生草栽培對(duì)南豐蜜橘園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能特征的影響

肖力婷 楊慧林 黃文新 付學(xué)琴,*

(1 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022；2 江西省農(nóng)業(yè)廳，江西 南昌 330046)

柑橘是世界第一大水果，主要集中在中國(guó)、美國(guó)和地中海沿岸國(guó)家種植[1]。當(dāng)前，我國(guó)柑橘面積和產(chǎn)量均位居世界第一，柑橘已成為南方多地農(nóng)民的重要收入來(lái)源。南豐蜜橘(CitrusreticulitaBlanco cv.Kinokuni)原產(chǎn)于江西南豐縣，有1 300多年栽培歷史，是我國(guó)寬皮橘類(lèi)中的著名良種。近年來(lái)，由于南豐蜜橘在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上十分暢銷(xiāo)，很多地方競(jìng)相引種種植，至2020年南豐縣該蜜橘種植面積達(dá)7.8萬(wàn)公頃，產(chǎn)量達(dá)145萬(wàn)噸，成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧增收的重要渠道[2]。然而，由于長(zhǎng)期采用傳統(tǒng)清耕制管理模式，導(dǎo)致果園出現(xiàn)土壤質(zhì)量下降、肥力降低、病蟲(chóng)害加重、系統(tǒng)抗逆性減弱等生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，給南豐蜜橘的產(chǎn)量、品質(zhì)和種植效益帶來(lái)嚴(yán)重影響，制約著南豐蜜橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。果園生草栽培是一種在果園行間或全園播種豆科或禾本科植物，或者以果園自然生草作為覆蓋物[4]的果樹(shù)栽培方式，現(xiàn)已在蘋(píng)果[5]、梨[6-7]、桃[8]等果樹(shù)上廣泛應(yīng)用。果園生草不僅調(diào)節(jié)土壤含鹽量[9-10]和理化性質(zhì)，而且可優(yōu)化果園生態(tài)環(huán)境，解決果園由于長(zhǎng)期清耕而產(chǎn)生的危害[11-12]。在果園生草復(fù)合系統(tǒng)中，果樹(shù)與牧草組分因?qū)狻?、水、養(yǎng)分等資源的吸收利用而產(chǎn)生種間互作效應(yīng)，尤其各組分對(duì)土壤資源利用及土壤的反饋?zhàn)饔檬菦Q定果園生草復(fù)合系統(tǒng)能否實(shí)現(xiàn)高效持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵[13]，也是牧草組分與果樹(shù)組分相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力與驅(qū)動(dòng)機(jī)制。因此，揭示果園土壤環(huán)境的反饋?zhàn)饔脤?duì)于進(jìn)一步探討果園生草復(fù)合系統(tǒng)各組分間的互作機(jī)制具有重要作用。

土壤微生物作為構(gòu)成土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要因子，參與土壤物質(zhì)養(yǎng)分的循環(huán)與利用，很大程度上影響著土壤健康狀態(tài)和農(nóng)作物生長(zhǎng)[14]。研究表明，適宜的生草栽培可增加土壤微生物豐度和多樣性，提高土壤中的酶含量及酶活性。如龍眼園實(shí)行生草栽培后果園土壤微生物豐度顯著增加[15]；甜柿園實(shí)行生草栽培后土壤微生物數(shù)量及土壤酶活性均得到提升[16]；桃園實(shí)行生草栽培后土壤微生物功能多樣性顯著提升[17]。在橘園這個(gè)特定生態(tài)系統(tǒng)中，生草栽培對(duì)橘園土壤叢枝菌根形成有極大影響[18]，但對(duì)不同生草栽培處理是否會(huì)對(duì)橘園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，及不同生草栽培產(chǎn)生的影響是否存在差異仍缺乏全面認(rèn)識(shí)。因此，有必要探究不同生草栽培處理對(duì)南豐蜜橘園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能特征的影響。本研究基于16S rRNA和ITS rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，以果園傳統(tǒng)清耕方式為對(duì)照，研究不同生草類(lèi)型對(duì)南豐蜜橘園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能特征的影響，旨在探明南豐蜜橘園生草栽培后土壤微生物變化特征，為解決當(dāng)前南豐蜜橘生產(chǎn)中存在的系列問(wèn)題，構(gòu)建合理的果園土壤管理模式提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

供試土壤為黃紅壤土，采自江西南豐蜜橘產(chǎn)業(yè)局研究基地，(116°24’E，26°35’N)，該基地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均日照數(shù)1 928.2 h，無(wú)霜期269 d左右，年均降水量1 700 mm，年均氣溫18.3℃；橘園為低丘緩坡地，占地面積均20 hm2。南豐蜜橘樹(shù)齡(嫁接后)15年，由江西南豐蜜橘產(chǎn)業(yè)局研究基地提供。黑麥草(Loliummultiflorum)和白三葉草(Trifoliumrepens)購(gòu)自江西省新余市稻草人農(nóng)業(yè)園。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2010—2019年在江西南豐蜜橘產(chǎn)業(yè)局研究基地進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)種植禾本科類(lèi)牧草黑麥草處理、種植豆科類(lèi)牧草白三葉草處理和自然生草處理，并以清耕處理為對(duì)照，單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每處理小區(qū)面積為1.0 hm2。黑麥草和白三葉草處理于2010年春季進(jìn)行，行間連續(xù)10年播種，撒播草種量平均為30 kg·hm-2，每年刈草2次(5月和11月中下旬)，就地覆蓋；清耕處理定期中耕除草。各處理其他管理措施基本一致，常規(guī)管理。

2019年7月下旬在各處理小區(qū)按五點(diǎn)法采取橘園土壤樣品。在離橘樹(shù)主莖中心30～40 cm處，用土鉆取0～20 cm土層土樣，裝于滅菌離心管，分為2份，一份冰盒低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱保存，用于DNA提?。涣硪环輲Щ貙?shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，用于土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定 采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量；采用凱式法測(cè)定全氮含量；采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮含量；采用鉬銻抗比色法測(cè)定全磷和速效磷含量；采用火焰光度法測(cè)定全鉀和速效鉀含量；pH值用pH5S筆式pH計(jì)(上海三信)測(cè)定[19]。

1.3.2 土壤DNA提取 橘園土壤微生物群落總DNA采用Foregene土壤基因組DNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提??；1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA提取質(zhì)量，-20℃冰箱保存，供后續(xù)試驗(yàn)使用[20]。

1.3.3 熒光定量PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù) 土壤基因組DNA經(jīng)提取、擴(kuò)增、純化后，得到一定濃度的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品，將其稀釋制備熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算基因拷貝數(shù)。采用熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)熒光定量PCR擴(kuò)增[21]，檢測(cè)基因拷貝數(shù)。

1.3.4 土壤微生物多樣性測(cè)序 以上述檢測(cè)得到的DNA作為模板；采用帶有barcode的特異性引物338-F和806-R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3+V4區(qū)、用ITS1-F和ITS2-R擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)；同一樣本PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后等量混樣，由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行建庫(kù)，利用Miseq PE250平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行測(cè)序[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Usearch軟件對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)、獲得分類(lèi)操作單元數(shù)(operational taxonomic units，OTUs)；使用R語(yǔ)言工具繪制主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)圖；通過(guò)Spearman相關(guān)性分析和冗余分析(redundancy analysis，RDA)進(jìn)行微生物與土壤環(huán)境因子相關(guān)分析；使用http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/網(wǎng)站進(jìn)行線性判別分析(line discriminant analysis effect size，LEfSe)；使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)；使用Excel 2016軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生草類(lèi)型對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，不同生草類(lèi)型南豐蜜橘園的土壤化學(xué)性質(zhì)存在差異。與清耕對(duì)照相比，生草條件下土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀含量均顯著上升，表明南豐蜜橘園生草有利于增加土壤有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀的供應(yīng)，改善土壤肥力。其中，白三葉草處理土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀和堿解氮、速效鉀含量最高，分別比清耕對(duì)照提高204.11%、62.65%、76.19%、85.47%和58.40%、117.77%，說(shuō)明白三葉草栽培在提高土壤肥力方面效果最佳。

表1 不同生草栽培對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effect of differenTGrass on soil nutrients content

注：不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different small letters indicate significant difference at 0.05 level.圖1 土壤16S rRA(A)和ITS rRNA(B)基因拷貝數(shù)Fig.1 Number of 16S rRNA (A) and ITS rRNA (B) gene copies in soil

2.2 不同生草類(lèi)型對(duì)土壤細(xì)菌和真菌豐度的影響

由圖1-A可知，不同處理橘園土壤16S rRNA基因拷貝數(shù)變幅為1.77×108～2.63×108copies·g-1，不同處理間無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明生草栽培對(duì)橘園土壤細(xì)菌豐度影響不顯著。由圖1-B可知，不同處理橘園土壤ITS rRNA基因拷貝數(shù)變幅為4.42×106～1.33×107copies·g-1，其中黑麥草處理橘園土壤ITS rRNA基因的拷貝數(shù)顯著高于自然生草處理和清耕對(duì)照處理(P<0.05)，分別增加了131.30%和200.90%，表明黑麥草處理能顯著增加土壤真菌豐度。綜合圖1可知，細(xì)菌基因拷貝數(shù)較真菌基因拷貝數(shù)高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，表明橘園土壤中細(xì)菌群落數(shù)量占有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.3 不同生草類(lèi)型對(duì)土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響

由圖2可知，不同處理土壤樣品Shannon指數(shù)隨樣品序列數(shù)的增加而增加，到達(dá)一定序列數(shù)時(shí)，曲線趨于平緩，Shannon指數(shù)趨于飽和，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，測(cè)序結(jié)果能夠反映橘園土壤微生物物種多樣性。

通過(guò)擴(kuò)增子測(cè)序表明，細(xì)菌和真菌群落分別獲得421 357和420 627條有效序列，在相似水平97%條件下，細(xì)菌和真菌OTU數(shù)分別為641～939和216～282。由表2可知，黑麥草和白三葉草處理土壤細(xì)菌OTU數(shù)顯著高于其他兩組處理，土壤真菌OTU數(shù)在不同處理間無(wú)顯著差異，表明人工生草栽培處理有利于增加橘園土壤細(xì)菌群落數(shù)，而對(duì)真菌群落影響不明顯。

Alpha多樣性主要包括ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，其中ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)反映土壤中群落的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映土壤中群落的多樣性。由表2可知，細(xì)菌群落ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)呈現(xiàn)出黑麥草>白三葉草>清耕對(duì)照>自然生草的變化趨勢(shì)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈現(xiàn)出清耕對(duì)照>黑麥草>白三葉草>自然生草的變化趨勢(shì)，其中黑麥草處理ACE指數(shù)顯著高于清耕；自然生草處理α-多樣性指數(shù)均顯著低于清耕處理(P<0.05)，表明黑麥草處理明顯提高了細(xì)菌群落豐富度，而自然生草則明顯降低了細(xì)菌群落豐富度和多樣性。真菌群落ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)呈現(xiàn)出黑麥草>清耕對(duì)照>自然生草>白三葉草的變化趨勢(shì)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈現(xiàn)出黑麥草>白三葉草>自然生草>清耕對(duì)照的變化趨勢(shì)，其中黑麥草處理Simpson指數(shù)顯著高于清耕對(duì)照(P<0.05)，其他處理間差異不顯著；ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)處理間差異不顯著，表明黑麥草明顯提高了真菌群落的豐富度和多樣性，其他生草處理對(duì)真菌群落的豐富度和多樣性影響不大。

注：hmc：黑麥草；syc：白三葉草；wsc：清耕對(duì)照；zsc：自然生草。下同。Note: hmc: Ryegrass. syc: White clover. wsc: Clear tillage control. zsc: Natural grass. The same as following.圖2 土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)群落香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.2 Shannon index curve of soil bacteria(A) and fungus(B) communities

表2 不同分類(lèi)處理細(xì)菌和真菌分類(lèi)操作單元數(shù)(OTUs)和α-多樣性指數(shù)Table 2 Operational taxonomic units and alpha diversity index of bacterial and fungal community under differenTTreatments

2.4 不同生草類(lèi)型對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

不同生草栽培處理橘園土壤細(xì)菌和真菌在門(mén)和綱水平上的相對(duì)豐度居于前20%的物種如圖3所示。4種不同處理檢測(cè)到的細(xì)菌分屬于24門(mén)、68綱、141目、201科和304屬；真菌分屬于9門(mén)、27綱、57目、106科和170屬。

由圖3-A可知，在細(xì)菌門(mén)水平上，變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)為各處理的土壤優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其相對(duì)豐度分別為30.94%～55.06%、19.07%～33.14%、7.54%～13.54%和6.81%～13.41%。不同生草處理橘園土壤細(xì)菌相對(duì)豐度發(fā)生了變化。與清耕對(duì)照相比，黑麥草和白三葉草處理的綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)相對(duì)豐度分別提高了4.61和2.82個(gè)百分點(diǎn)；自然生草處理的變形菌門(mén)(Proteobacteria)相對(duì)豐度提高了24.12個(gè)百分點(diǎn)，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)相對(duì)豐度降低了13.67個(gè)百分點(diǎn)；其他處理間差異不顯著(P>0.05)。在細(xì)菌綱水平上(圖3-C)，酸桿菌綱(Acidobacteriia)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)為土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌綱，其相對(duì)豐度分別為19.03%～32.84%、12.22%～45.70%和8.14%～16.48%。與清耕對(duì)照相比，黑麥草、白三葉草和自然生草處理的γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)相對(duì)豐度分別提高了5.73、5.52和33.48個(gè)百分點(diǎn)，酸桿菌綱(Acidobacteriia)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)差異不顯著(P>0.05)。

在真菌門(mén)水平上(圖3-B)，子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)為土壤優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其相對(duì)豐度分別為44.94%～87.00%、5.12%～12.99%和0.65%～13.46%。不同生草處理橘園土壤真菌相對(duì)豐度發(fā)生了變化。與清耕對(duì)照相比，黑麥草、白三葉草和自然生草處理子囊菌門(mén)(Ascomycota)相對(duì)豐度分別降低了37.57、23.27、24.22個(gè)百分點(diǎn)，被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)相對(duì)豐度分別提高了1.24、11.67、12.81個(gè)百分點(diǎn)。在真菌綱水平上(圖3-D)，糞殼菌綱(Sordariomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)和傘菌綱(Agaricomycetes)為優(yōu)勢(shì)菌綱，其相對(duì)豐度分別為11.24%～59.09%、6.82%～23.17%和5.06%～12.64%。與清耕對(duì)照相比，黑麥草、白三葉草和自然生草處理的糞殼菌綱(Sordariomycetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes)相對(duì)豐度分別降低了31.89、47.85、43.54和16.36、12.94、3.12個(gè)百分點(diǎn)，傘菌綱相對(duì)豐度差異不顯著(P>0.05)。

為進(jìn)一步明確各處理間在群落物種組成上的差異性，采用PCoA分析不同生草類(lèi)型橘園土壤微生物群落物種組成的相似度。由圖4-A可知，細(xì)菌群落PC1和PC2分別為50.22%和20.41%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)70.63%。不同生草類(lèi)型細(xì)菌群落組間差異顯著(P<0.01)；黑麥草和白三葉草處理細(xì)菌群落組成較為相近，組間差異和組內(nèi)差異均小于自然生草和清耕對(duì)照。由圖4-B可知，真菌群落PC1和PC2分別為32.59%和22.21%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)54.80%。不同生草處理真菌群落強(qiáng)烈聚類(lèi)，組間物種組成差異顯著(P<0.01)，而組內(nèi)物種組成較為相似。

2.5 不同生草類(lèi)型土壤細(xì)菌和真菌群落LEfSe分析

由圖5-A可知，不同生草處理使橘園土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生明顯差異，共有24個(gè)細(xì)菌分支表現(xiàn)出顯著差異，其中黑麥草處理存在3個(gè)差異顯著的細(xì)菌分支，自然生草處理存在2個(gè)差異顯著的細(xì)菌分支，清耕對(duì)照處理存在19個(gè)差異顯著的分支，而白三葉草處理不存在差異顯著的分支。由圖5-B可知，不同生草處理使橘園土壤真菌群落產(chǎn)生明顯差異，共有27個(gè)真菌分支產(chǎn)生顯著差異，其中黑麥草處理存在11個(gè)差異顯著的真菌分支，自然生草和白三葉草處理存在6個(gè)差異顯著的真菌分支，清耕對(duì)照處理存在4個(gè)差異顯著的真菌分支。

注：A：16S rRNA門(mén)水平；B：ITS rRNA門(mén)水平；C：16S rRNA綱水平；D：ITS rRNA綱水平。Note: A: 16S rRNA phylum level. B: ITS rRNA phylum level. C: 16S rRNAClass level. D: ITS rRNAClass level.圖3 土壤細(xì)菌和真菌群落組成Fig.3 Soil bacterial and fungal community composition

圖4 土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)群落結(jié)構(gòu)PCoA聚類(lèi)分析Fig.4 Cluster analysis of PCoACommunity structure of soil bacteria (A) and fungi (B)

注：由內(nèi)至外依次為門(mén)、綱、目、科、屬，小圓圈大小代表該分類(lèi)水平下該物種相對(duì)豐度大??； 無(wú)顯著差異物種標(biāo)記為黃色，有顯著差異物種以著色標(biāo)記。Note: From the inside to the outside, it is phylum, class, order, family, and genus. The size of the small circle represents the relative abundance of the species under the classification level. Species with no significant differences are marked in yellow, and species with significant differences are marked with coloring.圖5 土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)群落LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of soil bacteria (A) and fungus (B) communities

2.6 土壤環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)分析

由圖6可知，土壤細(xì)菌和真菌群落門(mén)水平上，環(huán)境因子解釋率分別為53.50%和69.32%。土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、全鉀、堿解氮含量及pH值對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大；土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、全磷、速效鉀和全氮含量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。

對(duì)門(mén)水平相對(duì)豐度前十的物種與土壤理化因子進(jìn)行Spearman分析，結(jié)果如圖7所示。細(xì)菌門(mén)水平上，土壤pH值與變形菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；土壤全鉀含量與放線菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與髕骨菌門(mén)和WPS-2相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀、全氮、速效磷含量均與髕骨菌門(mén)和WPS-2相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；土壤堿解氮和全磷含量均與髕骨菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。真菌門(mén)水平上，土壤速效磷含量與子囊菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Calcarisporiellomycota相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；土壤有機(jī)質(zhì)含量與子囊菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；土壤全鉀含量與被孢霉門(mén)相對(duì)豐度顯著正相關(guān)(P<0.05)。

注：A：細(xì)菌群落；SOM：有機(jī)質(zhì)；TK：全鉀；TN：全氮；TP：全磷；AK：速效鉀；AN：堿解氮；AP：速效磷。下同。Note: A: Bacterial community. TK: Total K. TN: Total N. TP: Total P. AK: Available K. AN: Alkali-hydrolyzable N. AP：Available P. The same as following.圖6 土壤門(mén)水平細(xì)菌(A)和真菌(B)群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量RDA分析Fig.6 RDAAnalysis of bacterial (A) and fungus (B) community structure and environmental variables aTThe soil phylum level

圖7 環(huán)境因子與土壤微生物群落組成(門(mén)水平)相關(guān)性熱圖Fig.7 Spearman correlationship analysis of environmental factors and soil microbial communities (phylum level)

3 討論

3.1 生草栽培對(duì)橘園土壤理化性質(zhì)的影響

土壤有機(jī)質(zhì)累積程度是土壤肥力的重要特征，是影響土壤物理性狀、供肥保肥和養(yǎng)分有效性的關(guān)鍵因子[23]。相關(guān)研究表明，果園行間生草可以促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)累積[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，南豐蜜橘園行間生草顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量，但不同的生草類(lèi)型對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)累積的影響不一。人工種植白三葉草和黑麥草土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著高于自然生草，而二者對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的累積作用無(wú)顯著差異，其原因可能是南豐蜜橘園雜草生長(zhǎng)不佳，生物量累積較少，致使土壤有機(jī)質(zhì)累積量少于人工種草土壤的有機(jī)質(zhì)累積量。

在果樹(shù)的各生長(zhǎng)時(shí)期，土壤氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素的穩(wěn)定供應(yīng)是保證果樹(shù)正常生長(zhǎng)發(fā)育的前提。曹永[25]研究表明，梨園種植紫花苜蓿和白三葉草可以提高土壤堿解氮、速效磷、速效鉀含量。馬震珠等[26]研究表明，果樹(shù)種植白三葉草可以提高0～20 cm土層速效氮含量，而種植高羊茅草可以提高該層土壤速效鉀含量。本研究發(fā)現(xiàn)，生草條件下土壤全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀含量顯著高于清耕對(duì)照，表明南豐蜜橘園生草能夠改善土壤氮、磷、鉀的供應(yīng)，與前人研究基本一致，其主要原因是刈割覆蓋后的草根系及枝葉殘?bào)w進(jìn)入土壤中，為土壤中氮、磷、鉀等養(yǎng)分提供了可靠穩(wěn)定的來(lái)源。本研究還發(fā)現(xiàn)，白三葉草處理土壤中全氮、全磷、全鉀和堿解氮、速效磷、速效鉀含量最高，表明豆科類(lèi)牧草白三葉草在提高果園土壤肥力方面效果最佳，優(yōu)于禾本科牧草黑麥草，這可能與豆科類(lèi)牧草的固氮作用以及生物量等因素相關(guān)。

3.2 生草栽培對(duì)橘園土壤微生物群落多樣性的影響

土壤微生物作為土壤中最重要的活性組分，其多樣性水平也是反映土壤環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[27]，而微生物群落組成受農(nóng)田管理措施的影響較大，不同的農(nóng)田管理措施會(huì)對(duì)土壤溫濕度等生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不同的影響，導(dǎo)致土壤微生物多樣性和豐富度有所不同[28]。魏倩倩等[29]研究發(fā)現(xiàn)，矮砧蘋(píng)果覆蓋白三葉草，短期內(nèi)可顯著提高土壤微生物代謝活性，增加土壤微生物多樣性；劉洋等[30]研究發(fā)現(xiàn)，地膜覆蓋對(duì)5～15 cm土層溫度的提高有顯著效果，同時(shí)提高了土壤微生物活性及呼吸率。本研究通過(guò)擴(kuò)增子測(cè)序發(fā)現(xiàn)，黑麥草和白三葉草處理土壤細(xì)菌OTU數(shù)分別為939和930，顯著高于自然生草和清耕對(duì)照，而真菌OTU數(shù)則無(wú)顯著差異，表明人工種草有利于南豐橘園土壤細(xì)菌繁殖，對(duì)真菌生長(zhǎng)代謝活動(dòng)影響則不明顯。Alpha多樣性分析進(jìn)一步表明，黑麥草處理細(xì)菌群落ACE指數(shù)顯著高于自然生草和清耕對(duì)照處理，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)除自然生草處理顯著低于其他處理外，其他處理間差異不顯著；真菌群落除黑麥草處理Simpson指數(shù)顯著高于清耕對(duì)照外，其他處理間差異不顯著，表明人工生草栽培可以顯著提高微生物群落豐富度和多樣性，這些研究結(jié)論與前人研究生草栽培有利于促進(jìn)果園微生物生長(zhǎng)繁殖的結(jié)果基本一致。但本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，自然生草不僅沒(méi)有促進(jìn)果園土壤細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，反而降低了細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。其原因可能與果園土壤類(lèi)型、輸入到土壤中的有機(jī)組分、C/N比值、氣候條件等因素有關(guān)，具體因素還需要進(jìn)一步深入研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌基因拷貝數(shù)在果園土壤中占有明顯優(yōu)勢(shì)，比真菌基因拷貝數(shù)高出1到2個(gè)數(shù)量級(jí)，這與錢(qián)雅麗[31]的研究結(jié)果基本一致；可能與細(xì)菌和真菌對(duì)土壤有機(jī)物的利用不同有關(guān)，細(xì)菌偏好繁殖于營(yíng)養(yǎng)豐富、有機(jī)物易分解的土壤環(huán)境中，底物周轉(zhuǎn)快；真菌易繁殖于低營(yíng)養(yǎng)、難分解以及低氮含量有機(jī)物的土壤環(huán)境。

3.3 生草栽培對(duì)橘園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著重要作用[32]，由于許多細(xì)菌和真菌種類(lèi)的生活史未知以及其不可培養(yǎng)性使得土壤微生物的重要性被低估，應(yīng)用高通量測(cè)序分析技術(shù)，可以比較準(zhǔn)確地反映細(xì)菌和真菌的群落特征[33]。薛曉敏等[34]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)樹(shù)盤(pán)覆蓋處理的蘋(píng)果園土壤在門(mén)水平上細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群主要有變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)及酸桿菌門(mén)，真菌優(yōu)勢(shì)菌群主要有接合菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén)；陳月星[35]研究了覆蓋對(duì)渭北旱作蘋(píng)果園土壤微生物群落特征的影響，發(fā)現(xiàn)果園土壤細(xì)菌群落中變形菌門(mén)為第一優(yōu)勢(shì)菌群。本研究結(jié)果表明，南豐蜜橘園土壤在細(xì)菌門(mén)水平上，變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和放線菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這與前人研究結(jié)果基本一致。陳海生等[36]研究表明綠彎菌門(mén)具有促進(jìn)土壤有毒物質(zhì)降解的作用，本研究發(fā)現(xiàn)黑麥草和白三葉草處理綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度比清耕對(duì)照分別提高了4.61和2.82個(gè)百分點(diǎn)，表明人工生草栽培有利于降低土壤中的有毒物質(zhì)，改善土壤生態(tài)環(huán)境。變形菌門(mén)的微生物多為兼性或者專(zhuān)性厭氧及異養(yǎng)微生物，該門(mén)的亞硝化單胞菌屬有氧化銨的能力；放線菌能夠分解纖維和木質(zhì)素，豐富的放線菌有利于土壤中植物有機(jī)殘?bào)w的分解；酸桿菌門(mén)大多是嗜酸菌，喜歡養(yǎng)分含量較低的土壤環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)黑麥草、白三葉草、自然生草處理土壤中變形菌門(mén)和丙型變形菌綱的相對(duì)豐度與清耕對(duì)照相比有所提高；黑麥草處理土壤中放線菌門(mén)相對(duì)豐度比清耕對(duì)照提高了2.58個(gè)百分點(diǎn)，而白三葉草和自然生草處理反而降低了4.01和2.23個(gè)百分點(diǎn)；黑麥草、白三葉草和自然生草處理土壤中酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度均低于清耕對(duì)照。黑麥草處理增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善了氮素供應(yīng)和養(yǎng)分狀況，促進(jìn)了具有氮素循環(huán)作用的變形菌門(mén)和放線菌門(mén)繁殖，抑制了酸桿菌門(mén)生長(zhǎng)，這與Teele等[37]的研究結(jié)果基本一致。但白三葉草和自然生草處理土壤中放線菌門(mén)相對(duì)豐度與清耕對(duì)照相比反而出現(xiàn)了下降，其原因可能與果園土壤類(lèi)型、施肥管理、生態(tài)環(huán)境等因素相關(guān)，具體機(jī)制需要深入研究。

南豐蜜橘園土壤在真菌門(mén)水平上，子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和被孢霉門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。擔(dān)子菌門(mén)有滑銹傘屬、絲膜菌屬可與植物共生形成菌根[38]，增強(qiáng)植株抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草、白三葉草和自然生草的擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度均有不同程度地提高，表明生草栽培有利于果樹(shù)根部形成菌根，提高抗性。子囊菌門(mén)群落主要由腐生菌構(gòu)成[39]，而腐生菌可以為土壤中的植物提供養(yǎng)分，是土壤養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程中的重要真菌。本研究發(fā)現(xiàn)，與清耕對(duì)照相比，生草栽培反而降低了子囊菌門(mén)相對(duì)豐度，這可能與試驗(yàn)的南豐蜜橘園長(zhǎng)期施用有機(jī)肥等因素有關(guān)，具體影響因素還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

生草栽培顯著提高了南豐蜜橘園土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善了土壤氮、磷、鉀養(yǎng)分供應(yīng)。土壤理化性質(zhì)的改變，進(jìn)而影響了土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)特征。人工種植黑麥草和白三葉草顯著提高了橘園土壤微生物群落的豐富度和多樣性，優(yōu)化了土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)；細(xì)菌和真菌群落組間差異大于組內(nèi)差異。相關(guān)分析表明，土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、全鉀和堿解氮含量及pH值對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、全磷、速效鉀和全氮含量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。