稱ROS)積累[53]，而ROS的積累進(jìn)一步導(dǎo)致了膜脂過氧化[54].植物抵御活性氧提升植物抗氧化能力的方式有抗氧化酶的酶促反應(yīng)、非酶促反應(yīng)及非特異性抗氧化劑3種[55].抗氧化酶的酶促反應(yīng)系統(tǒng)中主要包括SOD，POD，APX等酶.SOD是催化活性氧O2-歧化為H2O2的關(guān)鍵酶，而H2O2可被POD及APX等酶進(jìn)一步催化成H2O，從而降低活性氧對植物的氧化損傷等傷害[56]；APX同時是抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)中的關(guān)鍵酶[57]，幫助谷胱甘肽等抗氧化物發(fā)生非酶促反應(yīng)清除活性氧.該研究中，與(PEG)組處理相比，外源噴施NaHS顯著提升了小麥SOD，POD，APX的活性，各組處理7 d時較(PEG+NaHS)組分別增加了13.83%，11.57%，41.87%(圖6～8)，這表明外源噴施NaHS可以顯著改善小麥抗氧化系統(tǒng)中的酶促反應(yīng)，降低干旱脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷對小麥幼苗帶來的影響，提升小麥幼苗的抗氧化能力.

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖6 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的SOD含量

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b,c)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖7 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的POD含量

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b,c)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖8 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的APX含量

2.5 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS對小麥幼苗丙二醛和過氧化氫含量的影響

干旱脅迫下，植物體內(nèi)活性氧的積累包括超氧自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(O2)[53]，其中H2O2會造成植物細(xì)胞膜損傷，使細(xì)胞膜通透性提高，進(jìn)而導(dǎo)致丙二醛(MDA)含量增加[56]，因此H2O2及MDA是最常用的脂質(zhì)過氧化指標(biāo)之一.相比于(PEG)組，(PEG+NaHS)組小麥幼苗中MDA和H2O2的含量均顯著下降(圖9～10)，對小麥幼苗的氧化損傷較小，在各組處理7 d時較(PEG)組分別降低了36.1%和65.72%(圖9(c)，圖10(c)).這些結(jié)果表明外源葉面噴施NaHS能減少干旱脅迫下小麥幼苗H2O2的積累，減輕膜損傷，降低細(xì)胞膜質(zhì)過氧化水平，這與上文SOD，POD，APX活性上升的實驗結(jié)果一致.

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b,c,d)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖9 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的H2O2含量

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b,c)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖10 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的MDA含量

2.6 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

滲透調(diào)節(jié)是小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫時重要的應(yīng)對機(jī)制.小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫時細(xì)胞通過誘導(dǎo)有機(jī)物質(zhì)或無機(jī)離子等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞液的滲透勢，以維持細(xì)胞內(nèi)正常的滲透壓，減少對小麥細(xì)胞膜的傷害[58-59].Pro是植物體內(nèi)常見的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在長時間的干旱脅迫下葉片中的Pro含量與小麥抗旱性呈正比關(guān)系[59-60].同時Pro還可以作為一種有效的非酶抗氧化劑清除活性氧來保護(hù)植物細(xì)胞[50].相比于(PEG)組，(PEG+NaHS)組小麥幼苗中Pro的含量在各處理組干旱脅迫處理后第1 d時無顯著差異，略有提高，第3 d及第7 d時均顯著提高，在第7 d時(PEG+NaHS)組較(PEG)組顯著增加了48.22%(圖11).研究結(jié)果表明，干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS使得小麥體內(nèi)Pro顯著上升，從而幫助小麥降低細(xì)胞內(nèi)水勢以抵御干旱脅迫.

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b,c)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖11 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的Pro含量

2.7 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS對小麥內(nèi)源磷酸酶活性的影響

在動物細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)源磷酸酶活性受到H2S調(diào)控[30, 61]的現(xiàn)象已受到廣泛關(guān)注，而植物中磷酸酶與H2S的關(guān)系尚未見報道.植物酸性磷酸酶受發(fā)育和環(huán)境因素的調(diào)節(jié).在小麥干旱研究中，酸性磷酸酶被看作是小麥抗旱的指標(biāo)之一，干旱脅迫下小麥內(nèi)源酸性磷酸酶的高活性體現(xiàn)出了更好的抗旱性能，干旱脅迫下植物酸性磷酸酶有助于維持細(xì)胞滲透壓及磷酸鹽水平[62].與此同時多種紫色酸性磷酸酶被證明在植物抗逆中起到了重要的作用[37]，干旱脅迫下，小麥葉片內(nèi)源磷酸酶活性下降，而外源葉面噴施NaHS后，顯著提升了小麥葉片內(nèi)源酸性磷酸酶活性(圖12).各組處理7 d時，(PEG+NaHS)組較(PEG)組小麥葉片中的酸性磷酸酶活性顯著增加了62.87%，這意味著外源補(bǔ)充NaHS提升了小麥酸性磷酸酶的活性，維持了小麥體內(nèi)正磷酸鹽(Pi)的水平，提升了小麥的去磷酸化水平，維持了細(xì)胞正常的滲透壓以防止植物失水[31]，同時磷酸酶活性上升可能通過調(diào)節(jié)其下游信號防止植物細(xì)胞失水，以達(dá)到抵御干旱脅迫的效果.植物體內(nèi)源H2S的主要生成方式是通過半胱氨酸脫硫酶及脫巰基酶分解半胱氨酸而產(chǎn)生[39]，內(nèi)源H2S的產(chǎn)生與磷酸酶發(fā)揮活性作用之間可能存在競爭調(diào)節(jié)機(jī)制，而外源補(bǔ)充H2S使得植物體內(nèi)不需要更多的半胱氨酸用于分解產(chǎn)生H2S，保證了內(nèi)源H2S處于高水平狀態(tài)，從而使得更多的半胱氨酸與磷酸酶結(jié)合，使得磷酸酶活性上升，激活下游信號分子抵御干旱對小麥幼苗的脅迫.筆者還發(fā)現(xiàn)，外源H2S的補(bǔ)充也提升了小麥葉片堿性磷酸酶的活性，在各組處理7 d時，(PEG+NaHS)組較(PEG)組增加了22.03%，提升了小麥抵御干旱脅迫的能力(圖13).

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b,c,d)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖12 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的酸性磷酸酶含量

(a)1 d，(b)3 d，(c)7 d；圖柱上不同小寫字母(a,b)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異.圖13 干旱脅迫下外源葉面噴施NaHS的小麥幼苗的堿性磷酸酶含量

3 結(jié)束語

H2S作為小麥體內(nèi)重要的氣體信號分子，外源葉面噴施NaHS緩解了干旱脅迫對小麥幼苗的影響.在干旱脅迫下，外源施加NaHS的小麥幼苗在干重、鮮重、結(jié)合水含量、株高、根長、葉片萎蔫程度及葉色等形態(tài)學(xué)指標(biāo)上均優(yōu)于干旱處理組.在生理學(xué)指標(biāo)方面與干旱處理組相比，外源施加NaHS提升了小麥葉片光合速率；提升了小麥葉片SOD，POD，APX活力，提升了小麥幼苗抗氧化能力；降低了H2O2及MDA含量，緩解了干旱帶來的膜損傷；降低了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro的含量，降低了干旱導(dǎo)致的失水；提升了小麥ACP及ALP活力及其去磷酸化水平，表明干旱脅迫下外源施加NaHS可能通過小麥的磷酸酶途徑抵御干旱脅迫，首次在植物中發(fā)現(xiàn)了H2S與磷酸酶之間具有調(diào)控關(guān)系.該研究主要從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及生物化學(xué)層面解釋H2S緩解小麥干旱脅迫機(jī)制，并揭示了在植物中H2S及磷酸酶之間可能存在的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步深入探究H2S在植物體內(nèi)的抗逆作用奠定基礎(chǔ).