赤霉素代謝調(diào)控與綠色革命

李毅丹 單曉輝

（1. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所/吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，長春 130033；2. 吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062）

赤霉素（gibberellins，GAs）作為重要的植物激素，其發(fā)現(xiàn)和研究的歷程始終與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)。20世紀(jì)30年代，第一種GA是在導(dǎo)致水稻莖稈過度伸長的致病性真菌（藤倉赤霉Gibberella fujikuroi）代謝物中被發(fā)現(xiàn)。自此之后，研究者相繼在植物和真菌中鑒定出了136種GAs，均為二萜類化合物［1］。其中，只有少量的GAs具有內(nèi)在的生物活性，控制著植物生長發(fā)育（包括種子萌發(fā)、莖伸長、葉膨大、花和種子發(fā)育等）的各個方面［2］。這些具有生物活性的GAs包括GA1、GA3、GA4和GA7［1，3-5］，它們與生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯和油菜素甾醇被并稱為六類植物激素。其他GAs則是生物活性GAs的生物合成前體、失活產(chǎn)物和代謝副產(chǎn)物。

生物活性GAs是通過復(fù)雜的生物合成和信號傳導(dǎo)途徑來控制生長和發(fā)育的。隨著生化、遺傳和基因組等研究手段的豐富，大多數(shù)編碼GAs生物合成和失活酶的基因以及信號傳導(dǎo)途徑中重要蛋白的基因正逐一被鑒定出來。這些基因的鑒定有助于了解GAs代謝的調(diào)控機(jī)制［6］。影響GAs生物合成或信號傳導(dǎo)的一些重要基因在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到了廣泛的應(yīng)用。其中，半矮化等位基因的引入顯著提高了高施氮條件下谷物的可收獲產(chǎn)量，是20世紀(jì)作物育種領(lǐng)域的重大成果，為“綠色革命”的實現(xiàn)作出了巨大貢獻(xiàn)。最具有代表性的就是國際水稻研究所（International Rice Research Institute，IRRI）和國際小麥玉米改良中心（International Maize and Wheat Improvement Center，CIMMYT）先后推出的半矮化高產(chǎn)水稻品種和半矮化高產(chǎn)小麥品種［7-9］。

“綠色革命”是1968年3月美國國際開發(fā)署署長W·S·高達(dá)在華盛頓舉行的國際開發(fā)學(xué)會年會上發(fā)表的以“綠色革命：成就與擔(dān)憂”為標(biāo)題的演說中首次提出的［10］。“綠色革命”一詞雖已被普遍應(yīng)用，但并沒有形成準(zhǔn)確的概念。一般情況下，“綠色革命”是指20世紀(jì)60-70年代世界各地谷物單產(chǎn)大幅增加的這一過程［7-8，11-13］?！熬G色革命”的實現(xiàn)主要依賴于兩方面進(jìn)步：一是高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、廣適的谷物品種育成；二是包括化肥、農(nóng)藥、灌溉、耕作等在內(nèi)的農(nóng)業(yè)技術(shù)革新［14-16］。本文將著重圍繞“綠色革命”中涉及的代表性品種，系統(tǒng)介紹優(yōu)良性狀形成的赤霉素代謝調(diào)控機(jī)制。同時，綜合赤霉素代謝調(diào)控研究的新發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)代生物技術(shù)的新發(fā)展，提出后“綠色革命”時期赤霉素代謝調(diào)控在作物遺傳改良中應(yīng)用的方向和亟待解決的問題。

1 赤霉素代謝調(diào)控概覽

GAs是由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP）為前體物質(zhì)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化過程，最終合成的二萜類化合物［1-5］（圖1）。這一過程主要依賴于3種不同類型酶的催化，包括萜烯合成酶（terpene synthases，TPSs）、細(xì)胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases，P450s）和2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（2-oxoglutarate-dependent dioxygenases，2ODDs）。2個TPSs：ent-copalyl二磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）和ent-kaurene合酶（ent-kaurene synthase，KS）在質(zhì)體中催化了GGPP向四環(huán)烴中間體ent-kaurene的轉(zhuǎn)化過程［17-18］；然后，通過2個P450s：ent-kaurene氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）和ent-kaurenoic酸氧化酶（ent-kaurenoic acid oxidase，KAO），在 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 上 將ent-kaurene轉(zhuǎn) 換為GA12［17，19］；隨后GA12通過GA13-氧化酶（GA 13-oxidase，GA13ox）的 催 化 生 成GA53，GA12和GA53分別在GA20-氧化酶（GA 20-oxidase，GA20ox）和GA3-氧化酶（GA 3-oxidase，GA3ox）的多步催化下，最終轉(zhuǎn)化為具有生物活性的GAs［20-24］。另外，在赤霉素的生物合成過程中，還發(fā)現(xiàn)了一系列導(dǎo)致赤霉素失活的酶，對于有效調(diào)節(jié)植物中生物活性GAs的濃度具有重要意義。其中，最重要的失活反應(yīng)是由2ODDs類的GA2-氧化酶（GA 2-oxidase，GA2oxs）催化［25-27］。新近研究發(fā)現(xiàn)P450s類的CYP714D1能夠催化GA4、GA9和GA12的降解［19，28］，而甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferases，MT）類的赤霉素甲基轉(zhuǎn)移酶（gibberellin methyltransferases，GAMT）也具有可能引發(fā)赤霉素失活的作用［29］。

圖1 植物中赤霉素的生物合成途徑示意圖Fig. 1 Gibberellin biosynthesis pathways in plants

生化、遺傳和結(jié)構(gòu)分析表明，具有生物活性的GAs是通過GA-GID1-DELLA信號傳導(dǎo)模塊發(fā)揮其生物學(xué)功能。具有生物活性的GAs與受體GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1（GID1） 結(jié)合，誘導(dǎo)GID1的構(gòu)象變化，并募集生長阻遏物DELLA蛋白以形成GA-GID1-DELLA復(fù)合物。隨后，DELLA被泛素化進(jìn)而被蛋白酶體降解［1，4，30-31］（圖2）。大量研究還證實其他激素信號和環(huán)境條件的變化也是通過影響赤霉素代謝基因的表達(dá)，從而影響GAs含量和DELLA水平，與GA-GID1-DELLA調(diào)控模塊相互作用，進(jìn)而實現(xiàn)表型或生理生化方面的改變［32-38］。作為重要的功能蛋白，DELLA可通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，與眾多代謝通路形成互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［31，36，39-41］。

圖 2 GA-GID1-DELLA信號傳導(dǎo)途徑示意圖Fig. 2 Sketch of GA-GID1-DELLAsignal transduction

隨著赤霉素代謝調(diào)控相關(guān)基因的相繼鑒定，不僅從赤霉素代謝調(diào)控層面為眾多成功的農(nóng)作物遺傳改良給予了機(jī)制解析，還為認(rèn)知植物中存在的多種赤霉素調(diào)控機(jī)制提供了更清晰的試驗證據(jù)，也逐漸為利用赤霉素調(diào)控對農(nóng)作物進(jìn)行精準(zhǔn)的遺傳改良奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

2 小麥“綠色革命”基因REDUCED HEIGHT-1（Rht-1）

在單純依賴經(jīng)驗育種的時代，增加小麥高度就可以增加產(chǎn)量。相關(guān)研究也證實了小麥株高與產(chǎn)量呈正相關(guān)性［42-44］。然而，20世紀(jì)20年代后，隨著氮肥的廣泛使用，導(dǎo)致傳統(tǒng)小麥品種突長、倒伏嚴(yán)重，亟需降低作物高度。至20世紀(jì)60年代，通過引入REDUCED HEIGHT-1（Rht-1）同源的半矮化系列等位基因，作物總高度降低了12%-20%［45］。這些等位基因的引入不但成功地解決了倒伏問題，同時還顯著提高了產(chǎn)量，株高與產(chǎn)量之間的一般正相關(guān)性被打破。由于半矮化性狀能夠與更高的施肥率、更廣泛的農(nóng)藥使用和更大規(guī)模的機(jī)械化相結(jié)合，在接下來的幾十年里Rht-1等位基因為全球小麥產(chǎn)量的增長作出了重大貢獻(xiàn)，并幾乎成為了“綠色革命”的同義詞。CIMMYT的Norman Borlaug也因其在半矮化小麥品種培育和推廣中發(fā)揮的重要作用，獲得了1970年的諾貝爾和平獎。目前，在美國新培育的小麥品種中仍有超過90%的含有Rht-1等位基因［46］。

對Rht-1等位基因的研究自“綠色革命”開始一直延續(xù)至今。最早的研究發(fā)現(xiàn)，在含有Rht-1等位基因的半矮化材料中，生物活性GAs水平較高［47］，并且對外施GAs也不敏感［48］，初步說明該基因不影響GAs的生物合成，而是與信號傳導(dǎo)相關(guān)。1999年，首次克隆獲得小麥的Rht-1，并證明其屬于DELLA蛋白類。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)Rht-1等位基因是由于在DELLA結(jié)構(gòu)域中發(fā)生了突變，導(dǎo)致小麥對GAs的敏感性降低，產(chǎn)生半矮化表型［8］（圖3）。直到2011年，Pearce等［49］才利用酵母雙雜交技術(shù)在體外首次確認(rèn)了Rht-1和GID1之間的相互作用。不僅證實了Rht-1是通過GA-GID1-DELLA信號途徑發(fā)揮生物學(xué)功能，還確認(rèn)了Rht-B1b、Rht-D1b、Rht-B1e、Rht-B1c、Rht-D1c、Rht-B1d等一系列Rht-1等位基因會導(dǎo)致產(chǎn)生不同的株高表型［49-51］，但其中的具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步解析。

圖3 赤霉素合成和信號傳導(dǎo)途徑中的“綠色革命”基因Fig.3 Green Revolution genes in gibberellin biosynthesis and signal transduction

3 水稻“綠色革命”基因semidwarf-1（sd-1）

與小麥相比，半矮稈水稻對全球谷物產(chǎn)量的影響更為顯著。20世紀(jì)60年代，半矮化水稻品種在亞洲地區(qū)的廣泛推廣，導(dǎo)致水稻產(chǎn)量在幾年內(nèi)翻了一番，直接促成了“綠色革命”在亞洲地區(qū)的興起。水稻的“綠色革命”被證實是由于從韓國水稻品種Deo-Geo-Woo-Gen（DGWG）中引入了一個主要的隱性半矮化基因。美國利用γ輻照在粳稻中也創(chuàng)制出了類似的半矮化系Calrose76，并將半矮化基因定名為semidwarf-1（sd-1），該基因與DGWG中的半矮化基因是等位基因［52］。

研究發(fā)現(xiàn)源自DGWG的隱性半矮化等位基因?qū)е铝怂局蠫A20ox初始底物GA53的積累［9，53-54］，表明水稻中的半矮桿表型是由于GA20ox活性降低造成的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)編碼GA20ox的OsGA20ox2與sd-1位點密切相關(guān)，所有sd-1半矮化系均是由于OsGA20ox2發(fā)生了突變。來自DGWG的sd-1等位基因有一個383 bp的缺失，而其他獨(dú)立的sd-1等位基因也均是編碼區(qū)發(fā)生了錯義突變［9，54］（圖3）。以上結(jié)果表明，水稻的sd-1位點編碼的是負(fù)責(zé)調(diào)控赤霉素生物合成的OsGA20ox2，這使得對水稻sd-1等位基因的發(fā)掘和利用成為水稻株型改良的一個重要研究方向。

4 赤霉素代謝調(diào)控為“綠色革命”的新貢獻(xiàn)

回顧“綠色革命”的歷程，半矮化水稻和小麥品種的培育及推廣對“綠色革命”起到了決定性的作用。赤霉素缺乏的品種既表現(xiàn)出植株半矮化，又具有更多的分蘗或分支數(shù)，不但增強(qiáng)了抗倒伏能力，還提升了收獲指數(shù)［55］。然而，赤霉素也會抑制作物對氮的吸收和利用［56］，造成必須大量使用氮肥才能保證“綠色革命”品種的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。進(jìn)入21世紀(jì)，為保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，開發(fā)氮高效利用的新“綠色革命”品種成為了新的目標(biāo)。赤霉素代謝調(diào)控與植物的氮利用存在著密切的聯(lián)系，但具體的機(jī)制尚不清晰［57-58］。2018年和2020年，Li等［56］和Wu等［59］分別發(fā)現(xiàn)了水稻中GROWTH-REGULATING FACTOR 4（GRF4）和NITROGENMEDIATED TILLER GROWTH RESPONSE 5（NGR5）2個重要的氮高效利用相關(guān)基因，解析了赤霉素代謝如何參與氮代謝。其中GRF4是促進(jìn)和整合氮同化、固碳和植物生長的轉(zhuǎn)錄因子，通過與GIF1（GRF-interacting factor 1）的相互作用發(fā)揮其生物學(xué)功能。但GRF4-GIF1的相互作用會受到DELLA的抑制（圖4）。因此，調(diào)控GRF4和DELLA的平衡可在確保籽粒產(chǎn)量的同時，有效提高“綠色革命”品種的氮素利用效率［56，60］。水稻轉(zhuǎn)錄因子NGR5可促進(jìn)氮依賴的PRC2（polycomb repressive complex 2）的募集，通過對組蛋白甲基化狀態(tài)的改變，阻斷了抑制分蘗基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)分蘗。但NGR5還能夠被GA-GID1復(fù)合體結(jié)合并降解，導(dǎo)致其無法發(fā)揮促進(jìn)分蘗的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)DELLA蛋白的積累能夠競爭性地抑制GAGID1與NGR5相互作用（圖5）。這一發(fā)現(xiàn)不但解釋了“綠色革命”品種的分蘗增加的機(jī)理，而且證實了提高NGR5表達(dá)量不僅可提高水稻氮肥利用效率，而且還可保持其優(yōu)良的半矮化和高產(chǎn)特性，使水稻在適量減少施氮條件下獲得更高的產(chǎn)量［59］。這些研究成果不僅豐富了對于赤霉素作用機(jī)理的認(rèn)識，而且從分子水平揭示了“綠色革命”半矮化品種在高氮條件下增產(chǎn)的原因。也為“少投入、多產(chǎn)出、保護(hù)環(huán)境”的綠色高產(chǎn)高效農(nóng)作物分子設(shè)計育種奠定了理論基礎(chǔ)。赤霉素代謝調(diào)控再一次為“綠色革命”作出了新貢獻(xiàn)。

圖4 GRF4提高水稻中碳氮代謝效率Fig. 4 GRF4 increases the efficiency of nitrogen and carbon metabolism in rice

圖5 NGR5基因影響水稻分蘗數(shù)量的調(diào)控機(jī)理Fig. 5 Mechanism of NGR5 regulating rice tillering

5 赤霉素代謝調(diào)控與“綠色革命”品種的廣適性

赤霉素代謝調(diào)控與植物廣適性密切相關(guān)，主要通過關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)變化完成的。作為主要負(fù)責(zé)GAs降解的GA2ox類酶，在影響植物適應(yīng)性中發(fā)揮了重要的作用。GA2ox類基因參與影響植物適應(yīng)性的研究最早始于擬南芥。AtGA2ox3、AtGA2ox6和AtGA2ox7等參與了耐受鹽、旱、冷的脅迫響應(yīng)［61-65］。GA2ox類基因參與非生物脅迫響應(yīng)與APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR（AP2/ERF）類轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。例如鹽脅迫下擬南芥中DDF1（DWARF AND DELAYED FLOWERING1）和DDF2能夠直接激活GA2ox7從而導(dǎo)致生物活性GA水平下降，進(jìn)而促進(jìn)DELLA類抑制蛋白RGL3（RGA-like 3）的表達(dá)；冷脅迫下CBF1（DREB1B）的過表達(dá)則會通過激活GA2ox3和GA2ox6的表達(dá)來降低活性GA的含量；而滲透脅迫誘導(dǎo)的ERF5和ERF6的表達(dá)會引起GA2ox6的上調(diào)表達(dá)從而影響GA的合成（圖6）。在病原菌侵染條件下，茉莉酸（jasmonic acid，JA）介導(dǎo)的JAZ（JASMONATE ZIMDOMAIN）蛋白降解會解除其對DELLAs和MYC（myelocytomatosis proteins）轉(zhuǎn)錄因子的抑制。MYC2同時也會促進(jìn)DELLA的表達(dá)（圖6）。此后，水稻中的多個GA2ox類基因也參與了多種生物和非生物脅迫的響應(yīng)過程［66-70］。

圖6 赤霉素參與不同脅迫響應(yīng)的示意圖Fig.e 6 A simplified model for the role of GAs in stress response

在對野生二粒小麥［71］、面包果［72］、楊樹［73］、水稻［68］、玉米［74］、番茄［75］等植物的研究中，發(fā)現(xiàn)以GA2ox類基因為代表的赤霉素代謝調(diào)控相關(guān)基因?qū)χ参锔珊得{迫響應(yīng)也具有較強(qiáng)的規(guī)律性。多數(shù)GA2ox類基因干旱脅迫下在根中表達(dá)下調(diào)，而GID1表達(dá)上調(diào)，在葉片中，GA2ox和GID1的表達(dá)模式則與根中相反。因此，推測植物的不同部位中借助GAs調(diào)控耐旱響應(yīng)可能存在不同的機(jī)制。在根中GA2ox類基因下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致根中GAs降解減弱，從而GAs含量上升；同時，GID1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致植物體內(nèi)的GA-GID1復(fù)合體增加，使其對DELLAs的降解誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，從而減弱DELLAs對生長的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)根的伸長以獲得更多的水分。而葉片中GA2ox類基因上調(diào)和GID1的表達(dá)下調(diào)則導(dǎo)致GA-GID1復(fù)合體減少，DELLAs的降解減弱，對生長的抑制作用增強(qiáng)，減少水分的消耗。因此，根據(jù)環(huán)境條件的變化，通過調(diào)節(jié)GAs水平使其達(dá)到最佳生長速率，可能是植物中普遍存在的主動適應(yīng)機(jī)制［38］。因此，赤霉素信號通路是進(jìn)一步拓寬作物廣適性、提高作物產(chǎn)量的主要研究目標(biāo)之一。隨著相關(guān)研究的深入和生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，通過合理的遺傳改良，赤霉素代謝調(diào)控相關(guān)基因有望在拓展作物品種的廣適性上繼續(xù)發(fā)揮重要的作用。

6 “綠色革命”基因的應(yīng)用

隨著技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的科研人員開始利用生物學(xué)手段對作物進(jìn)行遺傳改良?；诔嗝顾卮x調(diào)控的相關(guān)理論研究成果培育新型的“綠色革命”品種，已成為一個主要研究方向。

在作物株高改良方面，小麥中系列Rht等位基因的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，創(chuàng)制出一批半矮化小麥品種［76-77］；水稻中利用EMS誘變和RNAi等技術(shù)，也獲得了許多sd-1突變體，培育出一系列半矮化水稻品種［78-79］。2019年，錢前院士課題組通過對sd-1進(jìn)行基因編輯，成功的降低了優(yōu)良水稻品種卡薩拉斯和特特普的株高，在保持材料原有理想農(nóng)藝特性的基礎(chǔ)上，提高了這兩個品種的抗倒伏性［80］。2020年，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所對玉米中sd-1同源基因ZmGA20ox2進(jìn)行了基因編輯，也成功的獲得了抗倒伏性狀突出的半矮化的玉米材料。

在提高作物廣適性方面，研究者也通過對赤霉素調(diào)控的遺傳改良進(jìn)行了非常多的嘗試。最有代表性的成果是通過在水稻中表達(dá)一些OsGA2ox6突變體，實現(xiàn)了適度降低GAs水平的效果。導(dǎo)致水稻株高降低，分蘗增加，根系擴(kuò)張，水分利用效率和光合作用速率提高，非生物和生物脅迫耐受性增強(qiáng)。這些有益性狀的組合不僅使得后代材料具有廣泛的抗逆性和抗病性，而且產(chǎn)量也提高了10%-30%［67］。這一成果有力的支持了通過精細(xì)調(diào)控GAs水平提高作物廣適性這一設(shè)想的可行性。這些結(jié)果表明，以“綠色革命”基因的研究成果為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行育種改良，是豐富作物品種遺傳多樣性的有效途徑。

7 總結(jié)與展望

雖然植物中的赤霉素合成及信號傳導(dǎo)的代謝調(diào)控通路已經(jīng)基本構(gòu)畫完成，但仍有大量的問題需要解決：（1）GAs合成相關(guān)的2ODD基因家族成員眾多，且存在著明顯的時空表達(dá)特異性。要對這些基因進(jìn)行利用，有必要對其中的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入研究。（2）對GAs失活途徑中GA2ox和GA13ox等家族成員的了解并不深入，需要在更多作物中進(jìn)行相關(guān)酶和基因的鑒定，為解析這些酶的基本生理功能提供更多的信息。另外，雖然已有大量研究證實GAs失活酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對植物生長非常重要，但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制也仍然未知。（3）DELLA蛋白作為重要的樞紐性蛋白，其通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白間相互作用參與了大量植物生長調(diào)控過程。隨著技術(shù)進(jìn)步，有必要采用系統(tǒng)生物學(xué)、比較基因組學(xué)、功能基因組學(xué)等研究方法，在更多的物種中研究DELLA的功能，以便未來在作物改良中進(jìn)行合理的應(yīng)用。（4）雖然Rht-1和sd-1的應(yīng)用取得了巨大的成功，但其他半矮化等位基因似乎都未能實現(xiàn)既保持作物產(chǎn)量又降低株高減少倒伏的效果。未來仍需要進(jìn)一步的研究，來明確解析使Rht-1和sd-1實現(xiàn)“綠色革命”的發(fā)育和代謝機(jī)制。另外，如何利用基因編輯等新技術(shù)對赤霉素代謝相關(guān)基因進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，創(chuàng)制新的“綠色革命”品種，也將成為一個重要課題。