植物乳桿菌HS-R9培養(yǎng)基的優(yōu)化

張 靖 軒， 叢 麗 娜， 陳 清 平， 何 媛 媛， 趙 金， 關(guān) 長(zhǎng) 城

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

植物乳桿菌為一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界廣泛存在，尤其是分布在海洋生物體和各類(lèi)發(fā)酵食品中，同時(shí)也是動(dòng)物胃腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道菌群平衡、改善腸道內(nèi)環(huán)境、增強(qiáng)免疫力和抵抗力等多種功能[1-3]。此外，許多植物乳桿菌在代謝過(guò)程中除了會(huì)產(chǎn)生乳酸、乙酸、過(guò)氧化氫外，還會(huì)產(chǎn)生一些具有抑菌活性的物質(zhì)，稱為的植物乳桿菌素。它是植物乳桿菌代謝過(guò)程中合成并分泌到環(huán)境中的一類(lèi)具有抑菌活性的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)[4-5]。田雪嬌等[6]從泡菜中分離出一株植物乳桿菌LY-78，研究表明它能明顯抑制致病菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)牛肉保存時(shí)間。Wang等[7]從西藏牦牛糞便中分離出兩株植物乳桿菌，它們對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用。Agbankpe等[8]從動(dòng)物體內(nèi)分離出來(lái)一株植物乳桿菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在體外能明顯抑制沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。由于植物乳桿菌素?zé)o毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性，并且可以抑制或殺死多種食品中常見(jiàn)的致病菌，具有熱穩(wěn)定性且易被人體腸道消化降解，因而作為一種生物防腐劑受到食品工業(yè)青睞[9]。

科學(xué)的培養(yǎng)基組分和配比不僅促進(jìn)菌體的快速生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)微生物代謝性能，也能提高資源利用率，降低生產(chǎn)成本[10-11]。在提高菌種生長(zhǎng)方面，高玉榮等[12]利用正交試驗(yàn)優(yōu)化植物乳桿菌G1-28培養(yǎng)基，活細(xì)胞數(shù)最多可達(dá)1.98×1010CFU/mL；在提高抑菌活性方面，王瑤等[13]利用響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌LPL-1培養(yǎng)基成分，使細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià)提高了1.62倍。以往實(shí)驗(yàn)室利用培養(yǎng)乳酸菌的通用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，但使用該培養(yǎng)基所分泌活性物質(zhì)的產(chǎn)量較低，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)要求。

本實(shí)驗(yàn)以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，使用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，以期提高植物乳桿菌的發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

實(shí)驗(yàn)菌株：植物乳桿菌HS-R9，本實(shí)驗(yàn)室從大連海域的海參腸道中篩選得到。

指示菌株：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

原始培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，乙酸鈉2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，磷酸二氫鉀2 g，檸檬酸銨2 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g；加蒸餾水至1 000 mL，pH調(diào)至6.3，121 ℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g；加蒸餾水至1 000 mL，pH調(diào)至7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 菌株活化與發(fā)酵

一級(jí)活化：將植物乳桿菌HS-R9接入10 mL的MRS液體培養(yǎng)基之中，接種量1%，在37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

二級(jí)活化：將一級(jí)活化后的菌液接種于50 mL 的MRS培養(yǎng)基，接種量2%，在37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將二級(jí)活化后的菌液接種于100 mL 的MRS培養(yǎng)基中，接種量5%，在37 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別選擇不同組分作為培養(yǎng)基的碳源、氮源和緩沖溶劑。碳源包括乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉；氮源包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨；緩沖溶劑包括檸檬酸銨、檸檬酸氫二銨、硫酸銨、碳酸銨。分別將各個(gè)培養(yǎng)基在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)植物乳桿菌48 h，取發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min得到上清液。以副溶血性弧菌為指示菌，利用牛津杯法進(jìn)行抑菌圈測(cè)定。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將碳源、氮源、緩沖溶劑3個(gè)關(guān)鍵因子設(shè)為考察變量。使用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件中Box-Benhnken模塊進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化由單因素試驗(yàn)選取的培養(yǎng)基成分的最佳添加量[14]。該3個(gè)關(guān)鍵因子按響應(yīng)面設(shè)計(jì)不同添加量配制發(fā)酵培養(yǎng)基，共17組，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)；在37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h后，收集發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的測(cè)定

發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定：各組離心后取上清液，以副溶血性弧菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，比較抑菌圈直徑。

發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定：取發(fā)酵上清液各100 mL，與乙酸乙酯按體積比1∶1.5混合，20 ℃攪拌萃取12 h，分離發(fā)酵液與萃取液。取萃取液100 mL在40 ℃下真空旋干，測(cè)定各組發(fā)酵產(chǎn)物并進(jìn)行比較。

1.2.4 發(fā)酵液對(duì)食品中常見(jiàn)致病菌抑菌活性的測(cè)定

利用幾種在食品工業(yè)和養(yǎng)殖行業(yè)中常見(jiàn)的致病菌作為指示菌，包括銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。將培養(yǎng)后的指示菌液體分別涂布于LB固體平皿上，再取發(fā)酵上清液200 μL加入牛津杯中，將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放置在37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，測(cè)定抑菌圈直徑，確定發(fā)酵液對(duì)不同菌種的抑菌作用。

1.2.5 溫度和pH對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，取上清液進(jìn)行試驗(yàn)。共設(shè)置8組試驗(yàn)，每組做3個(gè)平行。研究溫度對(duì)抑菌活物質(zhì)活性的影響，將每個(gè)試驗(yàn)組分別置于37(對(duì)照組)、40、50、60、70、80、90、100 ℃的環(huán)境中處理30 min，水平將上清液冷卻至常溫，測(cè)定其抑菌活性。研究pH對(duì)抑菌活物質(zhì)活性的影響，將上清液pH分別調(diào)至1、2、3、4(對(duì)照組)、5、6、7、8，在37 ℃下處理1 h后，測(cè)定其抑菌活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由表1可以看出，在碳源選擇試驗(yàn)中，各碳源的抑菌圈直徑從大到小依次是乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉，其中乳糖作為碳源時(shí)得到的抑菌圈直徑最大，因此選擇乳糖作為碳源。在氮源選擇試驗(yàn)中，各氮源的抑菌圈直徑從大到小依次是酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨，其中酵母浸粉作為氮源時(shí)抑菌圈直徑最大，因此選用酵母浸粉作為氮源。在緩沖溶劑的選擇試驗(yàn)中，各緩沖溶劑的抑菌圈直徑從大到小依次是檸檬酸銨、檸檬酸氫二銨、碳酸銨、硫酸銨，其中檸檬酸銨作為緩沖溶劑時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到19.1 mm；因此選擇檸檬酸銨作為緩沖溶劑。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The results of single factor experiment

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和結(jié)果

以乳糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、檸檬酸銨3 g/L 為中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Benhnken設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Benhnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平Tab.2 Box-Benhnken experimental design g/L

各個(gè)因素在回歸擬合后，計(jì)算得到植物乳桿菌發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑。乳糖(A)、酵母浸粉(B)、檸檬酸銨(C)質(zhì)量濃度的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=22.07-0.34A+0.34B-0.17C-0.28AB+0.12AC-0.21BC-1.85A2-1.71B2-1.36C2

表3 響應(yīng)面方差分析表Tab.3 Response surface analysis of variance

2.3 響應(yīng)面分析及最佳培養(yǎng)基成分的確定

由圖1可看出乳糖、酵母浸粉、檸檬酸銨三因素的交互作用明顯，對(duì)抑菌圈直徑影響極為顯著。根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參數(shù)的最佳水平分別為乳糖19.48 g/L、酵母浸粉21.12 g/L、檸檬酸銨2.92 g/L，在此條件下，經(jīng)系統(tǒng)計(jì)算得到抑菌圈直徑的最大理論值為22.0 935 mm。

(a) 乳糖與酵母浸粉

(b) 酵母浸粉與檸檬酸銨

(c) 乳糖與檸檬酸銨

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化水平的判定

將優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比，結(jié)果如圖2所示。MRS培養(yǎng)基的抑菌圈直徑為17.84 mm，優(yōu)化后培養(yǎng)基的抑菌圈直徑為21.46 mm，比優(yōu)化前提高了20.29%。

利用乙酸乙酯分別萃取對(duì)照組(MRS培養(yǎng)基)和實(shí)驗(yàn)組(優(yōu)化培養(yǎng)基)的抑菌活性物質(zhì)，各取100 mL萃取液在40 ℃真空旋干后測(cè)定產(chǎn)物質(zhì)量。結(jié)果顯示，對(duì)照組中提取得到的產(chǎn)物質(zhì)量為

(a) MRS培養(yǎng)基

0.184 g，實(shí)驗(yàn)組為0.292 g，比對(duì)照組提高了58.42%。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)常見(jiàn)致病菌抑菌活性的測(cè)定

由表4可見(jiàn)，植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)活性物質(zhì)的抑菌范圍較廣，對(duì)食品中常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有較高的活性，其中對(duì)副溶血性弧菌和單增李斯特菌的抑制作用最明顯。副溶血性弧菌是目前首要的食源性致病菌，而單增李斯特菌也是食物中常見(jiàn)的一種污染菌，能造成人嚴(yán)重的食物中毒。對(duì)常見(jiàn)致病菌抑菌活性的測(cè)定說(shuō)明植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)的活性物質(zhì)在食品工業(yè)中的具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表4 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)常見(jiàn)病菌抑菌活性的測(cè)定Tab.4 Determination of antibacterial activity offermentation products

2.6 溫度和pH對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

如表5所示，植物乳桿菌HS-R9產(chǎn)的活性物質(zhì)在40～70 ℃可以保持較高的抑菌活性，而在高于70 ℃時(shí)抑菌活性略有下降。經(jīng)過(guò)高溫處理后，發(fā)酵液內(nèi)并未產(chǎn)生沉淀物質(zhì)。因此可推斷，植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)的活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，該活性物質(zhì)在pH為4時(shí)具有較高的抑菌活性，但當(dāng)pH大于或者小于4時(shí)，抑菌活性有一定幅度下降，特別是當(dāng)pH大于7，抑菌活性完全消失。

表5 溫度和pH對(duì)抑菌活性物質(zhì)的影響Tab.5 Effect of temperature and pH on the antibacterialactive substances

3 結(jié) 論

以發(fā)酵液抑菌圈直徑為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基主要成分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，培養(yǎng)植物乳桿菌HS-R9的最佳培養(yǎng)基碳源、氮源和緩沖溶劑分別為乳糖19.48 g/L、酵母浸粉21.12 g/L和檸檬酸銨2.92 g/L，方差分析結(jié)果表明擬合程度較好。對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌活性提高了20.29%，其單位體積發(fā)酵液中產(chǎn)物質(zhì)量增加了58.42%。測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)食品中致病菌抑菌活性，表明植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)的活性物質(zhì)對(duì)常見(jiàn)致病菌有較強(qiáng)的抑制作用。溫度和pH對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果表明，植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)活性物質(zhì)具有耐酸耐高溫能力，但對(duì)堿性環(huán)境的抵抗能力較弱。