市售散裝白斬雞表面四環(huán)素耐藥菌污染初探

李會(huì)賢 馮 博 黃柳娟 邵 毅,* 張東來,*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403；2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

抗生素的過量使用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌和耐藥基因迅速增殖[1]。而且即便沒有使用抗生素，食源性耐藥菌也會(huì)通過耐藥基因的遷移而影響人類共生菌的耐藥性[2-3]，嚴(yán)重威脅人類健康。即食熟肉制品中存在抗生素耐藥菌污染[4]，但其污染途徑尚不明確，而且加工方式是否會(huì)影響食品中耐藥菌的數(shù)量和種屬、不同熟食基質(zhì)上的耐藥菌向消費(fèi)者擴(kuò)散耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)大小等問題尚待揭示。

食品中的致病菌或條件性致病菌對人類具有直接危害，因而備受關(guān)注，即食食品的耐藥菌研究也大多以致病菌為研究對象[5-6]。然而，越來越多的證據(jù)表明，數(shù)量龐大且遺傳背景多樣的非致病菌是耐藥基因的存儲(chǔ)庫，可成為耐藥基因發(fā)生水平遷移的供體、受體和中間載體[7]。因此，在整個(gè)細(xì)菌范圍內(nèi)研究抗生素耐藥菌的污染狀況及耐藥性的遷移風(fēng)險(xiǎn)，更能反映即食食品中抗生素耐藥菌的整體污染水平和潛在風(fēng)險(xiǎn)。與大多數(shù)熟肉制品相比，白斬雞加工溫度低、時(shí)間短，因此具有特殊的菌群結(jié)構(gòu)[8]，但其耐藥細(xì)菌的污染特征和遷移風(fēng)險(xiǎn)還鮮有研究報(bào)道。

本研究以市售散裝白斬雞為研究對象，分析其四環(huán)素耐藥菌(tetracycline resistant bacteria, TETr)和四環(huán)素耐藥基因的污染水平，并用非選擇性培養(yǎng)基隨機(jī)分離獲得四環(huán)素耐藥細(xì)菌，鑒定其種屬，探討其污染來源，最后基于自然轉(zhuǎn)化技術(shù)探究耐藥菌株向異種細(xì)菌傳播耐藥基因的頻率，以期豐富白斬雞表面細(xì)菌的耐藥數(shù)據(jù)庫，為散裝白斬雞的微生物風(fēng)險(xiǎn)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從上海4個(gè)區(qū)(浦東新區(qū)、奉賢區(qū)、徐匯區(qū)、閔行區(qū))的25個(gè)熟食店中收集白斬雞樣品25份。為模擬消費(fèi)者食用雞肉熟食的儲(chǔ)存習(xí)慣，采樣后將樣品置于裝有冰袋的保溫箱并于12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行四環(huán)素耐藥菌的計(jì)數(shù)和分離。為避免采樣及貯運(yùn)過程的交叉污染，戴一次性無菌手套進(jìn)行樣品收集，直至實(shí)驗(yàn)室取樣前，白斬雞樣品全程置于無菌袋中并封口。

腦心浸液肉湯(brain heat infusion，BHI)瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂、水解酪蛋白培養(yǎng)基(mueller-hinton agar，MHA)，環(huán)丙沙星(ciprofloxacine，CIP)藥敏實(shí)驗(yàn)紙片、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX)藥敏實(shí)驗(yàn)紙片、強(qiáng)力霉素(doxycycline，DOX)藥敏實(shí)驗(yàn)紙片、紅霉素(erythromycin，ERM)藥敏實(shí)驗(yàn)紙片、四環(huán)素(tetracycline，TET)藥敏實(shí)驗(yàn)紙片、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SUL)藥敏實(shí)驗(yàn)紙片，英國OXOID公司；CIP、CTX、DOX、ERM、SUL、三甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim，TRI),美國Sigma公司；TET，美國Diamond公司；真菌抑制劑放線菌酮(cycloheximide，CYC)，美國Amresco公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，Q-PCR)試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；混合纖維濾膜，上海上藥新亞藥業(yè)有限公司。大腸桿菌J53由華南理工大學(xué)閆鶴副研究員惠贈(zèng)。

1.2 儀器與設(shè)備

1300 SERIES A2生物安全柜，美國Thermo Fisher Scientific公司；Medcenter Einrichtungen GmbH恒溫培養(yǎng)箱，德國Friocell公司；LighTCycler 96熒光定量PCR 儀，德國Roche公司；Minibeadbeater 24研磨珠均質(zhì)機(jī)，美國OMNI公司；Sub Cell GT System電泳儀,GelDoc XP+Imager凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 四環(huán)素耐藥菌的菌落計(jì)數(shù) 在無菌條件下剪取25 g樣品于均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，在勻漿機(jī)下拍打2 min[9]，10倍梯度稀釋后，每個(gè)梯度吸取200 μL稀釋液分別涂布于含有16 μg·mL-1TET[10]和100 μg·mL-1CYC，或僅含有100 μg·mL-1CYC的BHI瓊脂培養(yǎng)基平板上，于36℃培養(yǎng)36 h，每個(gè)梯度做2個(gè)平行。分別進(jìn)行四環(huán)素耐藥菌和可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2 耐藥基因的定量分析 根據(jù)Gao等[11]的方法，用SYBR Green熒光定量PCR(qRT-PCR)法對先采集的13個(gè)白斬雞樣品中的6個(gè)四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetJ、tetM和一類整合酶基因intⅠ及16SrDNA基因進(jìn)行定量分析，獲得各基因的拷貝數(shù)后，計(jì)算各基因與16SrDNA拷貝數(shù)相比的相對拷貝數(shù)。qRT-PCR中使用的重組質(zhì)粒由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，qRT-PCR引物見表1。

表1 四環(huán)素耐藥基因、int I基因及16S rDNA基因引物對Table 1 Primers of tetracycline resistance genes, int I gene and 16S rDNA gene

1.3.3 四環(huán)素耐藥菌的分離鑒定及多耐表型分析 為減少耐藥細(xì)菌分離株的假陽性率，將菌落分離BHI培養(yǎng)基中的四環(huán)素含量提高至計(jì)數(shù)培養(yǎng)基時(shí)的3倍，即48 μg·mL-1，按1.3.1的步驟進(jìn)行樣品稀釋、涂布和培養(yǎng)，挑取形態(tài)不同的單菌落，PCR擴(kuò)增其16SrDNA基因后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并用NCBI blast進(jìn)行菌種鑒定。隨后用試紙片擴(kuò)散法[12]分析分離獲得的四環(huán)素耐藥菌對抗生素CIP、CTX、DOX、TET、ERM、SUL/TRI的藥敏性。

1.3.4 耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移 將分離自白斬雞表面的耐藥細(xì)菌單菌落于37℃、200 r·min-1搖床中培養(yǎng)8～12 h至菌液在600 nm處的光密度值達(dá)到1.5～1.7，用滅菌牙簽點(diǎn)接種至含有128 μg·mL-1NaN3的BHI瓊脂培養(yǎng)基上，若未增殖，則判定該菌株對128 μg·mL-1NaN3敏感，反之則耐受[13]。選取對NaN3敏感且對TET耐藥的菌株作為耐藥基因的供體菌，及對CIP、CTX、DOX、TET、SUL/TRI均敏感但對NaN3耐藥的受體菌大腸桿菌J53作為受體菌，用膜過濾轉(zhuǎn)化法[14]進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)：將活化的供體菌和受體菌按1∶2的比例混合，并將100 μL混合液轉(zhuǎn)移至放有纖維素混合膜的BHI瓊脂培養(yǎng)基上，靜置10～15 min后，待其完全吸收于37℃培養(yǎng)18～24 h；將濾膜上的細(xì)菌刮至BHI液體培養(yǎng)基中并進(jìn)行梯度稀釋，吸取各梯度細(xì)菌懸液200 μL于含有128 μg·mL-1NaN3+ 32 μg·mL-1TET、或不含有抗生素和NaN3的BHI瓊脂培養(yǎng)基上，均勻涂布后，于37℃培養(yǎng)18～24 h后查看雙抗平板上是否有接合子，并按以下公式計(jì)算接合轉(zhuǎn)移率：

接合轉(zhuǎn)移率=接合子菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100%。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析及制圖軟件 數(shù)據(jù)分析和制圖均采用Excel 2010完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售白斬雞產(chǎn)品中四環(huán)素耐藥細(xì)菌的污染水平

由圖1可知，25個(gè)白斬雞熟食樣品中均分離到TETr菌，菌落數(shù)為(7.07×101～1.67×108)CFU·g-1，占總可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的1.01%～100%；80%(20/25)樣品中TETr菌計(jì)數(shù)超過105CFU·g-1，其中1個(gè)樣品(19號(hào))中TETr菌甚至達(dá)到108CFU·g-1。因此，本試驗(yàn)驗(yàn)涉及的白斬雞樣品中普遍存在四環(huán)素類耐藥菌污染。

分子水平證據(jù)進(jìn)一步證明市售白斬雞產(chǎn)品表面存在大量的四環(huán)素耐藥菌。13個(gè)白斬雞樣品的qRT-PCR結(jié)果表明，所有樣品均檢出tetA、tetB和tetM3種四環(huán)素耐藥基因，tetC和tetD的檢出率均為76.92%(10/13)，tetJ的檢出率為84.62%(11/13)；tetA含量最高，在4個(gè)樣品中相對拷貝水平超過10-2(即1%)，且最高可達(dá)2.4×10-1(圖2)。此外，所有樣品中均存在intⅠ基因，其相對拷貝數(shù)在5.31×10-6～3.73×10-1之間。已有證據(jù)[15-16]表明，一類整合子在細(xì)菌多重耐藥的發(fā)生和遷移中起到了關(guān)鍵作用。本研究檢出較高拷貝數(shù)的intⅠ 基因，預(yù)示耐藥基因可能發(fā)生水平遷移。

圖1 市售白斬雞產(chǎn)品中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和四環(huán)素耐藥菌計(jì)數(shù)Fig.1 Prevalence of total cultivable bacteriAAnd TETr bacteria in retail soft-boiled chicken samples

2.2 市售白斬雞表面耐藥細(xì)菌的鑒定及多重耐藥表型分析

本研究共分離獲得13株TETr菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌4株，莫拉氏菌屬(Moraxella)細(xì)菌3株，嗜水氣單胞菌屬(Aeromonas)細(xì)菌2株，以及肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、乳酸乳球菌亞種(Lactococcuslactissubsp.)和希瓦氏菌屬(Shewanella)細(xì)菌各1株。所有菌株均至少對2種抗生素耐藥，其中5株(表2，序號(hào)1、2、3、7和13)具有三重耐藥性。

2.3 市售白斬雞表面耐藥基因的遷移風(fēng)險(xiǎn)

7株對NaN3敏感的耐藥基因供體菌在接合轉(zhuǎn)化試驗(yàn)后，有3株接合子獲得四環(huán)素耐藥表型，接合轉(zhuǎn)移率分別約為10-6或10-2(表3)。發(fā)生耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移的供體菌為2株莫拉氏菌和1株不動(dòng)桿菌。兩株莫拉氏菌的抗生素藥敏性表型一致，但與受體菌的接合頻率差異巨大，可能因?yàn)槟退幓驍y帶質(zhì)粒的遷移機(jī)制不同。

表2 市售白斬雞產(chǎn)品中耐藥菌種與藥敏性Table 2 Antibiotic-resistant strains and antibiotic sensitivity of retail soft-boiled chicken samples

表3 耐藥基因供體菌和受體菌的接合轉(zhuǎn)化結(jié)果Table 3 Junction transformation of donor and recipient bacteria

圖2 市售白斬雞產(chǎn)品中耐藥基因相對拷貝量Fig.2 Relative copies of resistance genes in retail soft-boiled chicken samples

3 討論

本研究結(jié)果表明，市售散裝白斬雞存在四環(huán)素耐藥菌污染風(fēng)險(xiǎn)，其中1個(gè)樣品的TETr菌甚至達(dá)到了108CFU·g-1，遠(yuǎn)高于烹飪完成初期的白斬雞[17]，或具有包裝的其他類別的即食雞肉產(chǎn)品中的細(xì)菌污染水平[18]，與Wang等[19]關(guān)于美國市售火雞熟食的TETr菌高達(dá)107CFU·g-1的報(bào)道相近。四環(huán)素耐藥基因及一類整合子基因的qRT-PCR分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了白斬雞產(chǎn)品表面四環(huán)素耐藥菌污染的普遍性和耐藥基因的水平遷移潛勢。

已有報(bào)道表明，白斬雞表面相對豐度較高的細(xì)菌種屬有不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬、乳球菌屬[8]。本研究暫未分離到耐四環(huán)素的假單胞菌屬細(xì)菌，但其他3種菌屬的四環(huán)素耐藥菌均有檢出，說明白斬雞表面的優(yōu)勢菌屬很可能已具有耐藥性。本研究分離獲得的4種四環(huán)素耐藥菌(芽孢桿菌、氣單胞菌、不動(dòng)桿菌和希瓦氏菌)曾在生鮮雞肉[20]和雞的腸道[21]中鑒定出，但對四環(huán)素耐藥的雞源莫拉氏菌屬、肺炎鏈球菌和乳酸乳球菌鮮有報(bào)道，因此推測加工過程的二次污染可能是市售白斬雞表面耐藥菌的來源之一。

本研究中鑒定到的四環(huán)素耐藥菌屬中，芽孢桿菌能產(chǎn)生極具耐受性的孢子，部分菌種(如蠟樣芽孢桿菌屬Bacilluscereus)對人體具有致病性，且已有研究證實(shí)芽孢桿菌可成為攜帶耐藥基因質(zhì)粒的寄主，參與四環(huán)素耐藥基因的水平遷移[22]，因此有必要進(jìn)一步確認(rèn)本研究中分離的芽孢桿菌菌種及其耐藥遷移風(fēng)險(xiǎn)。氣單胞菌是常見的人畜魚共患病原菌，可在很大程度上促進(jìn)抗生素耐藥性的傳播[23]。不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌是冷鮮雞肉微生物菌群中的優(yōu)勢菌屬[24]，且在高鹽的雞肉調(diào)理品中仍存在[25]，說明其在雞肉加工過程中具有較強(qiáng)的耐環(huán)境脅迫能力；此外，作為一種條件性致病菌，近些年不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的臨床多重耐藥性越來越普遍[26]，因此其在食品中的耐藥性值得關(guān)注。乳酸乳球菌能產(chǎn)生多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)其對多種臨床抗生素產(chǎn)生耐藥性[27]，近年來科研人員還在乳酸乳球菌中發(fā)現(xiàn)了具有高頻接合能力的pAMβ1質(zhì)粒，其介導(dǎo)的廣寄主的耐藥基因轉(zhuǎn)移效率是不含該質(zhì)粒時(shí)的10 000倍[28]。綜上，上海市售白斬雞表面的幾種四環(huán)素耐藥細(xì)菌在理論上可能存在耐藥基因的遷移風(fēng)險(xiǎn)。

現(xiàn)有對四環(huán)素耐藥基因在食品微生物中的水平遷移研究表明，四環(huán)素耐藥基因可通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子在菌群間遷移，如奶酪源四環(huán)素耐藥腸球菌和乳桿菌向變形鏈球菌自然轉(zhuǎn)移四環(huán)素耐藥性的接合率約為10-9～10-8，電轉(zhuǎn)化效率約為10-8[3]；鮮肉源單增李斯特菌向豬鏈球菌紅霉素耐藥株遷移tetM基因的接合轉(zhuǎn)移率約為10-7[29]；發(fā)酵香腸中tetK引起的四環(huán)素耐藥性在木糖葡萄球菌間的遷移率約為10-9～10-7[30]。本研究中1株莫拉氏菌和1株不動(dòng)桿菌向大腸桿菌J53遷移四環(huán)素耐藥性的接合轉(zhuǎn)接率高達(dá)10-2，其移動(dòng)原件的結(jié)構(gòu)、遷移機(jī)制及四環(huán)素耐藥性供體菌的特性值得深入研究。

熟食制品表面的致病菌和非致病菌均可能作為耐藥基因供體，向異種細(xì)菌水平遷移耐藥基因[3-4]，腸球菌屬、乳酸菌屬、肉桿菌屬、乳球菌屬頻繁參與了耐藥基因的水平遷移[31-32]。本研究首次證實(shí)市售散裝白斬雞表面的莫拉氏菌屬和不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室條件下可作為耐藥基因的供體，將耐藥基因水平遷移至異種細(xì)菌。這兩種菌的耐藥基因遷移機(jī)制和相關(guān)遷移元件需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，市售散裝白斬雞表面普遍存在四環(huán)素耐藥菌污染風(fēng)險(xiǎn)，加工過程中的二次污染可能是污染來源之一。從白斬雞表面分離到的2株莫拉氏菌和1株不動(dòng)桿菌可將四環(huán)素耐藥表型轉(zhuǎn)移至大腸桿菌J53，目前尚未見這兩個(gè)屬的細(xì)菌參與耐藥基因水平遷移的報(bào)道，其耐藥基因水平遷移的機(jī)制需進(jìn)一步探索。市售散裝白斬雞表面的四環(huán)素耐藥菌污染可能增加消費(fèi)者對食源性耐藥菌的暴露風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加強(qiáng)白斬雞加工和銷售過程中耐藥菌的監(jiān)測，為食源性耐藥菌的風(fēng)險(xiǎn)評估提供依據(jù)。