賓川葡萄籽原花青素純化及對HepG2細胞增殖的影響

張麗明，馬雅鴿，牛若楠，張 希，趙聲蘭, ，陳朝銀

（1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南昆明 650500；2.云南經(jīng)濟管理學院醫(yī)學院，云南昆明 650106）

葡萄籽系葡萄科葡萄屬葡萄（Vitis viniferaL.）的種子[1]。葡萄籽多酚作為葡萄籽提取物的主成分，是目前國內(nèi)外公認清除自由基極為有效的天然抗氧化劑[2]，其多酚主要成分為原花青素[3]。原花青素（procyanidins，PC）是由兒茶素或表兒茶素縮合而成的生物類黃酮，作為天然強有效的自由基清除劑，能有效清除·OH、O2-·、NO·、DPPH·等多種自由基，具有舒張血管、降血糖、降血脂[4?5]，抑制腎、腸功能障礙、提高記憶力[6?8]及抗肥胖、美白等作用[9?11]。近年來，葡萄籽原花青素在抗腫瘤方面的研究備受關(guān)注，其對皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等均有一定的預(yù)防或治療作用[12]。肝癌是全球第六大常見癌癥，其發(fā)病率和死亡率均位于各類癌癥前十位（發(fā)展中國家中發(fā)病率85%，居不同癌種第一），中國作為最大的發(fā)展中國家，肝癌發(fā)病總數(shù)占全球肝癌病人總數(shù)的50%[13]，目前治療肝癌的方法主要有手術(shù)切除、肝移植和放化療法[14?16]。可見，以葡萄籽原花青素抑制肝癌的活性，研究意義較大，應(yīng)用前景廣闊。

云南大理賓川縣處于干熱河谷地區(qū)，得天獨厚的地理環(huán)境，適宜葡萄種植栽培，擁有全國縣級最大葡萄生產(chǎn)基地。賓川葡萄籽資源豐富，多酚類物質(zhì)主要是原花青素含量高，開發(fā)價值極大。文獻中報道葡萄籽原花青素對肝癌HepG2細胞作用的研究較少，本文以云南大理賓川產(chǎn)葡萄籽為原料，對其原花青素提取物進行純化，考察了上樣液質(zhì)量濃度、pH、流速、乙醇體積分數(shù)等對原花青素吸附及解析的影響，確定最佳純化工藝，并測定了不同極性葡萄籽原花青素對肝癌HepG2細胞增殖的影響，期望對云南大理賓川葡萄籽的開發(fā)和利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽原花青素提取物 實驗室自制；HepG2細胞株 中國科學院昆明細胞庫；原花青素對照品

純度≥95%，天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；甲醇、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨等 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清（四季青）、DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）、胰酶-EDTA消化液（0.25%）（Hyclone）、PBS磷酸鹽緩沖液、H-青鏈霉素混合液 BI公司；CCK8（日本同仁） 北方智杰方遠科技有限公司；二甲基亞砜DMSO（細胞培養(yǎng)級）索萊寶生物科技有限公司；食用酒精 市售。

UV759S紫外-可見分光光度計 上海精科公司；EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；DK-98-ΠA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-D Ш予華牌循環(huán)水真空泵 鄭州鞏義市予華儀器有限責任公司；LAB-25OSY超純水儀 南京歐凱環(huán)境科技有限公司；SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海泉杰儀器有限公司；LGJ-10F真空冷凍干燥機 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；BSC-1600 ΠA2生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；311二氧化碳培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技公司；ECLIPSE倒置顯微鏡 尼康；TD6臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；INFINITE M200 PRO酶標儀 瑞士TECAN公司；YXQ-LS-50S立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；101-1EBS電熱鼓風干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄籽原花青素提取物的制備 該部分內(nèi)容為實驗室前期研究確定。將干燥的葡萄籽，粉碎并過2號篩備用。采用超聲醇提取法提取原花青素，料液比為1:30 g/mL；乙醇濃度50%；超聲溫度50 ℃；超聲時間55 min；超聲功率331.5 W。提取2次，提取液過濾，合并濾液，減壓濃縮，2800 r/min離心5 min，取上清液凍干制成葡萄籽原花青素提取物備用。

1.2.2 原花青素含量測定

1.2.2.1 標準曲線和回歸方程的建立 本實驗采用鹽酸-正丁醇法[17]測定原花青素標準曲線。稱取25 mg（精確至0.1 mg）原花青素標準品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得原花青素標準儲備液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。分別吸取原花青素標準儲備液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成原花青素系列標準溶液。分別精密移取1.0 mL原花青素系列標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，加入5%鹽酸-正丁醇6.0 mL，2%硫酸鐵銨溶液0.2 mL，混勻，置沸水中精確加熱40 min后，立即置于冰水中冷卻，冷卻至室溫后，用5%鹽酸-正丁醇補足至容量瓶刻度線，在加熱完畢15 min后，于546 nm波長處測吸光度。得到葡萄籽原花青素濃度C（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為：A=1.8937C+0.0293，R2=0.9973。結(jié)果表明，原花青素濃度在0~0.6 mg/mL范圍內(nèi)與546 nm處吸光值線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 固體試樣溶液的制備 稱取凍干粉50 mg（精確至0.1 mg），置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲處理20 min，放冷至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，離心或放置至澄清后取上清液待測。取1 mL上清液按1.2.2.1中方法測定原花青素含量。液體試樣：吸取1 mL的待測溶液，按1.2.2.1中方法測定原花青素含量。

1.2.3 AB-8樹脂對葡萄籽原花青素提取物的靜態(tài)吸附

1.2.3.1 大孔樹脂預(yù)處理 將大孔吸附樹脂浸泡在體積分數(shù)95%的乙醇中，充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇清洗至流出液加適量蒸餾水無白色混濁，再用蒸餾水洗至流出液無醇味，處理好的樹脂備用。

1.2.3.2 靜態(tài)吸附動力學特性的測定 準確稱取處理好的AB-8型樹脂2.0 g于150 mL錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的葡萄籽原花青素提取物溶液20 mL，置于搖床中，25 ℃，160 r/min，振搖吸附6 h，每隔1 h取吸附液1 mL，用鹽酸-正丁醇法測定吸光度，繪制靜態(tài)吸附動力曲線。按以下公式計算吸附率：

式中：C0表示起始原花青素濃度，mg/mL；C1表示平衡時原花青素濃度，mg/mL。

1.2.3.3 考察上樣液pH 取處理好的AB-8型樹脂2.0 g于150 mL錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的葡萄籽原花青素提取物溶液20 mL，pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，置于搖床中，25 ℃，160 r/min，振搖吸附6 h，取1 mL吸附液，用鹽酸-正丁醇法測吸光度，計算吸附率，分析上樣溶液pH對大孔樹脂吸附的影響。

1.2.3.4 考察上樣液質(zhì)量濃度 取處理好的4份AB-8型樹脂2.0 g于150 mL錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的葡萄籽原花青素提取物溶液20 mL，pH均為4.0，置于搖床中，25 ℃，160 r/min，振搖吸附6 h，取吸附液1 mL，用鹽酸-正丁醇法測定吸光度，計算吸附率，分析上樣溶液質(zhì)量濃度對大孔樹脂吸附的影響。

1.2.4 AB-8樹脂對葡萄籽原花青素提取物的動態(tài)吸附 將預(yù)處理好的樹脂裝入1.2 cm×50 cm的色譜柱中，裝柱體積為10 mL。將葡萄籽原花青素提取液調(diào)整到最適pH上柱，對上樣流速、洗脫劑體積分數(shù)等進行動態(tài)吸附與解吸實驗。實驗中待樣液全部通過樹脂柱后，用去離子水洗至流出液無色，再用不同濃度的乙醇以一定速度洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，測定吸附率及解析率。

式中：C2表示上樣液中原花青素濃度，mg/mL；C3表示洗脫液中原花青素濃度，mg/mL；V2表示上樣體積，mL；V3表示洗脫液體積，mL。

1.2.4.1 考察上樣流速 上樣質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL，pH4.0，分別以1.0、2.0 BV/h流速上樣，每10 mL為一個單位收集流出液，測定吸光度計算其對原花青素的吸附率。

1.2.4.2 考察洗脫劑體積分數(shù) 上樣質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL，pH4.0，上樣流速為1 BV/h，上樣量為2 BV，上樣結(jié)束后用4 BV體積的蒸餾水洗滌，然后分別用體積分數(shù)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇各4 BV進行洗脫，將洗脫液減壓濃縮、冷凍干燥，計算解析率。

1.2.5 葡萄籽原花青素回收率和純度的測定 將葡萄籽原花青素提取液按最佳純化工藝：上樣液pH4.0，上樣液的質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL，上樣液的流速為1.0 BV/h，洗脫液的體積分數(shù)為30%，洗脫體積4 BV上柱洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后凍干，計算原花青素的回收率和純度。

式中：C2表示上樣液原花青素濃度，mg/mL；C3表示洗脫液中原花青素濃度，mg/mL；V2表示上樣體積，mL；V3表示洗脫液體積，mL；M表示洗脫液凍干后質(zhì)量，mg。

1.2.6 CCK8法檢測肝癌HepG2細胞增殖情況

1.2.6.1 供試樣品制備 按1.2.4中葡萄籽原花青素提取物最佳純化工藝，洗脫液稍有改動，以10%、20%、30%、40%乙醇溶液進行梯度洗脫，制備不同極性部位葡萄籽原花青素。具體方法：稱取適量葡萄籽原花青素提取物，加水溶解，制得葡萄籽原花青素提取物水溶液（即未純化部位）。通過AB-8大孔吸附樹脂對該水溶液進行吸附，以不同濃度乙醇溶液梯度洗脫，收集各濃度洗脫液，合并相同濃度洗脫液，減壓濃縮，將各濃縮液制成凍干粉，得到不同極性葡萄籽原花青素備用。

1.2.6.2 肝癌HepG2細胞的培養(yǎng) 從液氮罐里取出裝有癌細胞的凍存管，置37 ℃水浴鍋里，搖晃1 min，使之全部融化，然后將凍存液迅速轉(zhuǎn)移到60 mm細胞培養(yǎng)皿中，加入含10%血清和1%青鏈霉素混合液的高糖培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）5 mL，吹勻，在37 ℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，一般4 h細胞完全貼壁，48 h后傳代。丟棄細胞培養(yǎng)廢液，用PBS清洗兩遍，注意動作輕柔，防止洗掉貼壁細胞，加入適量胰酶并在顯微鏡下觀察，等到細胞開始變得圓潤并且開始脫落，加入完全培養(yǎng)基終止消化，以1000 r/min離心5 min。丟棄上清液，加入完全培養(yǎng)液，吹散重懸細胞，按照1:3的比例進行傳代。每2 d更換培養(yǎng)液一次，待細胞密度達到80%~90%時，即可用細胞開展實驗。

1.2.6.3 葡萄籽原花青素提取物對肝癌HepG2細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細胞，以104個細胞/孔接種至96孔板，每孔加100 μL，分為空白組、對照組、葡萄籽原花青素提取物不同濃度的各極性組，每組分別設(shè)5個復(fù)孔?？瞻捉M和對照組加完全培養(yǎng)液，給藥組分別加25、50、100、200 μg/mL的葡萄籽原花青素提取物各極性凍干粉溶液，放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，48 h后吸走培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次，再加入含有10% CCK8的完全培養(yǎng)液，2 h后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。按照以下公式計算出存活率：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗平行3次，用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism7.0進行分析，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差（Mean±SD）表示，多組間比較采用One-way ANOVA。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8樹脂靜態(tài)吸附動力學特征

AB-8樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線如圖1所示。由圖1可知，0.5 h內(nèi)AB-8樹脂對原花青素快速吸附，0.5~3 h內(nèi)吸附速度變緩，3 h后吸附達到飽和，故靜態(tài)吸附3 h適宜。

圖1 AB-8樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.1 AB-8 resin static adsorption kinetic curve

2.2 pH對AB-8樹脂吸附葡萄籽原花青素的影響

由圖2可以看出，隨著pH的升高AB-8樹脂對葡萄籽原花青素的吸附率呈先升高后略降低的趨勢，說明一定的酸性條件有利于原花青素的吸附，其原因可能是黃酮類化合物含有酚羥基和糖苷鍵，當pH較小時以分子狀態(tài)存在，主要依靠范德華力與樹脂進行物理吸附；而在堿性條件下，以離子狀態(tài)存在，吸附比較困難[18]。研究發(fā)現(xiàn)，pH2.0時提取溶液變得很紅，pH6.0時溶液開始變成綠色，說明pH對提取物溶液中原花青素分子結(jié)構(gòu)影響較大，故提取物溶液的pH應(yīng)保持在適宜的范圍內(nèi)，當pH4.0時吸附率最高且提取物溶液顏色與未調(diào)pH前無明顯差異，故最適合的pH為4.0。

圖2 pH對吸附率的影響Fig.2 The influence of pH on adsorption rate

2.3 上樣液質(zhì)量濃度對AB-8樹脂吸附葡萄籽原花青素的影響

由圖3可知，葡萄籽提取物濃度為6.0 mg/mL時，AB-8樹脂對葡萄籽原花青素吸附率最高，此后隨上樣濃度的增加，吸附率逐漸降低?？赡苁怯捎谏蠘右嘿|(zhì)量濃度增加使傳質(zhì)速度變慢，導(dǎo)致樹脂周圍的原花青素分子過多，使得部分原花青素未被吸附，最終導(dǎo)致樹脂的吸附率降低。故上樣質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL適宜。

圖3 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響Fig.3 The influence of the mass concentration of the sample liquid on the adsorption rate

2.4 上樣流速對AB-8樹脂吸附葡萄籽原花青素的影響

上樣流速是影響大孔樹脂吸附效率的關(guān)鍵因素，若上樣速度過快，會使原花青素吸附量減少，導(dǎo)致花青素樣品的浪費；若上樣流速太慢，雖然可以使大孔樹脂充分吸附原花青素，但耗時較長，影響效率[19]。由圖4可以看出，隨著上樣流速的增大，AB-8樹脂對原花青素的吸附率降低，說明高流速上樣時目標成分損失大，低流速可使目標成分充分吸附于樹脂。綜合考慮，選擇上樣流速1 BV/h。

2.5 洗脫劑體積分數(shù)對洗脫的影響

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增大，解析率呈先上升后下降的趨勢。乙醇濃度在10%~30%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的升高，解析率逐漸增大；當乙醇濃度為30%時，解析率最大，之后隨著乙醇濃度的增大，解析率逐漸減小，乙醇濃度為50%、60%、70%時解析率為零。有研究報道，低濃度乙醇（低于40%）可洗脫原花青素的單體及低聚體（有活性部分），40%以上的乙醇可洗脫原花青素的高聚體。同時，乙醇濃度越高，解吸液雜質(zhì)含量也越多，純度越低[19]。綜合考慮，選擇30%乙醇作為葡萄籽原花青素的洗脫劑。

圖5 洗脫劑體積分數(shù)對解析率的影響Fig.5 The influence of eluent volume fraction on resolution rate

2.6 葡萄籽原花青素回收率和純度

根據(jù)靜態(tài)實驗和動態(tài)時驗確定吸附、解吸條件，得到最佳純化工藝：上樣液pH4.0，上樣液的質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL，上樣液的流速為1.0 BV/h，洗脫液的體積分數(shù)為30%，洗脫體積4 BV，并在此條件下，平行重復(fù)實驗3次，計算原花青素的回收率和純度。經(jīng)計算吸附前葡萄籽提取物中原花青素純度為22.77%±0.32%，AB-8樹脂純化后測定純度為94.73%±0.6429%，原花青素的純度大大提高，回收率為80.55%±1.6499%。如表1所示。

表1 葡萄籽原花青素回收率及純度Table 1 Extraction rate and purity of grape seed proanthocyanidins

2.7 不同極性葡萄籽原花青素對肝癌HepG2細胞增殖的影響

不同劑量的各極性葡萄籽原花青素對肝癌HepG2細胞作用48 h后，對其增殖產(chǎn)生不同的影響。數(shù)據(jù)分析顯示，各極性組細胞的存活率與對照組比較均有顯著變化（P<0.01或P<0.001）。由表2可知，除10%乙醇組外，其余各組細胞存活率隨給藥濃度的升高而降低，劑量與藥效有很好的線性關(guān)系，抑制效果最明顯的均為200 μg/mL。與對照組比較，不同極性葡萄籽原花青素各濃度對HepG2細胞的增殖均有抑制作用，10%乙醇組低濃度作用更明顯；20%乙醇組，藥物濃度為50、100 μg/mL作用基本一致，200 μg/mL抑制作用高度顯著（P<0.001）。實驗結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素對肝癌HepG2細胞的增殖可起到抑制作用，使其存活率降低。根據(jù)文獻報道葡萄籽原花青素對多種腫瘤均有抑制作用，如可誘導(dǎo)人食管癌細胞ECA109凋亡[20]，可抑制低氧環(huán)境下鼻咽癌CNE-2Z細胞HIF-1α表達[21]，抑制骨肉瘤143B細胞[22]及MG63細胞[23]、B16黑色素瘤細胞[24]增殖，作用于結(jié)腸癌SW480和SW620細胞后，兩種細胞形態(tài)均發(fā)生明顯改變且細胞增殖能力下降、細胞周期改變、凋亡率升高[25]；聯(lián)合順鉑可促進人肺腺癌細胞A549[26]、喉癌Hep-2細胞[27]凋亡，聯(lián)合吉西他濱可抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖并促其凋亡[28]，進一步提示應(yīng)用葡萄籽原花青素研發(fā)抗癌新藥潛力極大。

表2 各極性組細胞的存活率及IC50值（±s，n=3）Table 2 Cell survival rate and IC50 value of each polarity group(±s, n=3)

表2 各極性組細胞的存活率及IC50值（±s，n=3）Table 2 Cell survival rate and IC50 value of each polarity group(±s, n=3)

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續(xù)表 2

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，植物體外抗肝癌細胞生長的天然活性成分包括多糖、黃酮、萜類、酚類等化合物[29]。當前研究顯示，病毒、宿主和環(huán)境因素之間的復(fù)雜相互作用最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生和發(fā)展[30]。關(guān)于葡萄籽原花青素抗癌方面的研究，文獻報道較多，但未見云南大理賓川葡萄籽原花青素的相關(guān)研究。本文研究了AB-8樹脂純化云南大理賓川葡萄籽原花青素，得到最佳純化工藝為上樣液pH4.0，質(zhì)量濃度6.0 mg/mL，上樣液流速1.0 BV/h，洗脫液體積分數(shù)30%，洗脫體積4 BV。此純化使葡萄籽提取物中原花青素的含量從22.77%±0.32%提高到94.73%±0.6429%，回收率為80.55%±1.6499%。純化后的不同極性葡萄籽原花青素對肝癌HepG2細胞的生長具有不同程度的抑制作用，但其抗肝癌相關(guān)機制及相應(yīng)通路的研究還未開展，后續(xù)可以深入研究。