一種改良的豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

張?chǎng)斡?，?瓊，張 濤，周 波，溫海京，崔德鳳*，張永紅*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定071000；3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員之一，也是目前世界上最小的DNA病毒，其基因組全長(zhǎng)1 700 bp左右，包含11個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)。該病毒感染豬可與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。此外，PCV2還與豬皮炎與腎病綜合征( porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)及母豬的生產(chǎn)繁殖障礙等疾病相關(guān)。故PCV2已成為嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一[1-3]。感染PCV2的患病母豬大大降低受孕率，增加感染母豬的流產(chǎn)率，導(dǎo)致可能產(chǎn)下木乃伊胎[4]。由于PCV2感染豬群存在臨床發(fā)病與亞臨床感染，其體內(nèi)的病毒載量不同，易引起PCV2檢測(cè)的漏檢，出現(xiàn)診斷錯(cuò)誤而延誤病情[5]。

針對(duì)PCV2的檢測(cè)方法有很多，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒分離、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等，這些方法都存在著操作煩瑣復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)以及檢測(cè)方法相對(duì)敏感性較低等弊端[6]，故而針對(duì)PCV2建立一種操作簡(jiǎn)便、靈敏的、快速的檢測(cè)方法非常必要。ORF2編碼PCV2的衣殼蛋白，是PCV2重要的抗原基因[7]，因此ORF2成為診斷鑒別PCV2的關(guān)鍵靶基因。該研究針對(duì)PCV2的ORF2基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用SYBR Green熒光染料建立一種快速、靈敏的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)PCV2的絕對(duì)定量PCR技術(shù)檢測(cè)方法，為臨床中PCV2的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)、豬博卡病毒(porcine boca virus，PBoV)均由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。Pure Plasmid Mini Kit高純度質(zhì)粒小提試劑盒(CW0548S，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；Pro Taq HS SYBR Green預(yù)混型qPCR試劑盒(AG11701， 湖南艾科瑞生物工程有限公司)。ABI step one plus型熒光定量PCR(ABI公司)，4 ℃臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo公司)，Nano Drop 2000分光光度計(jì)(Thermo公司)。

1.2 引物合成及標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備

根據(jù)GenBank中已公布的PCV2序列(NC_005148.1)，由北京擎科生物科技有限公司合成，將目的基因片段645 bp插入PUC57載體，成功構(gòu)建含有PCV2目的基因片段的PUC57-Cap重組克隆質(zhì)粒，該質(zhì)粒作為熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。根據(jù)該基因序列應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物序列Cap-F是5′-GAGGCGGGCGTTGAAGATGC-3′；Cap-R是5′-AGGAGGCGTTACCGAAGGAGAAG-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物135 bp。該引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了建立最適熒光定量PCR檢測(cè)方法，通過篩選引物濃度及退火溫度，提高檢測(cè)方法的效率。分別取0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L的上游引物、下游引物Cap-F、Cap-R 進(jìn)行引物濃度的篩選，以105copies/μL的質(zhì)粒作為模板，通過矩陣法進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，從而篩選出最佳的引物濃度。進(jìn)而通過已篩選出的最佳引物濃度，以5.0×105copies/μL的質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，調(diào)整退火溫度區(qū)間為63、64、65、66和67 ℃，篩選出最佳的退火溫度。

1.4 PCV2熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過Nano Drop 2000分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的吸光度OD280 nm及OD260 nm，計(jì)算出重組質(zhì)粒為5.0×1010copies/μL，連續(xù)10倍倍比稀釋，以108、107、106、105、104、103、102、101copies/μL這 8個(gè)不同濃度梯度的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為Pro Taq HS SYBR Green Mix(2×)10 μL，Cap-F 0.4 μL，Cap-R 0.4 μL，Rox 0.4 μL，模板 2 μL，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件是95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 15 s，66 ℃ 30 s，采集熒光，40個(gè)循環(huán)。

1.5 PCV2熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性分析

以PCV1、PRRSV、CSFV、PPV、PBoV的病毒DNA為對(duì)照組，以5.0×106copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCV2熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)。

1.6 PCV2熒光定量PCR檢測(cè)方法重復(fù)性分析

選取105、104和103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行組間及組內(nèi)的重復(fù)性試驗(yàn)。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品每組進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)試驗(yàn)為組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次重復(fù)為組間重復(fù)性試驗(yàn)。每次所得熒光定量PCR的Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)進(jìn)行分析。

1.7 PCV2熒光定量PCR與普通PCR敏感性分析

將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒模板10倍倍比稀釋，用不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增及熒光定量PCR擴(kuò)增，分析兩種方法的最低檢出量，比較兩種方法的敏感性差異。

1.8 臨床樣本檢測(cè)

對(duì)已知臨床背景有PCV2發(fā)病史的豬場(chǎng)采集到的30份樣本，包括6份血液樣本和24份環(huán)境樣本進(jìn)行PCV2流行病學(xué)調(diào)查。用已建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，分析差異。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

采用矩陣法篩選出0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L中的最優(yōu)濃度。Cap-F/Cap-R均為0.4 μmol/L時(shí)，對(duì)106copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增可獲得較小Ct值，且獲得的擴(kuò)增曲線優(yōu)于其他濃度，故而最終引物濃度選擇0.4 μmol/L，見圖1。

圖1 引物濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The results of primer concentration optimization

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)退火溫度優(yōu)化結(jié)果見表1，在66 ℃時(shí)可獲得較小Ct值，因此確定最佳退火溫度為66 ℃。

表1 退火溫度優(yōu)化數(shù)據(jù)Tab.1 Annealing temperature optimization data

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。所得線性方程Y=-3.137X+29.85，該檢測(cè)方法的擴(kuò)增效率105.403%，反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R2=0.999。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，針對(duì)其溶解曲線進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度是89.74 ℃，未出現(xiàn)由于引物二聚體及其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物等原因?qū)е碌钠渌逯怠Ｔ摻Y(jié)果符合熒光定量PCR技術(shù)要求，可以用于PCV2的絕對(duì)定量分析。

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of real-time fluorescence quantitative PCR

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)方法的熔解曲線Fig.3 Melting curve of real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性結(jié)果

檢測(cè)方法的敏感性是評(píng)估該檢測(cè)技術(shù)靈敏性的重要指標(biāo)，故而針對(duì)常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種檢測(cè)方法的敏感性進(jìn)行比較分析。將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍倍比稀釋，常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果的最低檢出量5.0×104copies/μL(圖4)，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法在5.0×101copies/μL時(shí)仍有擴(kuò)增，說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法比常規(guī)PCR方法靈敏1 000倍。

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性結(jié)果

根據(jù)已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)PCV1、PRRSV、豬CSFV、PPV、PBoV及PCV2病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)。只有PCV2在Ct值為20左右時(shí)出現(xiàn)S形曲線，而檢測(cè)的其他樣本均未擴(kuò)增，判定結(jié)果為陰性，見圖5。該試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法的特異性較強(qiáng)，未出現(xiàn)假陽(yáng)性，可以用于后續(xù)臨床樣本分析。

注：M是Maker；1是5.0×107 copies /μL；2是5.0×106 copies /μL；3是5.0×105 copies/μL；4是5.0×104copies/μL；5是5.0×103 copies/μL；6是5.0×102 copies/μL；7是5.0×101 copies/μL。Note: M is Marker; 1 is 5.0×107 copies/μL; 2 is 5.0×106 copies/μL; 3 is 5.0×105 copies/μL; 4 is 5.0×104 copies/μL; 5 is 5.0×103 copies/μL; 6 is 5.0×102 copies/μL; 7 is 5.0×101 copies/μL.圖4 常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR test results

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性結(jié)果Fig.5 Specific results of real-time fluorescence quantitative PCR

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性分析

熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)見表2。組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于0.05。已建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有較高的穩(wěn)定性。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)Tab.2 Repeatability of real-time fluorescence quantitative PCR

2.6 臨床樣本檢測(cè)

根據(jù)該研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法和常規(guī)PCR方法，對(duì)已知臨床背景有PCV2發(fā)病史的豬場(chǎng)采集到的30份樣本，包括6份血液樣本和24份環(huán)境樣本進(jìn)行PCV2流行病學(xué)調(diào)查。常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果10份樣本陽(yáng)性，陽(yáng)性率33.3%。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果19份樣本陽(yáng)性，陽(yáng)性率63.3%，結(jié)果見表3。該研究所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法比常規(guī)PCR檢測(cè)方法的檢出率高出30.0%，說(shuō)明該方法具有較好的靈敏性，并且可以實(shí)現(xiàn)定量分析樣本中的病毒載量，能夠適用于豬場(chǎng)內(nèi)PCV2病毒的疫情檢測(cè)及疫病的篩查工作，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)PCV2提供有效的技術(shù)支持。

表3 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Test results of clinical samples

3 討 論

近幾年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，大型規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)隨之增多，針對(duì)豬場(chǎng)的各類疫情防控尤為重要。目前PCV2早已在全球范圍內(nèi)廣泛流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)不利影響，造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。建立一種操作簡(jiǎn)便、快速有效的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型病毒的方法，監(jiān)測(cè)PCV2的傳播、流行及防控具有十分重要的意義。傳統(tǒng)病毒的分離檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不能為臨床診斷提供較為快速準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。常規(guī)PCR對(duì)反應(yīng)條件要求較高，并且容易出現(xiàn)引物二聚體等副產(chǎn)物，大大影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是由Applied Biosystems公司研發(fā)出的一種可用于定量檢測(cè)的技術(shù)，常用的有熒光染料SYBR Green和熒光標(biāo)記Taqman探針，可實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物擴(kuò)增變化，靈敏性高，特異性強(qiáng)且能快速定量檢測(cè)出結(jié)果[9]。

該研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法根據(jù)ORF2基因設(shè)計(jì)引物。ORF2位于PCV2病毒基因組的互補(bǔ)鏈上編碼具有高度免疫原性的Cap蛋白。Cap蛋白在PCV2病毒的致病性中起重要作用[10]，有研究表明，Cap蛋白可以使感染PCV2的豬產(chǎn)生大量抗體，故而Cap蛋白成為檢測(cè)PCV2的重要抗原[11]。該研究根據(jù)SYBR Green染料法建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.137X+29.85，R2為0.999，說(shuō)明該試驗(yàn)線性關(guān)系良好；擴(kuò)增效率105.403%，說(shuō)明該方法的擴(kuò)增效率優(yōu)異；熔解曲線在89.74 ℃時(shí)只出現(xiàn)了單峰，說(shuō)明引物特異性強(qiáng)，沒有出現(xiàn)引物二聚體等副產(chǎn)物；該方法的組間及組內(nèi)的變異系數(shù)均小于0.05%，說(shuō)明具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)性；該方法PCV2最低檢出量5.0×101copies/μL，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法的靈敏度高1 000倍。將已建立的絕對(duì)定量熒光PCR檢測(cè)方法用于臨床樣本檢測(cè)，并且與常規(guī)PCR進(jìn)行對(duì)比，常規(guī)PCR檢測(cè)30個(gè)樣本，其中10個(gè)樣本為陽(yáng)性，絕對(duì)定量熒光PCR檢測(cè)30個(gè)樣本，其中19個(gè)樣本為陽(yáng)性。絕對(duì)定量熒光PCR的檢出率明顯高于常規(guī)PCR，該試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法具有更強(qiáng)的靈敏性，為后續(xù)用于臨床檢測(cè)PCV2提供有效的技術(shù)支持。

石林等[12]根據(jù)ORF1設(shè)計(jì)引物，建立的PCV2 Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的最低檢測(cè)值8.828×106copies/μL；于靜等[5]根據(jù)ORF2建立的SYBR染料熒光定量PCR檢測(cè)方法的最低檢測(cè)值1×102copies/μL；郭慧娟等[13]建立的Taqman熒光定量PCR檢測(cè)方法的最低檢出量4.53×102copies/μL。該研究建立的豬圓環(huán)病毒2型絕對(duì)定量PCR檢測(cè)方法為熒光定量PCR檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型方法的一個(gè)補(bǔ)充，靈敏度高于石林等[12]和于靜等[5]及郭慧娟等[13]的研究結(jié)果。相較于徐通等[14]建立的常規(guī)PCR方法，該試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短、可定量檢測(cè)出病毒濃度，且不易產(chǎn)生氣溶膠污染等問題，有效降低了生物安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可進(jìn)行大批量樣本的快速檢測(cè)?？蔀榕R床中感染發(fā)病及處于亞臨床狀態(tài)中的生豬進(jìn)行早期診斷、疫病的篩查、探索PCV2的發(fā)病規(guī)律及其流行的特點(diǎn)，為PCV2的早期發(fā)現(xiàn)治療贏得時(shí)間，大大減少因PCV2爆發(fā)感染導(dǎo)致的豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失。