不同年齡大鼠尿液代謝組學(xué)研究

楊玉萍 張霞 王翀翀 王曉艷

（上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院 系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老是極為復(fù)雜的生理過(guò)程，伴隨著分子、細(xì)胞和器官等多個(gè)因素的改變，最終導(dǎo)致機(jī)體在代謝、功能和健康狀態(tài)方面發(fā)生系列變化［1-2］。年齡與代謝改變具有密切關(guān)系，年齡增加導(dǎo)致的慢性低度炎癥和腸道菌群改變可引起代謝失調(diào)，而代謝失調(diào)進(jìn)一步促進(jìn)與年齡相關(guān)的疾病的發(fā)生與發(fā)展［2-4］。

代謝組學(xué)是現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，專注于獲取與生理和病理過(guò)程相關(guān)的生物體當(dāng)前代謝狀態(tài)的完整描述［5］，已被廣泛應(yīng)用于不同生物年齡相關(guān)的代謝規(guī)律研究中。Copes等［6］利用代謝組學(xué)方法檢測(cè)到隨著Caenorhabditis elegans年齡的增長(zhǎng)，游離脂肪酸和山梨醇水平升高，嘌呤和嘧啶相關(guān)代謝物以及疏水性氨基酸水平降低，預(yù)示著改變的脂代謝、糖代謝和核苷酸代謝。人群實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝物，氨基酸代謝物如組氨酸、賴氨酸和蘇氨酸以及檸檬酸循環(huán)相關(guān)代謝物隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)生顯著變化［7］。在課題組已發(fā)表的成果中，我們利用代謝組學(xué)方法研究大鼠各個(gè)腦區(qū)和血清代謝隨年齡增長(zhǎng)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)年齡顯著改變了腦和血清代謝，特別是脂肪酸和氨基酸類代謝物［2，8］。

尿液是一種重要的、易于獲取的生物樣本，采集成本低，無(wú)創(chuàng)，且不需要訓(xùn)練有素的專業(yè)人員，因此成為了臨床使用的理想生物液體［9］。本研究利用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC/TOF-MS）對(duì)不同年齡大鼠的尿液樣本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，探究年齡對(duì)大鼠尿液代謝的影響，為揭示尿液代謝譜的隨年齡增長(zhǎng)的變化規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 潔凈級(jí)Wistar大鼠14只（雌雄各7只），4周齡，均購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 色譜純甲醇購(gòu)于Merck公司；尿素酶、分析純2-氯苯丙胺酸、分析純吡啶和分析純甲氧胺購(gòu)于 Sigma-Aldrich 公司；硅烷化試劑BSFTA（含1%TMCS）購(gòu)于安普生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（氣相色譜儀型號(hào)為 Agilent 6890N，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀型號(hào)為 Leco Pegsus HT）；大鼠新型代謝籠（蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）；Forma-86℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo 公司）；XS105內(nèi)校分析天平（美國(guó)Mettler toledo公司）；5415R冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；H-101渦旋儀（上?？岛坦怆妰x器有限公司）；DHG-9123A恒溫干燥器（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Milli-Q advantage超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；LNG-T88臺(tái)式快速離心濃縮干燥器和LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器（太倉(cāng)市華美生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠飼養(yǎng)與樣本收集 將14只4周齡的Wistar大鼠（雌雄各7只）單籠飼養(yǎng)，所有操作嚴(yán)格按照中國(guó)法律、地方規(guī)定和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范執(zhí)行。待大鼠8周齡即成年后，雌雄隨機(jī)配對(duì)并合籠飼養(yǎng)，20 d后雌鼠生產(chǎn)。每窩隨機(jī)抽取6只新生雄性仔鼠隨機(jī)分配到各組。共42只新生雄性仔鼠分為7組，分別為出生后第3周、第5周、第7周、第9周、第12周、第56周、第111周（記為W3、W5、W7、W9、W12、W56、W111），每組各6只，如圖1。雄性仔鼠斷奶后，在3周齡時(shí)與雌性母鼠分籠飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均提供充足標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料和無(wú)菌水，無(wú)菌水每2-3 d更換一次，飼養(yǎng)溫度為（24±1）℃，飼養(yǎng)濕度為（45±15）%，每天保持12 h光照與12 h黑暗。待各組仔鼠長(zhǎng)到相應(yīng)年齡點(diǎn)時(shí)，置于代謝籠中收集尿液樣本，樣本在室溫下以3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝后置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)檢測(cè)。

圖1 大鼠尿液樣本取樣時(shí)間點(diǎn)和年齡分段示意圖Fig.1 Schematic diagram of rat urine sampling time points and age segments

1.2.2 尿液樣本預(yù)處理與代謝物檢測(cè) 待各組樣本收集完成之后，將尿液樣本同時(shí)取出進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)蛞簶颖绢A(yù)處理方法根據(jù)課題組已發(fā)表方法進(jìn)行微調(diào)［10］，簡(jiǎn)述如下：取100 μL尿液樣本與10 μL尿素酶（30 U/10 μL）充分混合，在37℃條件靜置15 min，加入2-氯苯丙氨酸溶液（溶于水，0.1mg/mL）10 μL作為內(nèi)標(biāo)，并加入300 μL甲醇渦旋混勻。4℃條件下13 200 r/min離心5 min，吸取300 μL上清移至進(jìn)樣瓶中于室溫下進(jìn)行真空離心干燥。然后加入甲氧胺（溶于吡啶，15 mg/mL）80 μL，密封并渦旋30 s混勻，37℃反應(yīng)1.5 h，接著加入80 μL BSTFA（含1% TMCS），渦旋30 s混勻，70℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后渦旋10 s，室溫放置1 h用于后續(xù)上機(jī)檢測(cè)。質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品由所有原始尿液樣品混合后制備，預(yù)處理方法同上述各個(gè)尿液樣本。將各樣品隨機(jī)排列后上機(jī)檢測(cè)以減少系統(tǒng)誤差，進(jìn)樣始末及每10次進(jìn)樣安排QC樣本檢測(cè)。每個(gè)樣本吸取1 μL進(jìn)行氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)，條件如下：載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱升溫程序設(shè)置為80℃持續(xù)2 min→以10℃/min的速度加熱至140℃→以4℃/min的速度加熱至240℃→以25℃/min的速度加熱至290℃，持續(xù)4.5 min；進(jìn)樣口、傳輸接口和離子源的溫度分別為：270℃、270℃和220℃；電離方式為EI，電子能量為70 eV；掃描范圍為30-600m/z，采集速率為20光譜/s。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 儀器檢測(cè)所得原始數(shù)據(jù)在Chroma TOF軟件（v4.51.6.0，LECO，USA）中經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、降噪、基線校準(zhǔn)、峰識(shí)別和對(duì)齊過(guò)程，轉(zhuǎn)化為一套完整三維數(shù)據(jù)集（含樣本信息、保留時(shí)間和峰強(qiáng)度）。代謝物鑒定采用自建標(biāo)品庫(kù)和商業(yè)譜庫(kù)，如HMDB（human metabolome database）數(shù)據(jù)庫(kù)和NIST（national institute of standards and technology）數(shù)據(jù)庫(kù)等。以相似度≥700、代謝物數(shù)據(jù)缺失值小于樣本總數(shù)的60%作為代謝物保留條件，矩陣經(jīng)補(bǔ)零和歸一化后輸入SIMCA-P13.0（Umetrics，Sweden）軟件進(jìn)行主成分分析（principle component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。因超過(guò)85%的變量為非正態(tài)分布，我們使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)多組之間差異性，并使用Dunn’s post hoc test 和Benjamini-Hochberg 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）進(jìn)行多重檢驗(yàn)。所有的檢驗(yàn)均是雙邊檢驗(yàn)，P值均通過(guò)FDR校正且默認(rèn)P＜ 0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 代謝組學(xué)輪廓分析

通過(guò)對(duì)不同年齡大鼠的尿液樣本進(jìn)行GC/TOFMS檢測(cè)，共鑒定到110種代謝物，為描述各組大鼠尿液樣本的整體代謝組學(xué)差異，進(jìn)行了PCA分析（圖2-A）和PLS-DA分析（圖2-B）。從圖2可以看出，QC樣本分布集中，說(shuō)明儀器檢測(cè)過(guò)程穩(wěn)定，重復(fù)性良好。PCA得分圖顯示，各年齡組尿液代謝可通過(guò)第一主成分或第二主成分明顯分開。無(wú)監(jiān)督分析結(jié)果表明，年齡是影響健康大鼠尿液代謝的主要因素。所有年齡組的PLS-DA模型也證實(shí)了這一觀測(cè)結(jié)果。

圖2 大鼠尿液代謝輪廓散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plots of rat urine metabolism profile

2.2 代謝物類型統(tǒng)計(jì)

檢測(cè)到的110種尿液代謝物中，包括氨基酸類代謝物18種，碳水化合物類代謝物21種，脂肪酸類代謝物19種，有機(jī)酸類代謝物34種和其它代謝物18種。其中，氨基酸類代謝物、有機(jī)酸類代謝物和碳水化合物類代謝物是大鼠尿液樣本中的主要代謝物類型，合計(jì)占比超過(guò)74%，并且三者相對(duì)含量依次遞減。有機(jī)酸類代謝物在幼年（W3和W5）、成年（W7、W9和W12）和老年階段（W56和W111）的相對(duì)含量依次升高（圖3）。

圖3 不同年齡段尿液代謝物類型相對(duì)豐度圖Fig.3 Relative abundance of metabolite types in rat urine with different age segments

2.3 差異代謝物篩選

考慮到7周齡為大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的成熟階段，將其余各組均值分別與W7組均值作比較，并使用多重檢驗(yàn)方法分析各組與W7組的差異性，按代謝物類型分別繪制差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）熱圖（圖4）。

圖4 所有尿液代謝物的差異倍數(shù)熱圖Fig.4 Fold change heatmaps of all urine metabolites

熱圖結(jié)果顯示，氨基酸類代謝物如2-哌啶甲酸（pipecolic acid）從W12開始相較于W7顯著升高，肌酸酐（creatinine）隨年齡幾乎呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，與之相反地，L-賴氨酸（L-Lysine）、尿囊酸（allantoic acid）、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、丙氨酸（Alanine）、4-羥基脯氨酸（4-hydroxyproline）、L-纈氨酸（L-Valine）、L-正亮氨酸（L-Norleucine）、蘇氨酸（Threonine）和L-絲氨酸（L-Serine）在幼年階段的大鼠尿液中水平較高，而后逐漸降低，特別是尿囊酸在W56和W111與W7相比顯著降低。

碳水化合物類代謝物如肌醇（myo-inositol）、丙 三 醇（glycerol）、D-葡 萄 糖（D-glucose）和D-甘露糖（D-mannose）在成年階段水平較低，在幼年和老年階段水平較高，2，3-二羥基丁酸（2，3-Dihydroxybutanoic acid）、山 梨 醇（sorbitol）、D-核 糖（ribose）、D-松醇（D-pinitol）和L-阿拉 伯糖醇（L-arabitol）水平與W7組相比，在老年階段均升高。相反地，甘油酸（glyceric acid）在老年階段出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，另外，1，5-脫水山梨醇（1，5-anhydrosorbitol）在W3顯著升高，而海藻糖（trehalose）和核糖醇（ribitol）在W3顯著降低。

在有機(jī)酸類代謝物中，3，4，5-三羥基戊酸鹽（2-Deoxypentonic acid）、α-氧代戊二酸（oxoglutaric acid）、馬尿酸（hippuric acid）和烏頭酸（aconitic acid）的水平隨大鼠年齡增長(zhǎng)而逐漸升高，其中，3，4，5-三羥基戊酸鹽和α-氧代戊二酸在老年階段顯著升高，富馬酸（fumaric acid）和蘋果酸（malic acid）水平也在老年階段升高，草酸（oxalic acid）水平隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降，其在W111的水平與W7相比顯著降低。尿液代謝物中多種有機(jī)酸類代謝物隨年齡增加先升高后下降，如苯甲酸（benzoic acid）、煙酸（nicotinic acid）、苯乙酸（phenylacetic acid）、琥珀酸（succinic acid）、丙酮酸（pyruvic acid）、犬尿酸（kynurenic acid）和吲哚乙酸（indoleacetic acid）等。與此相反的，5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid）隨年齡增長(zhǎng)先下降后升高。

脂肪酸類代謝物如5-羥基己酸（5-hydroxyhexanoic acid）和2-甲基-3-羥基丁酸（2-methyl-3-hydroxybutyric acid）均在W3和老年階段相較于W7顯著降低，乙基丙二酸（ethylmalonic acid）和甲基琥珀酸（methylsuccinic acid）隨大鼠年齡的增長(zhǎng)整體呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，分別在W12和W111顯著升高。

其它類型的尿液代謝物如對(duì)苯二酚（hydroquinone）、3-乙基苯酚（3-ethylphenol）、乳清酸（orotic acid）和3-羥基苯乙酸（3-hydroxyphenylacetic acid）在幼年階段水平較低，在成年和老年階段水平升高，而脫氧胞苷（deoxycytidine）、尿酸（uric acid）、乙醇胺（ethanolamine）和胸腺嘧啶（thymine）則在幼年階段水平較高。5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）在成年期水平最低，相反的，5-羥基吲哚（5-hydroxyindole）在成年期水平較高，在幼年和老年階段水平顯著降低。

3 討論

本文利用GC/TOF-MS檢測(cè)到110種尿液代謝物，無(wú)監(jiān)督的PCA分析和有監(jiān)督的PLS-DA分析結(jié)果表明，各年齡點(diǎn)均可被第一或第二主成分完全分離，表示年齡是影響尿液代謝的主要因素。大鼠尿液代謝在生命周期中出現(xiàn)的隨年齡的變化，或可作為預(yù)測(cè)大鼠年齡段和生理病理狀態(tài)的依據(jù)。

氨基酸除了作為機(jī)體蛋白質(zhì)和多肽的基本組成單位外，還參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、繁殖和免疫所必需的關(guān)鍵代謝途徑［11］。氨基酸類代謝物在尿液中水平極高，占比超過(guò)35%。2-哌啶甲酸作為賴氨酸分解代謝的產(chǎn)物，在遺蛋白缺陷癥、過(guò)氧化物酶功能障礙、高賴氨酸血癥和脯氨酸代謝缺陷癥等疾病中水平升高［12］。從W9起，L-賴氨酸水平逐漸降低，隨后從W12開始，2-哌啶甲酸顯著升高，這可能預(yù)示著年齡相關(guān)代謝疾病的發(fā)生。4-羥基脯氨酸是合成膠原蛋白的主要原材料之一，在幼年、成年和老年階段逐漸降低，與在血清中的變化趨勢(shì)一致［2］，這與膠原蛋白隨著年齡增加逐漸減少有關(guān)。必需氨基酸如L-賴氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、蘇氨酸以及其它氨基酸如丙氨酸、L-絲氨酸、L-正亮氨酸和尿囊酸均在幼年階段水平較高，而后逐漸降低。缺乏賴氨酸、纈氨酸和蘇氨酸將會(huì)導(dǎo)致大腦神經(jīng)功能障礙和免疫缺陷［11，13］。L-絲氨酸及其代謝產(chǎn)物不僅被認(rèn)為是細(xì)胞增殖所必需的，而且也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定功能所必需的［14］。

眾所周知，D-葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)的能量產(chǎn)生、儲(chǔ)存和調(diào)節(jié)以及糖尿病和肥胖的致病作用中起著核心作用，而D-甘露糖在某些蛋白質(zhì)的糖基化過(guò)程中很重要［15］。這兩種代謝物與甘油和肌醇一樣，在幼年和老年階段的水平較W7組均有所升高。研究表明，D-核糖誘導(dǎo)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，腹腔注射D-核糖可導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶障礙及大腦炎癥。我們的研究結(jié)果表明，D-核糖在老年階段水平遠(yuǎn)高于其他年齡段，相比于W7組也顯著升高，這可能與神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退有密切關(guān)系。多元醇被認(rèn)為對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在毒性［16］，我們?cè)诖笫竽蛞褐袡z測(cè)到山梨醇水平從W12起顯著升高。

有機(jī)酸類代謝物總水平在幼年、成年和老年階段不斷升高。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病小鼠相比于健康小鼠尿液PH值變低，且隨著病情不斷進(jìn)展，尿液PH值更低［17］。有機(jī)酸類代謝物總水平的不斷升高，或許與糖尿病等年齡相關(guān)代謝疾病有關(guān)。α-氧代戊二酸、烏頭酸、富馬酸和蘋果酸在W111周相對(duì)于W7升高，這些物質(zhì)作為三羧酸循環(huán)的中間體，同樣在糖尿病腎病的小鼠尿液中檢測(cè)到水平升高［17］，大量排泄未利用的三羧酸循環(huán)中間體或許暗示老年大鼠能量產(chǎn)生障礙［18］。作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的前體物質(zhì)，煙酸水平隨年齡增加也出現(xiàn)先升高后降低的變化。NAD是表觀遺傳修飾、DNA損傷修復(fù)和衰老等關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程的重要調(diào)控因子，其水平在衰老過(guò)程中發(fā)生系統(tǒng)性下降，并導(dǎo)致年齡相關(guān)的功能衰退［19］，這也提示在膳食中添加NAD前體物質(zhì)如煙酸或可改善健康和延緩衰老。

脂肪酸類代謝物在尿液中占比較少，僅約4%。大鼠尿液代謝結(jié)果顯示，乙基丙二酸和甲基琥珀酸水平在中老年階段顯著升高。研究表明，長(zhǎng)期高水平的乙基丙二酸與至少兩種先天性代謝缺陷有關(guān)，包括短鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥和乙基丙二酸腦?。?0］。甲基琥珀酸也被發(fā)現(xiàn)與先天性代謝缺陷如乙基丙二酸腦病、異戊酸血癥和中鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥有關(guān)［21-22］。

作為嘧啶核苷酸合成途徑的中間體，乳清酸在幼年水平較低，到成年和老年階段水平升高。在某些先天代謝途徑如嘧啶合成和尿素循環(huán)錯(cuò)誤的患者中，會(huì)發(fā)生過(guò)多的尿乳清酸排泄［23］。尿酸是嘌呤代謝的最終氧化產(chǎn)物，作為一種非常重要的抗氧化劑，有助于維持血壓的穩(wěn)定和抗氧化應(yīng)激，被認(rèn)為是人類和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物延長(zhǎng)壽命和降低年齡特異性癌癥發(fā)病率的主要因素［24-25］。本研究中，尿酸隨大鼠年齡增長(zhǎng)幾乎呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。5-羥基吲哚在成年期水平較高，幼年和老年階段水平較W7組顯著下降，該物質(zhì)是色氨酸的代謝產(chǎn)物，參與學(xué)習(xí)、記憶和中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)線粒體功能［26］。

4 結(jié)論

本文利用代謝組學(xué)平臺(tái)對(duì)長(zhǎng)達(dá)111周等7個(gè)年齡點(diǎn)的大鼠尿液樣本進(jìn)行了全譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4-羥基脯氨酸、L-賴氨酸和尿酸等隨年齡增加逐漸下降，D-核糖、烏頭酸和富馬酸等在老年階段水平升高，而煙酸和5-羥基吲哚等在老年階段水平下降。該研究發(fā)現(xiàn)了與生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老有關(guān)的尿液代謝物，為揭示尿液代謝譜的隨年齡增長(zhǎng)的變化規(guī)律提供了參考。