鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)及菌群的影響

謝果珍 唐圓 寧曉妹 邱集慧 譚周進(jìn)

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208）

高脂高糖飲食是當(dāng)代社會(huì)常見的飲食模式，也是肥胖、糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的誘因。與此同時(shí)，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到疾病與腸道有密切的關(guān)系。健康的腸道有助于機(jī)體抵御疾病、維持健康狀態(tài)，而影響腸道健康的兩個(gè)關(guān)鍵因素是腸黏膜屏障及腸道菌群［1］。腸黏膜屏障是機(jī)體極其重要的防線，如腸黏膜受損將導(dǎo)致細(xì)胞間的通透性增加，共生細(xì)菌、病原菌、病毒及毒素等物質(zhì)穿過腸黏膜進(jìn)入機(jī)體的其他組織或器官，引發(fā)疾病。腸道菌群在機(jī)體代謝及免疫中的重要性已被廣泛證實(shí)，腸道菌群失調(diào)是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。研究表明長(zhǎng)期高脂飲食提高了腸道炎癥細(xì)胞因子信號(hào)，降低腸黏膜屏障的完整性，降低杯狀細(xì)胞分化，減少黏蛋白MUC 2及緊密連接蛋白Claudin-1的表達(dá)，增加血清內(nèi)毒素水平，從而誘發(fā)慢性腸道炎癥［2］。另外，高脂飲食改變了腸道微生物的組成及多樣性，造成腸道微生態(tài)失衡［3-4］。

多糖是一類難被人體直接消化吸收，但對(duì)腸道微生態(tài)有積極調(diào)節(jié)作用的成分。研究表明，多糖可減少代謝內(nèi)毒素，降低炎癥因子的表達(dá)，增加緊密連接蛋白的表達(dá)，從而緩解腸黏膜損傷，改善腸道完整性；可通過促進(jìn)有益菌的增殖和減少有害菌的數(shù)量以形成更健康的菌群結(jié)構(gòu)；還可提高碳水化合物活性酶的活性，提高代謝效率，生成短鏈脂肪酸以進(jìn)一步影響機(jī)體免疫［5-8］。因此，多糖已成為功能性食品開發(fā)的重要成分。鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生草本植物，具有“久服厚腸胃”的作用，多糖是其主要成分［9］。已有研究顯示鐵皮石斛多糖（Dendrobium officinalepolysaccharides，DOP）對(duì)大鼠口服無(wú)水乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷有保護(hù)作用［10］；可減輕結(jié)腸病理?yè)p傷，改善右旋糖酐硫酸酯鈉誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎［11］，但對(duì)高脂飲食引起的腸黏膜損傷及腸黏膜菌群的影響研究較少。因此本研究考察鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)及菌群的影響，以期為鐵皮石斛多糖的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 都市主婦全能小鋼磨（永康市鉑歐五金制品有限公司），202-2AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），HA-600三用恒溫水箱（金壇市神科儀器廠），Nano-drop 2000/2000C紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公司），YD-A生物組織攤片機(jī)（上海珂淮儀器有限公司），RM2235石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡），MOTIC BA410研究型顯微鏡（廈門麥克奧迪），MOTIC 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪），電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 新鮮鐵皮石斛購(gòu)于昆明市螺螄灣中藥材市場(chǎng)，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)王智講師鑒定為正品。無(wú)水葡萄糖、無(wú)水乙醇、硫酸、苯酚均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。4%多聚甲醛（Biosharp），HE染液（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料 無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性昆明（KM）小鼠15只，體質(zhì)量為（20±2）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］。小鼠購(gòu)回后于室溫 20-22℃，相對(duì)濕度50%-70%環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由取食及飲水。小鼠基礎(chǔ)飼料及高脂飼料（87.5%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、2%膽固醇、0.5%豬膽鹽）由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖的制備 新鮮鐵皮石斛洗凈后晾干，在105℃鼓風(fēng)干燥箱中殺青30 min后60℃烘干。將干燥的鐵皮石斛打粉，過60目篩，稱重后加30倍量蒸餾水，90℃水浴提取1 h，紗布過濾，重復(fù)3 次，合并濾液，蒸發(fā)濃縮，濃縮液冷卻后加3倍體積75%乙醇，攪拌均勻后于4℃沉淀過夜，沉淀用75%乙醇洗滌3次后烘干至恒重，研磨成粉末后密封放于干燥器中備用。鐵皮石斛多糖的提取率為31.75%，用苯酚-硫酸法測(cè)得鐵皮石斛多糖中總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.23%。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常組（N）、高脂飲食組（H）和鐵皮石斛多糖組（HP），每組5只。正常組給予基礎(chǔ)飼料，高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組給予高脂飼料，3組小鼠自由飲水。同時(shí)，正常組及高脂飲食組灌胃無(wú)菌水，鐵皮石斛多糖組灌胃鐵皮石斛多糖溶液。參考《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）［12］，按成人9 g/d的用量及提取率計(jì)算鐵皮石斛多糖的小鼠臨床等效用量為350 mg/kg/d，灌胃量為0.4 mL/只/次，每天1 次，連續(xù)8 周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)為L(zhǎng)L2020071001。

1.2.3 取材 灌胃鐵皮石斛多糖8周后取材，取材前12 h禁食不禁水，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取小腸段，擠出腸道內(nèi)容物后剖開小腸，用生理鹽水清洗2次后用滅菌的蓋玻片刮取黏膜，裝于無(wú)菌EP管。所有樣本凍于-20℃冰箱待測(cè)。

1.2.4 腸組織切片制備及觀察 取各組小鼠相同部位的結(jié)腸0.5 g，置于4% 多聚甲醛中固定，制備石蠟包埋切片，HE染色后用顯微鏡觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)并拍照。

1.2.5 16S rRNA基因測(cè)序 所有腸道黏膜樣本提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化，質(zhì)檢合格后對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因（V3+V4）測(cè)序（Illumina HiSeq 2500），引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，用 USEARCH（version 10.0）對(duì)所得到的高質(zhì)量序列在相似性 97%的水平上進(jìn)行聚類得到OTU，利用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132，http://www.arb-silva.de）進(jìn)行物種注釋。用QIIME 2（https://qiime2.org/）分析Alpha及Beta多樣性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行2組間的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響

圖1可見，正常組小鼠腸黏膜表面光滑、完整，細(xì)胞境界清楚，排列緊密，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；高脂飲食組小鼠腸黏膜萎縮、脫落，伴炎性滲出；鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜表面光滑、完整，細(xì)胞境界清楚，排列緊密，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，說(shuō)明鐵皮石斛多糖對(duì)腸黏膜結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

圖1 鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effects of DOP on the intestinal mucosal structure of mice fed a high fat diet

2.2 鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜菌群的影響

2.2.1 OTU及Alpha多樣性分析 對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控、拼接后得到的有效序列在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，所有樣本共得到719條OTU。從Venn圖（圖2）可看出正常組、高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群的OTU數(shù)分別為541、567、531條，其中共有OTU為349條，特有OTU分別為65、50、33條。

圖2 鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜菌群OTU的影響Fig. 2 Effect of DOP on the OTU of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet

對(duì)樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)高脂飲食及鐵皮石斛多糖均提高了小鼠腸黏膜菌群的多樣性。與正常小鼠相比，高脂飲食組小鼠腸黏膜菌群多樣性無(wú)顯著性差異，鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群的Simpson及Shannon指數(shù)有顯著性差異（Simpson，P＜ 0.05；Shannon，P＜ 0.05）（圖3）。

圖3 鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜菌群Alpha多樣性的影響（x-±s，N=5）Fig. 3 Effect of DOP on the Alpha diversity of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet（x-±s，N = 5）

2.2.2 Beta多樣性分析 采用binary jaccard算法進(jìn)行PCoA（principal coordinates analysis）分析，從圖4可知，正常組小鼠腸黏膜菌群較相似，而高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組組內(nèi)小鼠的腸黏膜菌群差異較大。從總體而言，鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群與正常組小鼠差異較大，可明顯區(qū)分，而高脂飲食組小鼠有與正常組小鼠腸黏膜菌群相似的樣本，也有接近鐵皮石斛多糖組的樣本，可能與不同小鼠個(gè)體對(duì)高脂飲食及鐵皮石斛多糖的響應(yīng)差異有關(guān)。

圖4 鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜菌群Beta多樣性的影響（N=5）Fig. 4 Effect of DOP on the Beta diversity of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet（N = 5）

2.2.3 物種分類信息 參照SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132，http://www.arb-silva.de）進(jìn)行分類學(xué)注釋，在15個(gè)樣本中共注釋得到19個(gè)菌門，348個(gè)菌屬。在門水平上，3組小鼠腸黏膜中豐度最高的3個(gè)菌門分別為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria，在正常組小鼠中Cyanobacteria及Epsilonbacteraeota的相對(duì)豐度較高，而高脂飲食組及鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中Bacteroidetes的相對(duì)豐度增加，取代Cyanobacteria成為相對(duì)豐度第4的菌門。鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中Firmicutes的相對(duì)豐度與正常組相比顯著下降（P＜ 0.05），Epsilonbacteraeota的相對(duì)豐度與高脂飲食組相比顯著提高（P＜ 0.05）（圖5-A）。

在屬水平上，Lactobacillus是不同處理中小鼠腸道的優(yōu)勢(shì)菌屬。從圖5-B可以看出，高脂飲食及鐵皮石斛多糖處理后小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變，以相對(duì)豐度前5的菌屬為例，正常組小鼠腸黏膜的優(yōu)勢(shì)菌群依次為L(zhǎng)actobacillus、Candidatus_Arthromitus、Staphylococcus、uncultured_bacterium_o_Chloroplast、Brevibacterium；高脂飲食組小鼠腸黏膜的優(yōu)勢(shì)菌群依次為L(zhǎng)actobacillus、Staphylococcus、Candidatus_Arthromitus、Corynebacterium_1、Ochrobactrum；鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜的優(yōu)勢(shì)菌群依次為L(zhǎng)actobacillus、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Candidatus_Arthromitus、Staphylococcus、Enterorhabdus。

圖5 鐵皮石斛多糖對(duì)高脂飲食小鼠腸黏膜菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Effect of DOP on the structure of mucosa-associated microbiota of mice fed a high fat diet

與正常組相比，高脂飲食顯著減少了Escherichia-Shigella（P＜0.05）、RB41（P＜0.05）、uncultured_bacterium_f_Intrasporangiaceae（P＜ 0.05）的相對(duì)豐度。與高脂飲食組相比，鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度顯著 增 加（P＜ 0.05）。經(jīng) 過LEfSe（line discriminant analysis（LDA）effect size）分析，發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物（biomarker）。具體地，Corynebacterium_1、Staphylococcus是高脂飲食組小鼠腸黏膜菌群的重要菌屬，而鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜菌群的重要菌屬為Enterorhabdus（圖6）。

圖6 高脂飲食及鐵皮石斛多糖處理后產(chǎn)生的特異性菌Fig. 6 Biomarker of mucosa-associated microbiota after DOP and high-fat diet treating

3 討論

腸道黏膜是機(jī)體抵御病原微生物入侵的主要屏障，腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障及免疫屏障共同組成。其中，機(jī)械屏障由上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接、菌膜及黏液層組成，如上皮細(xì)胞受損脫落，容易導(dǎo)致腸道通透性增加，細(xì)菌異位，進(jìn)而加大感染的風(fēng)險(xiǎn)［13-14］。Schroeder等［15］的研究顯示給予小鼠高脂肪、低纖維的飲食會(huì)增加腸道黏膜內(nèi)黏液層的滲透率。Ding等［16］的研究報(bào)道了與肥胖相關(guān)的腸道炎癥主要發(fā)生在小腸，而Gulhane等［2］的研究顯示長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致遠(yuǎn)端結(jié)腸炎癥增加。因此本研究考察了高脂飲食及鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示高脂飲食破壞了小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出腸黏膜萎縮、上皮細(xì)胞脫落并伴有炎性滲出，而鐵皮石斛多糖減輕了高脂飲食對(duì)腸黏膜結(jié)構(gòu)的損傷，證實(shí)了功能性多糖對(duì)腸黏膜屏障有保護(hù)及修復(fù)作用。

腸道菌群分為腸腔菌群及腸黏膜菌群，腸腔菌群存在于腸腔液中，不與上皮細(xì)胞直接接觸，且受飲食及藥物的影響較大，腸黏膜菌群相對(duì)穩(wěn)定［17-18］。腸黏膜菌群是腸道生物屏障的重要部分，可維持腸道屏障的完整性，研究表明腸黏膜菌群在誘導(dǎo)宿主免疫和炎癥過程中起到關(guān)鍵作用［19-20］，因此針對(duì)腸黏膜菌群的相關(guān)研究日益增多。本研究考察了高脂飲食及鐵皮石斛多糖對(duì)腸黏膜菌群的影響，發(fā)現(xiàn)高脂飲食及鐵皮石斛多糖均提高了腸黏膜菌群的多樣性，且鐵皮石斛多糖的影響更深遠(yuǎn)。進(jìn)一步分析不同處理小鼠腸黏膜菌群的結(jié)構(gòu)及組成可知高脂飲食及鐵皮石斛多糖極大改變了腸黏膜菌群，具體表現(xiàn)為高脂飲食使有害菌屬大量增殖，而鐵皮石斛多糖則增加了碳水化合物代謝相關(guān)菌屬及短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌屬的數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)Corynebacterium_1、Staphylococcus是高脂飲食組小鼠腸黏膜的重要菌屬。Corynebacterium及Staphylococcus中有大量與感染、炎癥相關(guān)的菌種，如Corynebacteriumdiphtheriae、Corynebacteriumsimulans、Corynebacteriumulcerans、Corynebacterium glucuronolyticum、Staphylococcusaureus、Staphylococcusepidermidis等。Corynebacterium的病原菌株可導(dǎo)致乳腺感染［21］、泌尿系統(tǒng)感染［22］、上呼吸道感染［23］、角膜炎［24］、脊柱炎［25］，而Staphylococcus的病原菌株可引起敗血癥、感染性心內(nèi)膜炎、肺炎、眼部感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染［26］。Corynebacterium_1及Staphylococcus在小鼠攝入高脂飲食后其豐度大大提高，或可說(shuō)明高脂飲食破壞了腸黏膜完整性后導(dǎo)致了有害菌的入侵，繼而引發(fā)炎癥反應(yīng)，而鐵皮石斛多糖可降低兩者的豐度，且對(duì)Corynebacterium_1的抑制作用強(qiáng)于Staphylococcus。

多糖具有益生元特性，其有益作用主要體現(xiàn)為對(duì)腸道菌群的組成及其代謝產(chǎn)物的影響［1］。Candidatus_Arthromitus是定植于脊椎動(dòng)物腸壁，與吸收性腸上皮細(xì)胞表面緊密結(jié)合的一類共生菌，屬于節(jié)段絲狀細(xì)菌（segmented filamentous bacteria，SFB）的一種。Candidatus_Arthromitus可通過促進(jìn)腸道Th17細(xì)胞的分化和成熟以及免疫球蛋白A（IgA）的產(chǎn)生促進(jìn)小鼠和大鼠的適應(yīng)性和先天免疫，提高宿主抵御病原體的能力，有助于建立一個(gè)健康的腸道環(huán)境［27］。在本研究中，Candidatus_Arthromitus是正常小鼠腸道黏膜的優(yōu)勢(shì)菌屬，高脂飲食使其豐度降低，而鐵皮石斛多糖使其豐度回調(diào)，趨近于正常水平，說(shuō)明鐵皮石斛多糖有助于維持腸道黏膜中有益菌Candidatus_Arthromitus的數(shù)量，以發(fā)揮其免疫作用，保護(hù)機(jī)體。

短鏈脂肪酸在黏膜T調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)控中起決定作用，有助于腸道修復(fù)。在本研究中，擬桿菌門Bacteroidetes的相對(duì)豐度在鐵皮石斛多糖組小鼠腸道黏膜菌群中高于正常組及高脂飲食組，主要與Muribaculaceae及Bacteroides豐度的增加有關(guān)。Muribaculaceae是擬桿菌門的優(yōu)勢(shì)菌科，Bacteroides是擬桿菌門的重要菌屬，具有大量與碳水化合物代謝相關(guān)的基因，可編碼產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷水解酶和多糖裂解酶等酶以代謝碳水化合物，進(jìn)而為宿主提供重要的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等［28-29］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)許多天然多糖可顯著上調(diào)Muribaculaceae及Bacteroides的豐度［30-32］，一方面反映了機(jī)體對(duì)外源化合物的適應(yīng)性代謝，另一方面發(fā)酵碳水化合物后得到的代謝產(chǎn)物亦可參與免疫影響宿主健康。有學(xué)者認(rèn)為Muribaculaceae的豐度與丙酸有很強(qiáng)的相關(guān)性，因此可作為SCFAs濃度的預(yù)測(cè)因子［28］。此外，與高脂飲食組相比，丁酸產(chǎn)生菌Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度在鐵皮石斛多糖組小鼠腸黏膜中有顯著上升。丁酸可減少細(xì)菌易位，還可通過增加Caco-2單層細(xì)胞的跨上皮電阻（TEER）顯著提高改善腸道完整性［33］?？梢?，有益菌及短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的增殖，進(jìn)一步增加體內(nèi)短鏈脂肪酸的含量，提高免疫功能，可能是鐵皮石斛多糖改善腸黏膜屏障的機(jī)制之一。

4 結(jié)論

高脂飲食破壞了腸黏膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了炎癥及感染相關(guān)菌的增殖，加大了腸道感染的風(fēng)險(xiǎn)，而鐵皮石斛多糖可抑制有害菌的增殖，促進(jìn)有益菌及短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，并改善腸道屏障的完整性，對(duì)機(jī)體腸道具有保護(hù)作用。