擬南芥RPP1A參與幼苗生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

李兵娟 鄭璐 沈仁芳 蘭平

（1. 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

核糖體是生命細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。真核細(xì)胞中的核糖體主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)核糖體由一個(gè)60S大亞基和一個(gè)40S小亞基共同構(gòu)成，包含79-81種核糖體蛋白（ribosomal proteins，RPs）和4種核糖體RNA（ribosomal RNAs，rRNAs）［1-2］。植物RPs由多拷貝基因編碼，同一種RP可能存在2個(gè)或2個(gè)以上同家族基因編碼。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中81種RPs由254個(gè)基因編碼，大部分RPs有3個(gè)或4個(gè)編碼基因，同一家族的RPs的氨基酸相似度高達(dá)65%-100%［3-5］。擬南芥中RPs同一家族不同成員在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同組織和不同亞細(xì)胞中具有表達(dá)差異［6］。各種環(huán)境刺激下，大部分RPs的轉(zhuǎn)錄水平保持穩(wěn)定，但也有部分RPs在表達(dá)水平發(fā)生了顯著的變化［7］。說明RPs不僅參與蛋白質(zhì)的合成，而且具有調(diào)控功能。解析植物RPs所具有的蛋白質(zhì)合成以外的功能對(duì)于揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

擬南芥RPs基因缺失突變體會(huì)表現(xiàn)出異常的生長(zhǎng)發(fā)育表型，包括葉片形態(tài)和種子發(fā)育等［8-10］。研究表明，擬南芥rpl7b和rps6a突變體的葉片與野生型相比更小、更窄，葉片軸面和極性異常［8］。擬南芥RPL27aC突變影響地上部發(fā)育，葉片形態(tài)、花序和花分生組織功能以及種子結(jié)實(shí)異常［11］。rpl18aB突變體花粉在花柱中生長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力明顯減弱，胚胎在早期顯示出不規(guī)則的細(xì)胞分裂方向，并在球形期停滯［12］。擬南芥RPL10A不僅在萌發(fā)和早期發(fā)育中發(fā)揮作用，而且還是依賴脫落酸響應(yīng)的正調(diào)節(jié)劑［13-14］。這些突變體的表型及其作用機(jī)制研究表明RPs在生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用。

不同RPs基因突變產(chǎn)生的表型各不相同，這可能是不同核糖體基因存在時(shí)空表達(dá)差異或者一些RPs同時(shí)具有核糖體以外的功能所導(dǎo)致。與動(dòng)物RPs不同，植物中RPs存在龐大的同家族蛋白，且高度異質(zhì)性，大大增加了功能研究的難度［3］。目前，只有少數(shù)擬南芥RPs所具有的核糖體以外的功能被報(bào)道，大部分RPs的調(diào)控功能還不清楚。為深入解析RPs的調(diào)控功能，有必要對(duì)RPs基因突變體的表型及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行解析。

核糖體磷酸蛋白P1（ribosomal phosphoprotein P1，RPP1）是酸性磷酸蛋白，該家族有3個(gè)同源基因，RPP1A、RPP1B和RPP1C［3］。前期研究表明，擬南芥根系RPP1A和RPP1C的表達(dá)量在缺鐵脅迫下顯著下降［7］。然而關(guān)于RPP1家族蛋白核糖體以外的功能還不清楚。隨著高分辨率質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)在植物各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，可以全面快速地分析不同樣品間的蛋白質(zhì)水平的差異，揭示可能的生物學(xué)機(jī)制［15］。

本研究利用rpp1a突變體解析其對(duì)植株生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)組學(xué)闡述RPP1A缺乏對(duì)幼苗蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，揭示其參與調(diào)控幼苗生長(zhǎng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）T-DNA插入純合 突 變 體，rpp1a-1（SAIL_210_H01）和rpp1a-2（SALK_206736C），種子購(gòu)自TAIR庫(kù)（https://www.arabidopsis.org/）。rpp1a-1突變體的T-DNA插入位于啟動(dòng)子區(qū)域；rpp1a-2的插入位點(diǎn)在蛋白質(zhì)編碼區(qū)。突變體經(jīng)純合鑒定后用于試驗(yàn)。擬南芥生態(tài)型（Columia-0）作為野生型（WT），由本實(shí)驗(yàn)室保存。

首先用75%乙醇將擬南芥種子表面消毒3 min，再置于0.5%（V/V）次氯酸鈉溶液（含0.5%的吐溫20）中震蕩洗滌10 min，最后用滅菌蒸餾水洗滌5遍。種子點(diǎn)播到Estelle和Somerville（ES）固體培養(yǎng)基上［16］，密封后置于4℃低溫避光春化2 d，在光照箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d后取樣。光照箱溫度為22℃恒溫，光照強(qiáng)度為60 μmol/（m2·s），光照16 h，黑暗8 h。

1.2 方法

1.2.1 植株的表型觀測(cè) 在同一固體ES培養(yǎng)基上，劃分區(qū)域均勻點(diǎn)播野生型WT和rpp1a-1和rpp1a-2突變體的種子，每種材料設(shè)置5個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)14 d后測(cè)定鮮重、葉片總表面積和葉柄長(zhǎng)度。隨機(jī)選?。?5株擬南芥植株作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用萬分之一的天平稱量鮮重。拍照記錄葉片表型，用Image J軟件對(duì)葉片總表面積和葉柄長(zhǎng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.2 蛋白質(zhì)的提取和定量分析 選取光照培養(yǎng)14d的野生型WT和rpp1a-2突變體的幼苗樣品，提取總蛋白，具體方法參照Lan等［17］方法?？偟鞍追勰┍先芙庥赟DT溶液［2%（W/V）SDS、0.1 mol/L二硫蘇糖醇、0.1 mol/L Tris-HCl和1 mmol/L苯甲基磺酰氟，pH7.6］，離心（10 000 r/min，5 min）取上清液備用。使用酶標(biāo)儀（Cytation5 imaging reader，BioTek）按照色氨酸熒光法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，激發(fā)光波長(zhǎng)為295 nm，熒光波長(zhǎng)為350 nm。

1.2.3 蛋白質(zhì)酶解和肽段脫鹽 蛋白質(zhì)酶解采用基于超濾輔助樣品制備（filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP）方法［18］。蛋白質(zhì)溶液（50 μg蛋白質(zhì)）置于超濾管（10 K）中用尿素替換后進(jìn)行還原烷基化，最后用100 μL的NH4HCO3溶液（50 mmol/L）重懸。按照1:50的質(zhì)量比加入胰蛋白酶溶液（Promega），加入1 μL的100 mmol/L CaCl2溶液輕輕渦旋后，37℃反應(yīng)過夜。次日，12 000 r/min離心20 min，再用50 μL的NH4HCO3溶液洗脫2次，最后加入10%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）至終濃度為0.4%終止酶解反應(yīng)。

使用多肽脫鹽柱對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽［19］。脫鹽柱活化洗滌后，酶解產(chǎn)物用緩沖液（64%乙腈和0.2%TFA）稀釋至200 μL加入到脫鹽柱中脫鹽，1 000 r/min離心30 s，濾液再重新加到脫鹽柱離心收集濾液，重復(fù)1次，合并收集的肽段濾液，濃縮干燥，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 nano-LC-ESI-MS/MS檢測(cè)和非標(biāo)記（labelfree）定量分析 使用納升液相色譜-電噴霧-串聯(lián) 質(zhì) 譜（nano liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，nano LC-ESIMS/MS）系統(tǒng)對(duì)肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，具體方法參照Yan等［19］方法。肽段樣品復(fù)溶于20 μL的0.1%甲酸中，nano液相色譜系統(tǒng)（DIONEX UltiMate 3000RSLC，Thermo Fisher Scientific）中 采 用C18分 析柱（Acclaim PepMapTM100，100 μm×2 cm，Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行分離。A相為0.1%甲酸的水溶液，B相為0.1%甲酸的乙腈溶液，參照Yan等［19］方法設(shè)置B相梯度。肽段經(jīng)液相分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀（Orbitrap Fusion Lumos，Thermo Scientific）進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜儀采用正離子檢測(cè)模式，母離子全掃描范圍為350-1 700m/z，一級(jí)質(zhì)譜的分辨率為60 000，二級(jí)質(zhì)譜的光譜掃描的分辨率為15 000，每次質(zhì)譜掃描中選取20個(gè)最豐富的母離子進(jìn)行高能碰撞解離碎裂用于二級(jí)質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析采用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)鑒定和差異蛋白的篩選 采用Proteome Discoverer軟 件（Thermo Fisher Scientific，2.3）對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行查庫(kù)和定量分析。參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為Araport11蛋白序列數(shù)據(jù)［20］，同時(shí)檢索原始數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)化序列構(gòu)成的誘餌數(shù)據(jù)庫(kù)（decoy database）進(jìn)行質(zhì)量控制。參數(shù)設(shè)置如下：蛋白質(zhì)水解酶為胰蛋白酶，且允許最多有兩個(gè)位點(diǎn)的漏切，固定修飾為半胱氨酸的氨基甲酰甲基化（carbamidomethylation），可變修飾為甲硫氨酸的氧化修飾（oxidation），母離子質(zhì)量偏差設(shè)為10 ppm，子離子的質(zhì)量偏差設(shè)為0.02 Da。

高可信度蛋白質(zhì)（high confidence protein）的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：蛋白質(zhì)組（master proteins）的蛋白質(zhì)可信度＞99%，肽段可信度＞95%，且至少包含一個(gè)標(biāo)記為“High”，蛋白質(zhì)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01。獲得的高可信度蛋白用于后續(xù)label-free定量分析，表達(dá)倍數(shù)（FC）≥1.5或≤0.667，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P＜0.05認(rèn)為是差異表達(dá)蛋白質(zhì)（differentially expressed proteins，DEPs）。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 DEPs的基因GO的注釋和富集分析使用在線工具agriGO［21］（http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/），閾 值 為FDR＜0.05。采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代 謝 通路數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEPs的代謝通路進(jìn)行注釋，富集使用Metascapes［22］，閾值為P＜0.05。蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)檢索利用數(shù)據(jù)庫(kù)String（https://www.string-db.org/）獲得，通過Cytoscape進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 擬南芥RPP1A缺失突變體的幼苗表型分析

擬南芥野生型WT（Col-0）和rpp1a-1和rpp1a-2突變體共同種植在ES培養(yǎng)基固體平板上，進(jìn)行表型比較（圖1）。與WT相比，rpp1a-1和rpp1a-2突變體幼苗鮮重極顯著增加了51%以上（圖1-B）。相一致地，rpp1a-1和rpp1a-2突變體的葉片總表面積也極顯著增加了48%和52%（圖1-C和圖1-D）。突變體葉柄長(zhǎng)度的增加更為顯著，都增加約62%（圖1-E）。土培條件下，rpp1a-1和rpp1a-2突變體在生長(zhǎng)后期（21 d）地上部生物量與WT相比也增加，但不顯著。這表明RPP1A缺失導(dǎo)致擬南芥幼苗生物量增加。

圖1 擬南芥WT和rpp1a-1和rpp1a-2突變體幼苗表型Fig. 1 Seedling phenotypes of Arabidopsis thaliana WT and rpp1a-1 and rpp1a-2 mutants

2.2 蛋白質(zhì)鑒定和差異蛋白質(zhì)的篩選

提取生長(zhǎng)14 d的野生型和rpp1a-2突變體幼苗總蛋白，共鑒定獲得高可信度蛋白質(zhì)4 180個(gè)，其中WT和rpp1a-2分別鑒定獲得4 037個(gè)和4 102個(gè)蛋白質(zhì)（圖2）。絕大部分蛋白質(zhì)（3 959個(gè)，94.7%）是WT和rpp1a-2所共有。

圖2 WT和rpp1a-2突變體幼苗總蛋白質(zhì)的韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of the total proteins detected in the seedlings of WT and rpp1a-2 mutant

與WT相比，rpp1a-2突變體中有280個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量具有顯著差異，差異蛋白占總蛋白質(zhì)數(shù)量的6.70%。如圖3所示，差異蛋白中有98個(gè)蛋白質(zhì)（35%）表達(dá)量顯著上調(diào)（FC≥1.5，且P＜0.05），182個(gè)蛋白質(zhì)（65%）表達(dá)量顯著下調(diào)（FC≤0.667，且P＜0.05），下調(diào)蛋白所占比例更大。rpp1a-2突變體雖然在表型上生物量更大，但是很多蛋白質(zhì)的表達(dá)量反而下降。RPP1A只在WT中檢測(cè)到，而在rpp1a-2突變體中沒有檢測(cè)到該蛋白質(zhì)，表明該突變體的確在蛋白質(zhì)水平功能缺失。而RPP1A的同源基因RPP1B和RPP1C在rpp1a-2突變體中的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度分別增加了24%和15%，但無顯著性差異。

圖3 WT和rpp1a-2突變體幼苗差異蛋白質(zhì)的火山圖Fig. 3 Volcano plot of differentially expressed proteins identified in the WT and rpp1a-2 mutant seedlings

2.3 差異蛋白的GO功能注釋和富集分析

為進(jìn)一步解析RPP1A缺失的影響，對(duì)WT和rpp1a-2突變體的DEPs進(jìn)行GO功能注釋和富集（圖4）。差異蛋白質(zhì)涉及23個(gè)生物學(xué)過程（biological process），主要富集在細(xì)胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、刺激反應(yīng)（response to stimulus）、脅迫響應(yīng)（response to stress）、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生（cellular component organization or biogenesis）和氧化還原過程（oxidation-reduction process）等生物學(xué)過程。差異蛋白的分子功能（molecular function）主要為結(jié)合（binding）和催化活性（catalytic activity）。此外，在蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、離子結(jié)合（ion binding）、poly（A）RNA結(jié)合（poly（A）RNA binding）和電子載體活性（electron carrier activity）等分子功能上也顯著富集。差異蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)部分（cytoplasmic part），同時(shí)在膜（membrane）、細(xì)胞器部分（organelle part）和葉綠體（chloroplast）等細(xì)胞組分上也顯著富集。

圖4 WT和rpp1a-2突變體幼苗差異蛋白的GO富集分析Fig. 4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins identified in the WT and rpp1a-2 mutant seedlings

2.4 差異蛋白的KEGG富集分析

進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，以解析其參與的代謝通路。結(jié)果顯示，差異蛋白顯著富集到糖體（ath03010）、光合作用（ath00195）、mRNA檢測(cè)途徑（ath03015）、RNA降解（ath03018）、苯丙素的生物合成（ath00940）的代謝通路（表1和圖5）。其中，差異蛋白在核糖體途徑富集最為顯著。核糖體途徑中有12個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中大部分（10個(gè)，83%）核糖體蛋白在rpp1a-2突變體中的表達(dá)量顯著下調(diào)，只有2個(gè)核糖體蛋白（RPS9M和RPS25B）的表達(dá)量在突變體中顯著上調(diào)（表1）。除了RPS9M是線粒體核糖蛋白，其他差異表達(dá)的RPs均是細(xì)胞質(zhì)核糖體蛋白，且一半差異蛋白（6個(gè)）位于小亞基上。光合系統(tǒng)途經(jīng)中富集到5個(gè)差異蛋白，其中2個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào)。鐵氧還原蛋白1（ferredoxin 1，F(xiàn)D1）只在WT中表達(dá)，而在rpp1a-2突變體中幾乎檢測(cè)不到。mRNA監(jiān)視通路中有2個(gè)蛋白質(zhì)的豐度顯著上調(diào)，4個(gè)蛋白質(zhì)的豐度顯著下調(diào)。苯丙素的生物合成中大部分差異蛋白在突變體中顯著下調(diào)，包括過氧化物酶（peroxidase）和2個(gè)β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。RNA降解途徑中除了磷酸果糖激酶4（phosphofructokinase 4），其他4個(gè)差異蛋白的表達(dá)量在rpp1a-2突變體中均顯著下調(diào)。

圖5 WT和rpp1a-2突變體幼苗差異蛋白的KEGG富集分析Fig. 5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins identified in the WT and rpp1a-2 mutant seedlings

表1 顯著富集的KEGG通路中的差異表達(dá)蛋白Table 1 Differentially expressed proteins in the significantly enriched KEGG pathways

續(xù)表 Continued

2.5 差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

基于280個(gè)差異蛋白通過String在線軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，隱藏沒有相互作用的蛋白質(zhì)點(diǎn)，得到100個(gè)相互作用的差異蛋白，共存在270種互作關(guān)系（P=0.005 24）（圖6）。其中，最大的互作模塊包括67個(gè)差異蛋白。在互作網(wǎng)絡(luò)中，與核糖體蛋白R(shí)PL7Ae（AT4G12600）互作的蛋白質(zhì)最多，達(dá)到25個(gè)。這些互作蛋白不僅包括在rpp1a-2突變體中表達(dá)量顯著下調(diào)的核糖體蛋白（RPL31e、RPS15AD、RPS7e、RPS15等），還包括一些表達(dá)量顯著上調(diào)的RNA結(jié)合相關(guān)的蛋白質(zhì)RNA解旋酶家族蛋白（RNA helicase family protein，AT2G47250）和rRNA加 工因子PUMILIO PROTEIN 24（PUM24，AT3G16810）。同時(shí)，其他一些核糖體蛋白的的互作蛋白也比較多，例如，RPS16C（AT5G18380）有19個(gè)互作蛋白，RPS25B（AT2G21580）和RPS7C（AT5G16130）有17個(gè)互作蛋白，RPP1A（AT1G01100）、RPL31A（AT2G19740）、RPL34C（AT3G28900）和RPL13D（AT5G23900）有16個(gè)互作蛋白。除了核糖體蛋白，還有一些其他代謝途徑中的蛋白質(zhì)也在這個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中。mRNA監(jiān)視通路中MAGO（mago nashi family protein，MAGO）家族蛋白質(zhì)、SR蛋白（arginine/serine-rich 45，SR45）、RNA解旋酶（RNA helicase，LBA1）和蛋白磷酸酶2A亞基A3（protein phosphatase 2A subunit A3，PP2AA3）存在14-19個(gè)互作蛋白。此外，脅迫響應(yīng)的蛋白質(zhì)熱休克蛋白81.4（heat shock protein 81.4，HSP81.4）和冷休克結(jié)構(gòu)域蛋白1（cold shock domain protein 1，CSDP1）、冷休克結(jié)構(gòu)域蛋白（glycine-rich protein，GRP2B）也存在于互作網(wǎng)絡(luò)。表明rpp1a-2突變體可能通過與其他核糖體蛋白、RNA結(jié)合相關(guān)的蛋白質(zhì)、mRNA監(jiān)視通路和脅迫響應(yīng)的蛋白質(zhì)的互相作用，進(jìn)而調(diào)控植株的生長(zhǎng)。

圖6 差異蛋白的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 Protein-protein interaction network of differentially expressed proteins

3 討論

核糖體作為細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)器，除了翻譯功能外，往往還具有核糖體以外的功能，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［7-9，23］。研究表明，很多RPs基因突變會(huì)引起一些常見甚至罕見的個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育缺陷表型［8，11，24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)RPP1A缺失導(dǎo)致幼苗生物量顯著增加，其中，葉片面積和葉柄長(zhǎng)度增加尤為顯著。為了進(jìn)一步揭示其中的作用機(jī)制，采用基于label-free的蛋白質(zhì)組學(xué)分析了WT和rpp1a-2突變體在蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。本研究一共檢測(cè)到280個(gè)差異蛋白，分別有98個(gè)和182個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著上調(diào)或下調(diào)。差異蛋白主要參與細(xì)胞過程、代謝過程、刺激反應(yīng)和脅迫響應(yīng)等過程。通過大量擬南芥雜種樣品的轉(zhuǎn)錄組分析也表明與生物量相關(guān)的基因在細(xì)胞過程、代謝過程、刺激應(yīng)答、生物調(diào)節(jié)和發(fā)育過程等生物學(xué)過程富集［26］。這表明植物生物量由多種因素累積共同決定，不僅受與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的基因控制，而且與植物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。值得注意的是，DEPs中約1/3（93個(gè)）富集到刺激反應(yīng)，包括脅迫響應(yīng)、非生物刺激反應(yīng)、溫度刺激反應(yīng)、冷反應(yīng)，其中26個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，67個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)。Yang等［26］研究也表明具有高生物量雜種優(yōu)勢(shì)的植株在刺激應(yīng)答中表現(xiàn)出整體的抑制。植物具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來平衡生長(zhǎng)和抗逆性的競(jìng)爭(zhēng)需求應(yīng)對(duì)外部環(huán)境的變化，以確保生存和繁殖。rpp1a-2突變體通過抑制對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)，進(jìn)而有利于植物在正常條件下的生長(zhǎng)。這些差異蛋白質(zhì)不僅參與脅迫響應(yīng)而且也在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。HSP81.4不僅響應(yīng)熱脅迫，而且在植物胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用［27］。CSDP1不僅響應(yīng)冷脅迫，也參與調(diào)控種子的早期萌發(fā)［28］。擬南芥SPIRAL1蛋白（SPR1）是植物特異性蛋白，調(diào)節(jié)定向的細(xì)胞擴(kuò)張，控制細(xì)胞骨架聚合物微管的組裝和拆卸［29］。乙烯依賴性向地性缺乏和黃綠蛋白1（ethylene-dependent gravitropism-deficient and yellow-green 1，EGY1）是金屬蛋白酶，參與調(diào)控?cái)M南芥下胚軸的內(nèi)胚層質(zhì)體的大小和數(shù)量［30］。

差異蛋白最顯著富集的代謝途徑是核糖體代謝，表明RPP1A缺失首先會(huì)影響其他RPs的表達(dá)。其中，RPS9M（AT3G49080）和RPS25B（AT2G21580）的表達(dá)量在突變體中顯著上調(diào)。RPS9M是一種線粒體核糖體蛋白，是中央細(xì)胞成熟和胚乳發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)［31］。RPS9M可以與線粒體中的錨重復(fù)蛋白（ankyrin-repeat protein）ANK6相互作用，進(jìn)而控制雌配子體的發(fā)育。除了RPP1A外，還有9種RPs的表達(dá)量在突變體中顯著下調(diào)，豐度只有WT的33%-63%。這些RPs（RPL31A、RPS30C、RPS7C、RPS15A、RPS16C、RPP2A）參與RNA結(jié)合［32］，但是這些RPs在生長(zhǎng)發(fā)育中的功能仍不清楚。

除了核糖體代謝過程外，突變體中光合作用和苯丙素的生物合成代謝過程等代謝途徑也顯著富集，這表明RPP1A可能通過核糖體外的途徑影響幼苗生長(zhǎng)。光合作用發(fā)生在植物葉片葉綠體中，將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，同時(shí)將CO2和水轉(zhuǎn)化為碳水化合物，是推動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育最基本的關(guān)鍵過程［33］。GO富集顯示，有76個(gè)蛋白質(zhì)富集到了葉綠體，其中33個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，43個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)。很多定位于葉綠體的碳代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)量在突變體中顯著上調(diào)，例如糖酵解途徑關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶4（phosphofructokinase 4）、磷酸甘油酸變位酶（phosphoglycerate mutase）、光合作用中的CO2固定關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase）。這 表 明rpp1a-2突變體中的碳代謝顯著增強(qiáng)。KEGG富集也表明rpp1a-2突變體導(dǎo)致與光合作用過程相關(guān)的一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。光系統(tǒng)II（photosystem II，PSII）反應(yīng)中心復(fù)合物中有3個(gè)關(guān)鍵亞基的表達(dá)量在rpp1a-2突變體中發(fā)生顯著變化，其中PSII反應(yīng)中心蛋白D1（PSBA）和D2（PSBD）的表達(dá)量顯著上調(diào)。PSII反應(yīng)中心蛋白D1和D2的合成受環(huán)境信號(hào)影響，對(duì)葉綠體發(fā)育中PSII的正常生物發(fā)生和維持光系統(tǒng)的功能至關(guān)重要［34-35］。因此，rpp1a-2突變體中的葉綠體中光合作用中的碳代謝和光反應(yīng)的增加，有助于提高光合效率，進(jìn)而促進(jìn)葉片的生長(zhǎng)。

與WT相比，rpp1a-2突變體中苯丙素的生物合成中的3個(gè)植物III類血紅素過氧化物酶（PRX71、PRX23和PRX47）和2個(gè)β-葡萄糖苷酶（BGLU21和BGLU22）的表達(dá)量顯著下調(diào)，但是過氧化物酶（PRX16和PRX72）的表達(dá)量則大大地增加。苯丙素合成代謝途徑中主要終產(chǎn)物之一是木質(zhì)素，已有的研究表明擬南芥中PRX47［36］、PRX71［37］和PRX72［38］參與催化木質(zhì)素聚合。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，可以強(qiáng)化細(xì)胞壁，促進(jìn)水分運(yùn)輸，同時(shí)在抵御生物和非生物脅迫中發(fā)揮作用［39］。同時(shí)，苯丙素合成代謝過程中還會(huì)產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在植物物種特定器官的形成和發(fā)育中發(fā)揮作用［40］。這表明RPP1A缺失可能通過影響苯丙素的生物合成進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)。本研究還發(fā)現(xiàn)RPP1A功能缺乏顯著影響了mRNA監(jiān)視通路和RNA降解途徑，這些調(diào)控蛋白參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。例如，MAGO（mago nashi family protein）家族蛋白質(zhì)參與植物生長(zhǎng)。研究表明，Mago表達(dá)量降低的RNA干擾的擬南芥突變株（RNAi-AtMago）的整體發(fā)育受阻，葉片明顯變小，莖短且偶有扁化的莖［41］，而Mago過表達(dá)植株葉片增大。而本研究中rpp1a-2突變體中MAGO的表達(dá)量增加，這也可能導(dǎo)致葉片增大?；プ鞣治鲆脖砻鱩RNA監(jiān)視通路和RNA降解途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)且與核糖體蛋白密切相互作用，因此，rpp1a-2突變體中可能通過與這些蛋白的相互作用進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

擬南芥核糖體蛋白R(shí)PP1A缺失導(dǎo)致幼苗生物量顯著增加。擬南芥rpp1a-2突變體通過調(diào)控核糖體代謝、光合作用、mRNA監(jiān)視途徑、RNA降解和苯丙素的生物合成等代謝通路中進(jìn)而影響植株葉片生長(zhǎng)。