益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠慢性酒精性肝損傷的改善作用及機(jī)制研究

王 引，張?zhí)m威

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266000）

機(jī)體攝入的酒精超過90%在肝臟代謝，若長(zhǎng)期酒精攝入產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物超過肝臟的解毒能力，勢(shì)必對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷[1]。研究表明，酒精及其代謝物乙醛被認(rèn)為是酒精性肝損傷的病因[2]，氧化應(yīng)激在急性或慢性酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用[3?4]。因此，加速肝臟酒精代謝排出和預(yù)防氧化應(yīng)激是延緩酒精性肝損傷發(fā)病的有效途徑。

目前，藥物干預(yù)仍是預(yù)防和治療酒精性肝損傷的主要方法，然而，藥物具有的嚴(yán)重副作用及不能為所有人所耐受的缺點(diǎn)使得探索天然成分的安全有效干預(yù)手段迫在眉睫[5]。益生菌對(duì)人體具有良好的生理生化功能，研究表明鼠李糖乳桿菌CCFM1107（Lactobacillus rhamnosusCCFM1107）能通過提高肝臟抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化發(fā)揮對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[6]。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）作為存在于紅酒、葡萄、花生和其他各種植物中的一種多酚類物質(zhì)，可抑制大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化，提高肝臟抗氧化酶活性，通過增強(qiáng)抗氧化防御體系預(yù)防慢性酒精干預(yù)造成的肝損傷[7]。然而，益生菌與白藜蘆醇通過降低機(jī)體氧化應(yīng)激途徑預(yù)防酒精性肝損傷的研究均已有報(bào)道[8?9]，但兩者聯(lián)合作用是否具有更好的預(yù)防效果及可能機(jī)制還需進(jìn)一步探明。

因此，本研究基于具有抗氧化及降脂活性的益生菌副干酪乳桿菌J5（Lactobacillus paracaseiJ5、L.paracaseiJ5）、干酪乳桿菌YRL577（Lactobacillus caseiYRL577、L. caseiYRL577）、動(dòng)物雙歧桿菌F1-7（Bifidobacterium animalisF1-7，Bif.animalsF1-7）[10?12]，探討其分別聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)慢性酒精性肝損傷的可能保護(hù)作用及潛在機(jī)制，以期為后續(xù)解酒護(hù)肝功能性產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6J雄性小鼠（17~19 g） 濟(jì)南朋悅生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)SCXK（魯）20190003）；L.paracaseiJ5、L. caseiYRL577、Bif. animalsF1-7中國(guó)海洋大學(xué)功能乳品與益生菌工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；白藜蘆醇 純度98%，阿拉丁試劑；95%食品級(jí)酒精 河南鑫河陽(yáng)酒精有限公司；MRS液體培養(yǎng)基

青島海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS） 北京Solarbio科技有限公司；甘油三脂（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)胞色素酶CYP2E1（CYP2E1）ELISA試劑盒 艾萊薩生物科技（上海）有限公司；Trizol裂解液 美國(guó)Invertrogen；異丙醇、氯仿 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 東洋紡生物科技有限公司；DEPC去離子水、BCA蛋白濃度試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技公司；BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)BIO-RAD公司；TP600PCR 擴(kuò)增儀

寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；Olympus CKX51倒置顯微鏡 奧林巴斯公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)

蘇州島津儀器公司；NIKON/Ni-E電動(dòng)熒光顯微鏡

日本尼康公司；TG20KR-D高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；AB135-S分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 菌株以2%（v/v）接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液在4 ℃條件下以8000 r/min離心5 min，棄去上清，菌體重懸于無(wú)菌PBS洗滌兩次，通過平板計(jì)數(shù)法獲得菌體濃度為109CFU/mL的PBS菌懸液，使用前臨時(shí)置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 動(dòng)物模型與分組 42只雄性C57BL/6J小鼠在清潔級(jí)、12 h光照/黑暗交替、（23±2）℃溫度、（50%±10%）相對(duì)濕度的動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨后被隨機(jī)分成6組（n=7），分別為空白對(duì)照組（Con組）、酒精模型組（Mod組），三種益生菌分別聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)組（J5+Res、YRL577+Res、F1-7+Res組）、陽(yáng)性藥物硫普羅寧組（LP組），所有組別小鼠均喂食普通飼料。實(shí)驗(yàn)按照中國(guó)科學(xué)技術(shù)部動(dòng)物管理?xiàng)l例，并經(jīng)中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：SPXY20200717）。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，從第2周開始每天上午除Con組外其余組別小鼠均灌胃酒精（酒精濃度從20%（v/v）每3 d提高5%到終濃度40%，保持酒精濃度40%至11周末），Con組灌胃無(wú)菌蒸餾水，灌胃劑量均為10 mL/kg body weight。同時(shí)每天下午對(duì)小鼠以10 mL/kg body weight進(jìn)行益生菌聯(lián)合白藜蘆醇及陽(yáng)性藥物灌胃干預(yù)，白藜蘆醇在菌懸液中混勻并使最終干預(yù)劑量為50 mg/kg body weight，陽(yáng)性藥物干預(yù)劑量為65 mg/kg/d，Con與Mod組以10 mL/kg body weight灌胃無(wú)菌PBS。灌胃至11周末處死小鼠。處死前12 h禁食，自由飲水。小鼠眼球靜脈取血，室溫放置30 min，3000 r/min離心15 min，小心吸取上層淡黃色血清分裝保存，同時(shí)收集肝臟組織均置于?80 ℃冰箱待用。

1.2.3 肝臟組織病理學(xué)分析 將小鼠肝左葉5 mm×5 mm固定在4%多聚甲醛中5~6 h，并常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋，從石蠟塊上切下一片厚度約為4 μm的肝臟組織切片，進(jìn)行油紅O染色，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4 其它指標(biāo)測(cè)定 按照廠家提供的說明，采用谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)試盒檢測(cè)小鼠血清中AST、ALT活性。使用甘油三脂、總膽固醇、丙二醛、還原型谷胱甘肽、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶商業(yè)試劑盒及細(xì)胞色素酶CYP2E1ELISA試劑盒測(cè)定小鼠肝臟組織勻漿液中TG、TC、MDA、GSH含量及ADH、ALDH、SOD、CAT、CYP2E1活性。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 利用RT-PCR檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因CYP2E1、Nrf-2、HO-1的mRNA表達(dá)，引物序列如表1所示。根據(jù)試劑盒操作說明，稱取適量的肝臟組織，并加入trizol裂解液從組織中提取總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA單鏈后進(jìn)行qPCR操作。每個(gè)靶基因的檢測(cè)值與β-actin的比率代表每個(gè)靶基因的表達(dá)水平。ΔΔCt用于計(jì)算基因表達(dá)的倍數(shù)差異。

表1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的引物序列Table 1 Primer sequences of reverse transcription polymerase chain reaction

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS Statistics 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用單因素方差分析（ANOVA）并進(jìn)行S-N-K檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌聯(lián)合干預(yù)對(duì)慢性酒精攝入導(dǎo)致的小鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響

研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期過量飲酒會(huì)導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，使肝臟中TG、TC含量顯著增加[13]。為了探討益生菌與Res聯(lián)合補(bǔ)充對(duì)慢性酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響，采用組織學(xué)分析結(jié)合生化TG、TC測(cè)定來評(píng)價(jià)肝脂肪變性[14]。由圖1可知，與Con相比，Mod組小鼠肝臟脂質(zhì)積聚增加，而聯(lián)合干預(yù)組脂質(zhì)積累情況均得到改善。由圖2可知，益生菌聯(lián)合干預(yù)組及LP組的肝TG、TC含量均與Con組無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明益生菌聯(lián)合干預(yù)組均能夠有效抑制慢性酒精喂養(yǎng)小鼠的脂質(zhì)增加，其表現(xiàn)出的較強(qiáng)降脂活性與益生菌和Res本身具有的降脂活性密不可分，且兩者相互聯(lián)合的預(yù)防效果與LP組無(wú)顯著性差異（P>0.05），這對(duì)開發(fā)輔助降脂功能產(chǎn)品具有重要意義。

圖1 小鼠肝臟油紅O染色結(jié)果Fig.1 Oil red O staining of mice liver

圖2 益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠肝臟TG和TC含量的影響Fig.2 Effects of probiotics combined with resveratrol on TG and TC contents in mice liver

2.2 益生菌聯(lián)合Res干預(yù)對(duì)慢性酒精攝入導(dǎo)致的小鼠肝損傷的影響

AST和ALT被用作評(píng)估肝損傷的敏感指標(biāo)[15]，酒精積累會(huì)破壞肝細(xì)胞膜的完整性和線粒體功能，促進(jìn)AST和ALT的釋放[16?17]。由圖3可知，長(zhǎng)期慢性飲酒導(dǎo)致Mod組小鼠血清AST和ALT活力較Con組小鼠顯著升高（P<0.05），但這種情況在所有預(yù)防干預(yù)組中均得到明顯改善；F1-7+Res和LP組小鼠血清AST和ALT水平均與Con組無(wú)顯著性差異（P>0.05），YRL577+Res組的AST水平及J5+Res組的ALT水平雖未處于正常水平但較Mod組分別降低了50.38%和30.20%。這表明各預(yù)防組均具有較好的預(yù)防慢性酒精性肝損傷的效果。

圖3 益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠血清AST和ALT活力的影響Fig.3 Effects of probiotics combined with resveratrol on serum AST and ALT activities in mice

2.3 益生菌干預(yù)對(duì)調(diào)節(jié)慢性酒精攝入小鼠酒精代謝酶活性的影響

ADH、ALDH和CYP2E1是肝臟參與酒精代謝的酶，但大量酒精攝入會(huì)導(dǎo)致CYP2E1發(fā)揮主要作用[18?19]，而CYP2E1被認(rèn)為是誘導(dǎo)肝脂肪變性和氧化應(yīng)激的重要因素[20]。從圖4結(jié)果可知，Mod組小鼠肝臟中ADH和ALDH活性均顯著降低，而CYP2E1活性卻顯著升高（P<0.05），但這一情況在四個(gè)預(yù)防干預(yù)組中得到改善，其中ADH活性在各干預(yù)組中不具有顯著性差異且與Con組同一水平（P>0.05），四個(gè)預(yù)防干預(yù)組（J5+Res、YRL577+Res、F1-7+Re、LP）ALDH活性分別是Mod組的2.23、2.34、1.80和1.71倍，同時(shí)，三個(gè)益生菌聯(lián)合干預(yù)組中CYP2E1活性與Con組不具有顯著性差異（P>0.05）且顯著優(yōu)于LP組（P<0.05）。以上結(jié)果表明，益生菌聯(lián)合干預(yù)組能夠通過調(diào)控肝臟酒精代謝酶活力發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

圖4 益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠肝臟酒精代謝酶的影響Fig.4 Effects of probiotics combined with resveratrol on liver alcohol metabolizing enzymes in mice

2.4 益生菌聯(lián)合Res干預(yù)對(duì)慢性酒精攝入小鼠肝臟氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化水平的影響

酒精攝入會(huì)導(dǎo)致酶（如SOD、CAT）和非酶抗氧化劑（如GSH）過度消耗，誘發(fā)肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)[21],還會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)自由基的形成和脂質(zhì)的積累，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。MDA被用作氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，以評(píng)估膜脂質(zhì)過氧化的程度[22]。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化均可增加酒精性肝損傷。圖5（a~c）結(jié)果顯示長(zhǎng)期酒精攝入導(dǎo)致小鼠肝臟中SOD和CAT活性顯著降低，GSH大量減少（P<0.05），但這一情況在四個(gè)預(yù)防干預(yù)組中的得到顯著改善，其中，各干預(yù)組的SOD活性和GSH含量均與Con組無(wú)顯著性差異（P>0.05），各干預(yù)組的CAT活性雖未恢復(fù)至正常水平但均顯著高于Mod組（P<0.05）。同時(shí)為了評(píng)估脂質(zhì)過氧化，測(cè)定了小鼠肝臟中的MDA含量。從圖5d可知，小鼠肝臟中MDA水平在各干預(yù)組中均不具有顯著性差異且與Con同一水平（P>0.05）。這些結(jié)果表明益生菌聯(lián)合干預(yù)組具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠通過降低酒精導(dǎo)致的肝臟氧化應(yīng)激和抑制脂質(zhì)過氧化發(fā)揮對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

圖5 益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響Fig.5 Effects of probiotics combined with resveratrol on liver oxidative stress in mice

2.5 益生菌聯(lián)合Res干預(yù)對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

Nrf-2、HO-1、CYP2E1均是調(diào)控肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵基因[23]。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于抑制氧化應(yīng)激和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要[24?25]，其在調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)方面起著關(guān)鍵作用，它的激活被認(rèn)為是預(yù)防和治療與氧化損傷有關(guān)疾病的一個(gè)有吸引力的策略，包括急性和慢性肝損傷[26]。HO-1是Nrf2調(diào)控的下游基因，一種防御蛋白，通過催化血紅素降解保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。從圖6可知，長(zhǎng)期酒精暴露顯著抑制Nrf-2、HO-1基因并上調(diào)CYP2E1基因的表達(dá)（P<0.05）；益生菌聯(lián)合干預(yù)組及LP組均能顯著上調(diào)基因Nrf2 、HO-1mRNA表達(dá)，使之恢復(fù)正常，同時(shí)CYP2E1mRNA表達(dá)量（J5+Res、YRL577+Res、F1-7+Re、LP）也較Mod組分別下調(diào)45.0%、39.8%、34.8%和29.8%。以上結(jié)果表明益生菌聯(lián)合干預(yù)組可能通過調(diào)控Nrf-2、HO-1和CYP2E1基因的表達(dá)來改善機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖6 益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effect of probiotics combined with resveratrol on mRNA expression of oxidative stress related genes in mice liver

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，益生菌聯(lián)合白藜蘆醇能夠顯著提高酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟ADH、ALDH活性，并顯著抑制CYP2E1活性及基因CYP2E1的mRNA表達(dá)（P<0.05），這對(duì)轉(zhuǎn)變酒精氧化代謝途徑進(jìn)而減少自由基產(chǎn)生具有重要意義。前人研究報(bào)道，藍(lán)莓聯(lián)合益生菌對(duì)酒精性脂肪性肝病具有協(xié)同保護(hù)作用，這與兩者聯(lián)合后具有的強(qiáng)大抗氧化活性有關(guān)[27?28]，但藍(lán)莓汁成分復(fù)雜，難以明確解釋其協(xié)同作用的分子機(jī)制。根據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)緩解酒精性肝損傷的活性物質(zhì)篩選結(jié)果，最終選擇白藜蘆醇與三株潛在功能性益生菌聯(lián)合作用。研究結(jié)果表明各益生菌聯(lián)合干預(yù)組均能顯著改善酒精導(dǎo)致的肝臟氧化和抗氧化失衡狀態(tài)，提高肝臟的抗氧化防御體系，提高肝臟GSH含量和SOD、CAT活性，降低MDA水平，并使部分指標(biāo)恢復(fù)至正常水平，因此，聯(lián)合干預(yù)組表現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗氧化能力，這對(duì)預(yù)防酒精導(dǎo)致的肝臟氧化應(yīng)激具有重要作用。

Nrf2/HO-1通路是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的生物學(xué)功能中起著不可或缺的作用[29]。酒精攝入會(huì)導(dǎo)致Nrf2/HO-1通路受到抑制[30]，這種抑制作用在所有益生菌聯(lián)合干預(yù)組中均得到顯著改善，因此，推測(cè)其可能通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路預(yù)防酒精性肝損傷。然而，本研究?jī)H初步檢測(cè)了Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)水平，接下來還需使用該信號(hào)通路的抑制劑或激活劑進(jìn)行深入研究以驗(yàn)證推測(cè)。

本研究利用C57BL/6J小鼠構(gòu)建慢性酒精性肝損傷模型探究益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，益生菌聯(lián)合白藜蘆醇能夠顯著降低小鼠肝臟TG、TC含量和血清AST、ALT活性（P<0.05），提高肝臟酒精代謝酶ADH、ALDH活性并抑制肝臟CYP2E1活性及其mRNA表達(dá)，并增強(qiáng)肝臟抗氧化防御體系，使肝臟GSH含量和SOD、CAT活性顯著提高（P<0.05），并能有效激活Nrf2/HO-1通路，推測(cè)益生菌聯(lián)合白藜蘆醇通過Nrf2/HO-1途徑發(fā)揮對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。綜上所述，益生菌聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)慢性酒精性肝損傷具有很好的預(yù)防作用，這為解酒護(hù)肝功能性產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考，未來具有廣泛的應(yīng)用前景。