牡丹根腐病原菌拮抗細(xì)菌抑菌活性物質(zhì)分析

楊瑞先 劉萍 王祖華 阮寶碩 汪智達(dá)

（洛陽理工學(xué)院環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471023）

牡丹根腐病又稱爛根病，是牡丹種植中的重要土傳病害。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病在牡丹多個(gè)種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，如在菏澤和洛陽主要觀賞區(qū)，根腐病的發(fā)病率一般在20%左右，嚴(yán)重地塊可達(dá)到40%以上［1］。該病主要為害牡丹根部，植株感病后，支根和須根變黑腐爛，并逐漸向主根擴(kuò)展，造成地上部分長(zhǎng)勢(shì)衰弱，葉片失綠、發(fā)黃，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)整株常因無法吸收水分和養(yǎng)分導(dǎo)致植株萎蔫直至枯死［2］。目前，研究認(rèn)為引起牡丹根腐病的病原菌主要為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani），但尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等在根腐病的發(fā)生和發(fā)展過程中，通常與腐皮鐮刀菌（F. solani）混合侵染，導(dǎo)致牡丹根腐病的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜［3-4］。

目前，在生產(chǎn)過程中主要采用農(nóng)業(yè)措施和化學(xué)防治的方法控制牡丹根腐病的發(fā)生［5-6］，雖取得了一定效果，但未從根本上解決根腐病的防治難題。牡丹根腐病防治過程中主要存在兩個(gè)困難：一是牡丹為多年生植物，若采用輪作和換土的方法，在實(shí)際生產(chǎn)中難以實(shí)施，且成本較大；二是化學(xué)防治的效果不理想，且易造成病原菌抗性增加和土壤中農(nóng)藥殘留，因此，急需探索根腐病防治的新途徑。生物防治作為一種安全有效的防治方法日益受到重視，尤其是利用選育的內(nèi)生拮抗菌株對(duì)植物病害進(jìn)行防治，可從根本上抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，控制植物連作條件下土傳根腐病病害的發(fā)生，且能夠有效避免化學(xué)農(nóng)藥帶來的防治缺點(diǎn)。

近年來，研究者采用4種商用生防菌劑MC -1（枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis制劑）、B130-1（巨大芽胞桿菌B. megaterium制劑）、BA31和 BXN（枯草芽胞桿菌B. subtilis制劑）進(jìn)行牡丹根腐病的防治，結(jié)果表明菌劑BA31和 BXN對(duì)牡丹根腐病的防治效果較好，其防效可達(dá)80%以上［7］。王雪山等［8］從牡丹根際土壤中分離獲得了7株對(duì)牡丹根腐病原菌具有平板拮抗作用的細(xì)菌菌株，其抑菌帶寬度在2-5 mm之間，為牡丹根腐病的生物防治提供了一些微生物資源。孟國慶等［9］從多年生牡丹發(fā)病植株根際土壤中獲得了兩株對(duì)牡丹根腐病原菌具有抑菌作用的菌株，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌。這些微生物在牡丹根腐病的生物防治中表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用潛力。

為進(jìn)一步拓展牡丹根腐病的生防菌資源，本研究從健康牡丹根部組織中進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離，通過前期篩選獲得了2株對(duì)牡丹根腐病菌具有拮抗作用的細(xì)菌，并將其鑒定為解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討2個(gè)菌株抑菌活性物質(zhì)的組成，并解析在抑菌作用過程中發(fā)揮主要生防作用的次生代謝產(chǎn)物，以期為牡丹根腐病的生物防治提供新的微生物資源，并為將來2個(gè)菌株在牡丹根腐病防治中的實(shí)際應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌：牡丹根腐病原菌（F. solani）由本課題組2019年4-5月間從洛陽牡丹國花園根腐病發(fā)病植株上分離、鑒定并保存的致病能力強(qiáng)的菌株。

1.1.2 供試內(nèi)生細(xì)菌：解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）md8和md9由本課題組 2019年9-10月間分離自洛陽理工學(xué)院牡丹種植地健康牡丹根部組織。

1.1.3 供試培養(yǎng)基：內(nèi)生細(xì)菌純化采用 TSA 培養(yǎng)基（胰蛋白胨3 g，植物蛋白胨1 g，氯化鈉1 g，瓊脂15 g，定容至1 L，pH7.2）；根腐病原菌的純化及平板抑菌作用采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 L，自然pH）；拮抗菌株脂肽類物質(zhì)的提取采用Landy 培養(yǎng)基［10］。

1.2 方法

1.2.1 拮抗牡丹根腐病原菌內(nèi)生細(xì)菌菌株的鑒定 根據(jù)菌落形態(tài)特征和16S rDNA基因序列鑒定具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株md8和md9，具體方法參考文獻(xiàn)［11］。

1.2.2 菌株md8和md9脂肽類化合物合成基因PCR 檢測(cè)分析 以菌株md8和md9的基因組DNA為模板，通過PCR 擴(kuò)增Fengycin 合成基因fenA，Surfactin 合成基因srfAA，Iturin 合成基因ituD，分別參考Koumoutsi和Hsieh文獻(xiàn)合成基因引物［12-13］，引物序列詳見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min、55℃退火1min、72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌株md8和md9 基因組中相關(guān)脂肽類化合物合成基因的擴(kuò)增情況。PCR產(chǎn)物切膠回收后，連接到載體pMD18-T 上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆測(cè)序。測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成，DNA測(cè)序后的產(chǎn)物序列利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Blast 程序進(jìn)行同源檢索，與GenBank 數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 脂肽類物質(zhì)合成基因片段引物序列Table 1 Primer sequence for lipopeptide biosynthesis genes fragments

1.2.3 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)的提取、凝膠層析分離及抑菌活性測(cè)定

1.2.3.1 脂肽類物質(zhì)的提取及凝膠層析分離 采用酸沉淀和甲醇抽提法提取菌株md8和md9的脂肽類粗提物，具體方法參考文獻(xiàn)［10］。將菌株md8和md9產(chǎn)生的脂肽類粗提物配制成合適濃度，利用Sephadex LH-20凝膠柱（1.6 cm×80 cm）進(jìn)行分離純化，上樣體積2 mL，洗脫溶劑為甲醇，流速為1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，每5 min收集1管，合并相關(guān)主要洗脫峰，用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行減壓蒸干，磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH=7.0）溶解備用。

1.2.3.2 脂肽類物質(zhì)及凝膠層析分離組分抑菌活性測(cè)定 采用牛津杯對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定菌株md8和md9脂肽類粗提物及凝膠層析分離組分對(duì)牡丹根腐病原菌的抑菌活性。具體方法為：取直徑5 mm根腐病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，將牛津杯插至距培養(yǎng)皿邊緣1.5 cm處，將150 μL過濾除菌的脂肽類粗提物及凝膠層析分離組分分別加入牛津杯中，每個(gè)處理重復(fù)3 次，對(duì)照只接種病原菌，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，測(cè)量抑菌帶的寬度。

1.2.4 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR分析

1.2.4.1 菌體收集 采用平板對(duì)峙法準(zhǔn)備用于熒光定量PCR分析的細(xì)菌樣品。具體方法為：在平板一側(cè)劃線接種拮抗細(xì)菌菌株，另一側(cè)接種直徑5 mm根腐病原菌菌餅，28℃倒置培養(yǎng)。分別收集對(duì)峙培養(yǎng)2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d的細(xì)菌菌體5 mg，以平板僅接種拮抗菌株的細(xì)菌菌體為對(duì)照，所有收集菌體均置于1.5 mL離心管中-80℃冷凍備用。每 10個(gè)平板作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。共采集 14 組樣品，分別包括菌株md8和md9 與根腐病原菌對(duì)峙培養(yǎng)后2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d的細(xì)菌樣品12組，以及在PDA平板上僅接種細(xì)菌菌株md8和md9，培養(yǎng)2 d后收集的菌體樣品2組。

1.2.4.2 菌體RNA的提取、質(zhì)量檢測(cè)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 按照OMEGA E.Z.N.A?Bacterial RNA Kit（Omega Bio-Tek公司）試劑盒說明書的使用方法提取細(xì)菌樣品RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)在260/280 nm處測(cè)定各樣品RNA的濃度和純度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（TaKaRa公司）試劑盒說明書的使用方法將細(xì)菌樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4.3 熒光定量PCR檢測(cè) 根據(jù)DNA 測(cè)序獲得的拮抗菌株脂肽類物質(zhì)合成基因序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，序列詳見表2，由上海生工生物工程股份有限公司合成。以細(xì)菌rpsJ基因（編碼細(xì)菌核糖體蛋白）作為內(nèi)參基因［14］，利用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，USA）對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：2×SYRBR Green Buffer 10 μL；引物（10 μmol /L）0.5 μL；cDNA模板 2μL；ddH2O 6.4 μL，總體積為20 μL。PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性30 s，95℃ 變性5 s，60℃ 退火30 s，循環(huán)40 次。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果Cq值采用 2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量［15］。

表2 脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for lipopeptide biosynthesis genes in RT-qPCR

1.2.5 基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定抑菌物質(zhì) 利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析菌株md8和md9凝膠層析分離組分中具有抑菌活性的物質(zhì)成分結(jié)構(gòu)。MALDITOF-MS 具體方法參照文獻(xiàn)［16］，使用337 nm 氮激光源解吸附和電離，采用α-氰-4-羥肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）為基質(zhì)，將具有抑菌作用的分離組份置于儀器離子源進(jìn)行測(cè)定，質(zhì)量掃描范圍為100 - 2 000 Da。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19 和Excel 2010 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌株md8和md9的鑒定

經(jīng)前期篩選，菌株md8和md9對(duì)牡丹根腐病原菌具有顯著的抑菌作用。利用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌株鑒定。形態(tài)結(jié)果表明菌株md8和md9的菌落均為白色，圓形，干燥，邊緣不規(guī)則，環(huán)狀凸起，革蘭氏染色均為陽性，菌體均為桿狀（圖1）。菌株md8和md9的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為1 446 bp和1 438 bp，其在 GenBank中的登錄號(hào)分別為MT233097和MT233098，利用NCBI中的BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明菌株md8和md9與解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）序列相似度高達(dá)99%，選取與其序列相似性較高的模式菌株，通過MEGA 7.0軟件中的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，菌株md8和md9與解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）聚在同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA基因分子生物學(xué)鑒定，將菌株md8和md9鑒定為解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）。

圖1 拮抗菌株md8和md9菌落和菌體形態(tài)特征（10×100）Fig.1 Colonies and morphological characteristics of antagonistic strain md8 and md9（10×100）

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的拮抗細(xì)菌md8和md9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of antagonistic strain md8 and md9 based on 16 S rDNA sequences

2.2 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因分析

利用3對(duì)引物對(duì)拮抗菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明拮抗菌株md8和md9均能夠擴(kuò)增獲得ituD、fenA和srfkAA基因片段，其片段大小分別約為1 300 bp、1 500 bp和1 500 bp（圖3）。將擴(kuò)增獲得的特異條帶回收純化，克隆測(cè)序，分別獲得菌株md8和md9的3個(gè)脂肽類物質(zhì)合成基因片段序列。Blastn 比對(duì)結(jié)果表明，菌株md8的合成基因組中ituD基因片段（1 312bp）與B. amyloliquefaciensUMAF6639（CP006058）序列同源性達(dá)到99%，fenA基因片段（1 559 bp）與B.amyloliquefaciensB15（CP014783）同源性達(dá)到99%，srfAA基因片段（1 632 bp）與B. amyloliquefaciensMBE1283（CP013727）同源性達(dá)到98%；菌株md9的合成基因組中ituD基因片段（1 328 bp）與B. amyloliquefacienssubsp.plantarumCAUB946（HE617159）序列同源性達(dá)到99%，fenA基因片段（1 555 bp） 與B. amyloliquefaciensY2（CP003332）同源性達(dá)到99%，srfAA基因片段（1 640 bp）與B.amyloliquefaciensLFB112（CP006952）同源性達(dá)到99%。利用 Blastx 將獲得的基因片段序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中非冗余蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株md8和md9的fenA、srfAA、ituD基因片段序列分別與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）非核糖體物質(zhì)芬薺素合成酶蛋白序列、表面活性素合成酶蛋白序列、伊枯草菌素類桿菌霉素D合成酶蛋白序列相似性達(dá)到99%，說明利用特異引物所擴(kuò)增獲得的基因片段為相應(yīng)的非核糖體物質(zhì)類脂肽類物質(zhì)合成基因序列，表明菌株 md8和md9具有合成脂肽類抑菌物質(zhì)的能力。

圖3 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因片段PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplified lipopeptide biosynthesis gene fragments of strain md8 and md9

2.3 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR分析

平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同培養(yǎng)時(shí)間菌株md8和md9對(duì)牡丹根腐病原菌的抑菌作用有所變化，對(duì)峙培養(yǎng)后的5-7 d抑菌作用相對(duì)穩(wěn)定（圖4）。利用RNA提取試劑盒提取處理樣品和對(duì)照樣品的RNA，結(jié)果顯示所有樣品RNA提取質(zhì)量較好，OD260/280均在 1.9-2.1 之間，能夠有效滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所有細(xì)菌樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)利用引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。結(jié)果表明菌株md8和md9的ituD、fenA和srfAA合成基因在與牡丹根腐病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)過程中其相對(duì)表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化（圖5和6）。與對(duì)照表達(dá)量相比，菌株md8芬薺素（fenA）和伊枯草菌素（ituD）合成基因在對(duì)峙培養(yǎng)6 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到高峰，分別是對(duì)照的3.8倍和6.1倍，表面活性素合成基因（srfAA）的表達(dá)量在整個(gè)對(duì)峙培養(yǎng)過程中相對(duì)穩(wěn)定，僅為對(duì)照的2-3倍。菌株md9fenA和ituD合成基因表達(dá)量在對(duì)峙培養(yǎng)5 d時(shí)達(dá)到高峰，分別是對(duì)照的4.6倍和7.8倍，srfAA的表達(dá)量在整個(gè)對(duì)峙培養(yǎng)過程中相對(duì)穩(wěn)定，也僅為對(duì)照的2-3倍。熒光定量PCR結(jié)果表明，菌株md8和md9ituD合成基因在與根腐病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)過程中被誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于對(duì)照基因的表達(dá)量，推測(cè)菌株md8和md9合成的伊枯草菌素類物質(zhì)可能在牡丹根腐病原菌平板抑制過程中發(fā)揮主要抑菌作用，同時(shí)fenA合成基因也被誘導(dǎo)表達(dá)，表明芬薺素類物質(zhì)對(duì)牡丹根腐病原菌也具有一定的抑制作用。

圖4 菌株md8和md9對(duì)牡丹根腐原菌的平板抑制作用（平板對(duì)峙培養(yǎng)6 d）Fig.4 Inhibitory effect of strain md8 and md9 inhibiting F. solani on the plate（plate confrontation cultured 6 d）

圖5 菌株md8脂肽類物質(zhì)合成基因在抑制牡丹根腐病原菌時(shí)的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expressions of the lipopeptide biosynthesis genes of strain md8 inhibiting F. solani on the plate

2.4 菌株md8和md9脂肽類粗提物及凝膠層析組分的抑菌活性

菌株md8和md9脂肽類粗提物對(duì)牡丹根腐病原菌具有明顯的平板抑制作用，其抑菌帶寬度均可達(dá)到10 mm（圖7-A）。兩個(gè)菌株的脂肽類粗提物利用Sephadex LH-20凝膠層析柱層析分離，結(jié)合時(shí)間和220 nm處的吸光度收集分離組分，菌株md8共收集到10個(gè)分離組分，分別命名為A1-A10，菌株md9共收集12個(gè)分離組分，分別命名為B1-B12。牛津杯對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定不同收集組分的抑菌活性，結(jié)果表明，菌株md8 層析分離組分A4和A5對(duì)牡丹根腐病原菌具有明顯的抑菌作用，其抑菌帶寬度分別為5.2 mm和3.1 mm（圖7-B），菌株md9 的3個(gè)分離組分B2、B3和B4對(duì)牡丹根腐病原菌具有不同程度的抑菌作用，其抑菌帶寬度分別為1.3 mm、6.2 mm和5.4 mm（圖7-C），其中組份B3對(duì)牡丹根腐病原菌的抑菌效果最為顯著，推測(cè)其為菌株md9抑制根腐病原菌的主要活性物質(zhì)。

圖7 菌株md8和md9脂肽類粗提物和凝膠層析分離組分對(duì)牡丹根腐病原菌的平板抑制作用Fig.7 Inhibition effect of lipopeptide extract and separation components via gel chromatography of strain md8 and md9 inhibiting F. solani

2.5 菌株md8和md9具抑菌活性分離組分的MALDI-TOF-MS分析

為進(jìn)一步明晰菌株md8和md9對(duì)根腐病原菌具有抑菌作用的凝膠層析分離組分的物質(zhì)種類，利用 MALDI-TOF-MS分析具有抑菌活性的凝膠層析分離組分。菌株md8凝膠層析組分A4和A5 MALDITOF-MS分析結(jié)果表明（圖8），其中組分A4質(zhì)子化峰值m/z=1 031和1 045，其中1 031和1 045差一個(gè)亞甲基（-CH2），推測(cè)這種化合物為脂肪酸鏈相差一個(gè)亞甲基（-CH2）的同系物，與C14-C15的Bacillomycins D［M+H］+加 合 峰 相 對(duì) 應(yīng)，同時(shí)在組分A4中含有m/z=1 081的離子峰，與C16 Bacillomycins D的［M+Na］+加合峰相吻合，由已知文獻(xiàn)確定，菌株md8的組分A4主要為C14 Bacillomycins D［17］。組份A5的質(zhì)譜顯示在m/z=1 058、1 072和1 086處出現(xiàn)3個(gè)離子峰，其中1 058和1 072差一個(gè)亞甲基（-CH2），1 072和10 86之間差一個(gè)亞甲基（-CH2），表明它們?yōu)橥滴?，與屬于C15-C17 的Iturin B［M+H］+加合峰相對(duì)應(yīng)，同時(shí)在組分A5中含有m/z=1 096的離子峰，其響應(yīng)量相對(duì)較弱，與C15 Iturin B［M+K］+加合峰相吻合，由已知文獻(xiàn)確定，菌株md8的組分A5主要為C15 Iturin B［17］。菌株md9對(duì)根腐病原菌具有抑制作用的3個(gè)組分B2、B3和B4經(jīng) MALDI-TOF-MS分析（圖9），組分B2的質(zhì)譜顯示在m/z=1 519和1 533處出現(xiàn)離子峰，對(duì)應(yīng)于C20-C21 Fengycin A［M+H］+加合峰，由已知文獻(xiàn)確定，組分B2的主要物質(zhì)為Fengycin A［18］；組分B3的質(zhì)譜顯示在m/z=1 072和1 086出現(xiàn)二個(gè)離子峰，對(duì)應(yīng)于C15 Iturin B的質(zhì)核比，同時(shí)在B3組分中含有m/z=1 083的離子峰，其響應(yīng)量也相對(duì)較強(qiáng)，與C15 Bacillomycins D的［M+K］+加合峰相吻合，表明B3組分中可能含有C15 Iturin B和C15 Bacillomycins D兩種物質(zhì)；組分B4的質(zhì)譜顯示在m/z=1 058和1 086處出現(xiàn)2個(gè)離子峰，推測(cè)菌株md9組分B4的主要物質(zhì)種類為C15 Iturin B。

圖8 菌株md8凝膠層析分離組分A4（A）和A5（B）的MALDI-TOF-MS分析Fig.8 MALDI-TOF-MS analysis of separation component A4（A）and A5（B）produced by the strain md8

圖9 菌株md9凝膠層析組分B2（A）、B3（B）和B4（C）的MALDI-TOF-MS分析Fig.9 MALDI-TOF-MS analysis of separation component B2（A），B3（B）and B4（C）produced by the strain md9

3 討論

牡丹根腐病是嚴(yán)重影響牡丹栽培管理的一種土傳病害，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病原菌難以清除，目前尚無有效的防治方法。本研究對(duì)內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）md8和md9抑制牡丹根腐病原菌的活性物質(zhì)成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明菌株md8和md9合成的伊枯草菌素類物質(zhì)為抑制牡丹根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)的主要活性物質(zhì)。目前研究表明，解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）產(chǎn)生的脂肽類化合物是其發(fā)揮生防作用的主要抗菌物質(zhì)，主要包含表面活性素（surfactins）、伊枯草素（iturins）和芬薺素（fengycins）三大類群［19-20］。其中伊枯草菌素（iturins）分子量約為1 000 Da，家族成員包括Iturins A、B、C、D，桿菌霉素Bacillomycins D、F、L等，Bacillomycin D 是Iturin家族的一類抗菌脂肽，它與Iturin 結(jié)構(gòu)相似，其氨基酸組成不同［21］。芬薺素（fengycins）分子量約為1 500 Da，家族成員主要包括Fengycins A和B，伊枯草菌素和芬薺素均具有強(qiáng)烈抑制真菌生長(zhǎng)的能力，尤其對(duì)絲狀真菌抑制作用更加明顯［22］。桑建偉等［16］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）BEB17對(duì)香蕉枯萎病菌（F. oxysporumf.sp.cubense）起主要抑制作用的物質(zhì)為芬薺素和伊枯草菌素；向亞萍等［23］研究發(fā)現(xiàn)桿菌霉素和芬薺素在菌株B1619 抑制番茄枯萎病菌（F. oxysporumf.sp.lycopersici）中起到相當(dāng)重要的作用；楊洋［24］研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）FZB42產(chǎn)出的桿菌霉素D和芬薺素是抑制禾谷鐮孢菌（F. graminearum）生長(zhǎng)的主要活性物質(zhì)，尤其是桿菌霉素D的抑菌效果最為顯著。牡丹根腐病原菌屬于鐮刀菌屬（Fusarium）真菌，與香蕉枯萎病菌、番茄枯萎病菌和禾谷鐮孢菌為同屬病原菌，本研究表明菌株md8和md9抑制根腐病原菌生長(zhǎng)的主要抑菌活性物質(zhì)為Iturin B、Bacillomycin D和Fengycins A，其中Iturin B和Bacillomycin D抑菌作用較為顯著，F(xiàn)engycins A抑菌作用相對(duì)較弱，表明伊枯草菌素類物質(zhì)在牡丹根腐病原菌生長(zhǎng)過程中發(fā)揮主要的抑制作用，這與前人的研究結(jié)果是一致的。后期可進(jìn)行菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，進(jìn)一步純化獲取 Iturin B和Bacillomycin D物質(zhì)，以為牡丹根腐病原菌的防治提供良好的生防菌劑。

圖6 菌株md9脂肽類物質(zhì)合成基因在抑制牡丹根腐病原菌時(shí)的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expressions of the lipopeptide biosynthesis genes of strain md9 inhibiting F. solani on the plate

解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽化合物結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)可對(duì)抗菌物質(zhì)的編碼調(diào)控基因進(jìn)行檢測(cè)，從而初步判斷菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力和種類［25-26］。本研究PCR檢測(cè)結(jié)果表明菌株md8和md9含有3種脂肽類物質(zhì)的合成基因，MALDI-TOF-MS分析結(jié)果表明兩個(gè)菌株的抑菌活性物質(zhì)中確實(shí)含有脂肽類物質(zhì)，表明PCR檢測(cè)技術(shù)可以快速識(shí)別、篩選抗菌脂肽的產(chǎn)生菌，同時(shí)也可初步判斷菌株產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)的種類，也再次證實(shí)基因檢測(cè)方法在抗菌脂肽產(chǎn)生菌鑒定方面具有較強(qiáng)的可行性。本研究中同時(shí)獲得了菌株md8和md9對(duì)根腐病原菌具有顯著抑制作用的物質(zhì)Iturin B，但由于前期未設(shè)計(jì)檢測(cè)Iturin B的編碼調(diào)控基因，因此建議在利用基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行抗菌脂肽產(chǎn)生菌的篩選時(shí)，應(yīng)盡可能全面的對(duì)脂肽類類物質(zhì)的編碼調(diào)控基因進(jìn)行檢測(cè)，以更準(zhǔn)確的判斷菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的種類，同時(shí)也可判斷菌株是否能夠產(chǎn)生新穎的抗菌物質(zhì)。

Li等［27］研 究 了B.amyloliquefaciensSQR9四個(gè)脂肽類合成物質(zhì)編碼基因（fenA、bmyD、srfAA、dhbA）與6種土傳病原真菌平板對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)相對(duì)表達(dá)量的變化，結(jié)果表明在與腐皮鐮刀菌（F. solani）和尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，fenA、bmyD和srfAA基因均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。Sajitha等［28-29］研 究 了 菌 株B. subtilisB1與Lasiodiplodia theobromae平板對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)fenB和srfAA脂肽類物質(zhì)合成編碼基因表達(dá)量的變化，表明fenB基因在對(duì)峙培養(yǎng)4 d時(shí)其表達(dá)量顯著增加，srfAA基因在細(xì)菌與病原真菌共培養(yǎng)的整個(gè)過程中表現(xiàn)出一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)量。這些研究結(jié)果均表明生防細(xì)菌在與病原真菌共培養(yǎng)條件下，能夠激活一些抗菌物質(zhì)合成基因的表達(dá)，產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)，從而為細(xì)菌獲得有效的生存條件。本研究中菌株md8和md9在與腐皮鐮刀菌（F. solani）共培養(yǎng)條件下，其ituD和fenA基因均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，同時(shí)srfAA基因的表達(dá)量在共培養(yǎng)前期也顯著增加，表明srfAA基因編碼的表面活性素物質(zhì)在菌株md8和md9抑制牡丹根腐病原菌的過程中具有協(xié)同增效作用，結(jié)合MALDI-TOFMS分析結(jié)果，再次驗(yàn)證了ituD基因編碼合成的物質(zhì)Bacillomycin D為菌株發(fā)揮抑菌作用的主要物質(zhì)種類。但其抑菌活性物質(zhì)如Iturin B、Bacillomycin D和Fengycins A對(duì)牡丹根腐病原菌的抑菌作用機(jī)制需進(jìn)一步研究，同時(shí)為何表面活性素物質(zhì)編碼基因srfAA在細(xì)菌與真菌共培養(yǎng)的前期表達(dá)量相對(duì)較高，以及菌株md8和md9抑菌活性物質(zhì)成分Iturin B物質(zhì)編碼基因ituB是否也能夠被高效誘導(dǎo)表達(dá)均需做進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)。

4 結(jié)論

菌株md8和md9伊枯草菌素（iturin）的合成基因ituD在與牡丹根腐病原菌對(duì)峙培養(yǎng)過程中相對(duì)表達(dá)量顯著增加。MALDI-TOF-MS分析表明2個(gè)菌株中具有抑菌作用的組分主要為伊枯草菌素類物質(zhì)Iturin B和Bacillomycins D，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，推測(cè)菌株md8和md9在拮抗根腐病原菌過程中發(fā)揮主要生防作用的物質(zhì)為伊枯草菌素（iturin）。