芥菜型油菜細胞質雄性不育系WJS01A的比較鑒定

孫 植，楊 謙，胡文競，王 芳，吳江生，劉 超

(華中農業(yè)大學 國家油菜工程技術研究中心/農業(yè)農村部油菜遺傳育種重點實驗室，武漢 430070)

利用細胞質雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)生產雜交種是作物雜種優(yōu)勢利用的主要途徑之一，可顯著提高作物的產量[1-2]。植物CMS一般是由線粒體基因組重排產生異常嵌合基因導致的，嵌合基因編碼的多肽進一步影響了花粉的正常發(fā)育[3]。油菜(BrassicanapusL.)是中國乃至世界上最重要的油料作物之一，加強油菜雜種優(yōu)勢利用將有利于中國油菜產業(yè)的發(fā)展，進而保障中國食用油供給安全[4-5]。目前，在油菜中已被發(fā)現(xiàn)的細胞質雄性不育類型有10多種，譬如ogu、pol、nap、shan2A、Nca、Nsa、hau和inap等[6]。盡管它們中部分已實現(xiàn)三系配套[7-13]，但是僅有pol CMS和ogu CMS在油菜生產上大規(guī)模應用[14]。目前中國油菜雜交種配制仍然以pol CMS為主，ogu CMS在歐洲和北美等地的油菜雜交種生產中得到廣泛應用[15]，但是因專利問題，導致其在中國的應用受到限制。目前中國在油菜雜種優(yōu)勢上已經(jīng)形成了細胞質單一化的局面，油菜品種的遺傳基礎越來越狹窄，對油菜的安全生產存在潛在威脅[16]。因此創(chuàng)建新型優(yōu)良胞質不育類型，并獲得其配套的保持系和恢復系，對豐富油菜遺傳基礎，選育高產優(yōu)質油菜新品種具有重要的現(xiàn)實意義。

WJS01A是利用本課題組在芥菜型油菜(Brassicajuncea)農家品種‘玉溪高棵’中發(fā)現(xiàn)的天然雄性不育株育成的細胞質雄性不育系[17]。進一步通過回交轉育獲得了甘藍型油菜遺傳背景的不育系WNJ01A，同時在WNJ01A與白菜(Brassicarapa)遠緣雜交后代中選育獲得了恢復系‘Hui01’，該恢復系可以完全恢復WNJ01A的育性。本研究對WJS01A進行細胞學、形態(tài)學、遺傳學和分子生物學鑒定，研究結果將有助于揭示其敗育機制，為該不育系在油菜育種中的應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究所用實驗材料均列于表1，其中NRO4270A是我們在蘿卜甘藍(Raphanusbrassica, RRCC)與甘藍型油菜遠緣雜交后代中發(fā)現(xiàn)的一種CMS類型[18]。實驗材料種植于華中農業(yè)大學試驗田，以及湖北省長陽縣、巴東縣和甘肅省和政縣等油菜夏季繁殖基地。

表1 實驗用到的材料

1.2 形態(tài)觀察和育性鑒定

在盛花期對不育系WJS01A及其衍生不育系WNJ01A的花粉育性開展調查，育性調查的分級標準采用楊光圣、傅廷棟[19]制定的方法，并觀察其是否存在死蕾現(xiàn)象。

1.3 恢保關系測定

在開花期選取7個恢復系以及3個甘藍型油菜常規(guī)品種，分別與WNJ01A、Pol、Ogu 和Kos進行測交，收獲F1雜種并于下一種植季種植于田間。在開花期對每個單株至少5朵花進行不少于3次的育性調查，采用育性分級標準鑒定[19]，以保證調查結果的準確性。

1.4 花藥石蠟切片

取不育系WJS01A的花蕾制作石蠟切片，具體步驟參照植物顯微技術的方法操作[20]：(1)取材和固定：在油菜開花期，取大小不同花蕾浸沒于FAA固定液(70%酒精90 mL，福爾馬林5 mL，冰醋酸5 mL)中，固定24 h；(2)染色和清洗：將固定后花蕾中的花藥剝離，加入愛式蘇木精染料進行整染4 d，用蒸餾水漂洗3～5次，每次0.5～1 h；(3)乙醇脫水：按照30%、50%、70%、85%和95%不同濃度乙醇的順序分別對材料進行逐級脫水處理1 h，再用無水乙醇脫水2次，每次1 h；(4)氯仿透明：按照20%、40%、60%和80%不同濃度氯仿分別對材料進行逐級透明處理1 h，再用氯仿處理2次，每次1 h；(5)浸蠟和包埋：加入碎蠟后在37 ℃恒溫箱中溫育2 d，隨后在金屬盒中進行逐級浸蠟，50%石蠟(48 ℃)溫育2 h，75%石蠟(53 ℃)溫育2 h；純蠟A(56 ℃)，純蠟B(56 ℃)，純蠟C(56 ℃)，每級溫育0.5～1 h；(6)切片：將包埋好的蠟塊在輪轉式切片機(KD-2508)上切片，隨后用蛋清甘油粘片和展片，并放置37 ℃烘片3 d以上；(7)脫蠟和封片：二甲苯脫蠟處理0.5～1 h后用加拿大樹膠封片，放置37 ℃烘箱烘片3 d以上。利用Nikon Ds-Ri1全自動顯微鏡對切片進行觀察并照相。

1.5 多重PCR鑒定

參考多重PCR區(qū)分油菜不同細胞質類型的鑒定方法[21]，以WJS01A、NRO4270A、Kos、Ogu和Pol等5種雄性不育材料以及衍生不育系WNJ01A DNA為模板，用等量混合的3對引物進行多重PCR，分別鑒定線粒體基因orf138、orf222/nad5c和orf224[21]。多重PCR采用的反應體系為：50 ng模板DNA，2 μL 10×PCR 緩沖液，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.4 μL dNTP(10 mmol/L)，0.5 U Taq DNA聚合酶，6 μL混合引物，添加ddH2O至20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸70 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸7 min。反應結束后，取5 μL PCR產物加5 μL上樣緩沖液，用2%的瓊脂糖凝膠電泳。100 V電壓下電泳35 min左右，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。

1.6 不同胞質類型的RFLP分析

1.6.1 基因組DNA的提取和酶切取WJS01A、Pol、Ogu、Kos和NRO4270A的新鮮葉片5g，采用CTAB方法[22]提取總DNA。用EcoRI和BamHI(Fermentas)進行總DNA酶切，酶切體系為：15 μg模板DNA，5 μL 10× buffer，3 μL限制性內切酶(10 U/μL)，添加ddH2O至50 μL。在37 ℃條件下過夜酶切，然后加入1/10體積的上樣緩沖液終止酶切反應。

1.6.2 電泳與轉膜將酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳(電壓35 V)20 h 后，轉移凝膠至0.25 mol/L HCl中處理10 min，直至溴酚藍變?yōu)辄S色(脫嘌呤)；蒸餾水漂洗后用0.4 mol/L的NaOH處理10 min，重復1次(30 min)后再用蒸餾水漂洗；然后用0.4 mol/L NaOH轉膜緩沖液將凝膠DNA轉移到Hybond N+尼龍膜上；最后用2×SSC溶液漂洗尼龍膜20 min，于80 ℃烘箱中烘烤2 h后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 探針的制備與標記根據(jù)已知的油菜線粒體全基因組序列[23]，利用軟件Primer 3.0設計atp1、atp6、atp9和cox1等4對線粒體引物(表2)。通過PCR擴增得到探針后用DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrep)回收探針DNA。標記探針采用隨機引物法，先將2.0 μL探針添加11.0 μL ddH2O，沸水處理5 min；冰浴5 min后，依次加入2.5 μL 10×buffer，2.5 μL dNTPs(-dCTP)，1.0 μL Klenow Fragment，2.0 μL隨機引物，2.0 μL[α-32P]dCTP(10Ci/μL)，置于37 ℃水浴2～4 h；沸水變性10 min后，置于冰上備用。

表2 用于RFLP的線粒體探針引物

1.6.4 探針雜交與放射自顯影將已標記的探針加入65 ℃預熱的300 μL預雜交液，放入雜交爐中，65 ℃條件下與尼龍膜雜交12～16 h；取出尼龍膜，用30 mL洗膜液A(2×SSC、0.1% SDS)，洗膜8～10 min，重復2次；再用洗膜液B(0.5×SSC、0.1% SDS、65 ℃預熱)洗膜30 min，重復2次。將雜交尼龍膜壓在磷屏(Fujifilm BAS-MS 2025)上處理6～8 h，然后用多功能成像系統(tǒng)(Fujifilm FLA-9000)掃描磷屏檢測雜交結果。

2 結果與分析

2.1 WJS01A花器官形態(tài)觀察及育性鑒定

對不育系WJS01A及正常芥菜型油菜3340花序和花器官進行觀察發(fā)現(xiàn)，它們的花序結構差異不大，然而對于花器官，WJS01A的花蕾相較于3340略顯瘦小，且它的花朵張開度、花瓣長度和寬度略小于3340(圖1, A、B)。WJS01A的雌蕊發(fā)育正常，柱頭高于雄蕊，花絲縮短，花藥變小、白化且表面無花粉(圖1, C)。而3340的柱頭稍低于花藥，且花絲粗壯，花藥飽滿，表面布滿大量黃色花粉(圖1, D)。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)WJS01A來源的甘藍型油菜背景不育系WNJ01A花器官的花絲短小，且花藥呈現(xiàn)不同程度的白化并縮小為三角狀[17]。

為鑒定WJS01A不育表型對環(huán)境的敏感性，連續(xù)多年多代(2010—2021)對其了進行育性調查。結果表明WJS01A的不育性穩(wěn)定，在湖北省武漢市、長陽縣、巴東縣和甘肅省和政縣種植的不育系WJS01A育性標準為0級，不受環(huán)境條件的影響，不育率和不育度均為100%，且無死蕾現(xiàn)象。

2.2 恢保關系的分析

在開花期，將7個恢復系(25cc1、9A001C、7-5、91-恢5900、‘恢5148’、298033和Hui01)以及3個甘藍型油菜品種(‘華雙4號’、‘華油8號’和‘中雙9號’)，分別與WNJ01A、Pol、Ogu、Kos進行測交，鑒定F1的育性。結果表明：91-恢5900、7-5、‘恢5148’和298033只能恢復Pol的育性，表明Pol與WNJ01A、Ogu、Kos有不同的恢保關系；恢復系25cc1、9A001C均能恢復Ogu和Kos的育性，卻不能恢復WNJ01A和Pol的育性，說明Ogu和Kos恢保關系相同[18]，但與WNJ01A和Pol有不同的恢保關系；同樣地，Hui01只能恢復WNJ01A的育性，卻不能恢復Pol、Ogu和Kos的育性。此外，‘華雙4號’等3個甘藍型油菜品種均不能恢復這4種不育系的育性。以上結果說明WJS01A具有與Pol、Ogu和Kos明顯不同的恢保關系(表3)。

表3 不同胞質類型恢保關系鑒定結果

2.3 芥菜型油菜不育系WJS01A的細胞學分析

通過對不育系WJS01A花蕾橫切石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，它在花藥發(fā)育的早期階段未出現(xiàn)孢原細胞和造孢細胞的形成和分化，整個花藥在表皮以內都由性質均一的細胞組成。而且4個長雄蕊和2個短雄蕊的發(fā)育形態(tài)不完全一樣，長雄蕊花藥呈長梭形，短雄蕊花藥則呈近似方形(圖2, A、C、D)。同時，觀察到花藥的藥隔維管束，沒有孢原細胞和壁細胞的形成。表皮內部充滿薄壁組織，且發(fā)生液泡化，沒有形成典型的蝶形花藥結構(圖2, B)。當花藥繼續(xù)發(fā)育時，其外形和體積均有所增大，但除藥隔維管束外，表皮以內仍保持無任何分化的薄壁細胞狀態(tài)，而且維管束的韌皮部和木質部不發(fā)達(圖2, C、D)。此外也發(fā)現(xiàn)少數(shù)材料的花藥在孢原細胞早期停止發(fā)育，但表型仍表現(xiàn)為完全敗育。由此認為，不育系WJS01A屬無花粉囊型不育系，主要特點是不能形成正常的孢原細胞進而分化出花粉囊等花藥結構，具體的敗育時期應為花藥原基到孢原細胞時期。

2.4 多重PCR結果分析

利用多重PCR對WJS01A、NRO4270A、Kos、Ogu和Pol 等雄性不育材料以及WJS01A來源不育系WNJ01A進行鑒定和區(qū)分。結果顯示(圖3)，常規(guī)‘華雙5號’僅在1 000 bp左右處存在特異條帶。而Ogu和Kos胞質則在500 bp和1 000 bp左右存在特異條帶的組合；NRO4270A胞質僅在500 bp左右處有一條特異條帶，且與Ogu和Kos胞質的特異條帶之一相同。Pol胞質在750 bp左右有一條特異條帶，在500 bp左右有一條較淡的條帶。

正常的芥菜型油菜3340在500 bp左右和1 000 bp左右處有2條較淡的條帶。WJS01A和WNJ01A胞質的擴增結果與3340相同。從以上結論可以看出多重PCR標記可以將WJS01A與其他不育胞質類型的材料進行區(qū)分，但不能與正常的芥菜型油菜進行區(qū)分。

2.5 WJS01A線粒體基因組RFLP分析

利用atp1、atp6、atp9、cox1與限制性內切酶EcoR I和BamH I組成的8種探針/酶組合，對不同油菜不育胞質類型的線粒體基因組進行RFLP分析，結果顯示(圖4)，在所有探針/酶組合中WJS01A與Ogu、Pol、Kos、NRO4270A不育胞質類型存在著顯著不同數(shù)目或大小的條帶。其中，在atp9/BamH I探針/酶組合中，盡管WJS01A與Kos、Ogu和Pol存在2條相似條帶，但WJS01A仍存在另外1條特異條帶(圖4, F)。因此，這些細胞質類型材料的線粒體基因組間存在著顯著的差異，而以上的探針/酶組合可以明顯地區(qū)分WJS01A與其他不育類型，說明WJS01A是一種不同于Ogu、Pol、Kos、NRO4270A的胞質類型。

3 討 論

本研究中細胞質雄性不育系WJS01A來源于芥菜型油菜農家品種中的天然不育株，該不育類型在不同的生態(tài)壞境下均表現(xiàn)為徹底敗育，不受光照和溫度的影響，且無死蕾現(xiàn)象。由此表明將WJS01A在育種上利用可以解決部分油菜不育胞質類型在雜交種制種中存在的微粉問題。

利用細胞生物學方法探究雄性不育花藥敗育過程中重要的結構變化，有助于對不育基因調控花粉敗育發(fā)生機制的解析[24]。WJS01A花藥發(fā)育的細胞學研究結果顯示，在花藥發(fā)育早期階段無孢原細胞和造孢細胞的形成與分化，同時，少數(shù)材料的花藥在孢原細胞早期出現(xiàn)異常發(fā)育。因此，WJS01A敗育時期為花藥原基到孢原細胞時期。Pol花藥敗育時期為孢原細胞分化期[25]，而Ogu敗育大多受阻于小孢子四分體至單核花粉時期[26]。與Pol和Ogu相比，WJS01A在花藥發(fā)育上有明顯的不同，因此它是不同于Pol和Ogu的一種不育胞質類型。此外，研究發(fā)現(xiàn)WJS01A與另外3種同屬芥菜型油菜來源的不育系hau、歐新A和orf220-type在花器官形態(tài)和花藥敗育特征均有差異[27-29]。其中，hau的不育性由不育基因orf288控制[30]，它的雄蕊退化為花瓣狀，且其敗育關鍵時期是雄蕊原基分化期[27]；歐新A的不育性由不育胞質和核內1對隱性基因控制，它的花蕾表現(xiàn)為“突柱段”的柱頭外露[31]；orf220類型不育系受線粒體基因orf220控制，它的雄蕊退化為瓣狀和心皮狀等不同變異類型[29]。同時，我們的研究觀察發(fā)現(xiàn)WJS01A的花藥維管束不發(fā)達，這與前人在大量雄性不育材料中發(fā)現(xiàn)維管束組織異常的現(xiàn)象相一致[32]。

植物細胞質雄性不育通常是由線粒體基因組重排產生的異常嵌合基因導致的，不同敗育胞質類型往往具有其特異的異常嵌合基因，因而不同胞質類型間的敗育機理存在著較大的差異[3]。本研究利用線粒體基因多重PCR方法對WJS01A、NRO4270A、Kos、Ogu和Pol等雄性不育材料以及WJS01A甘藍型油菜背景不育系WNJ01A進行鑒定和區(qū)分。結果表明多重PCR標記可以將WJS01A與其他不育胞質類型區(qū)分開，但卻無法和正常的芥菜型油菜進行區(qū)分，證實了該WJS01A與orf138、orf222/nad5c和orf224不育基因并無關聯(lián)，但他與正常芥菜型油菜線粒體基因組之間依然存在高度同源，因此需進一步篩選特定多重PCR標記方可區(qū)分兩者之間的差異。此外，利用RFLP對WJS01A及Pol、Ogu、Kos和NRO4270A等不育材料的線粒體基因組進行分析，檢測結果顯示在所有的探針/酶組合中，WJS01A在條帶數(shù)量和大小上均顯示出與其他4種不育胞質類型的顯著差異。以上結果說明不育系WJS01A與其他不育胞質類型的線粒體基因組存在顯著變異，是一種不同的油菜細胞質雄性不育胞質類型。WJS01A細胞質不育類型的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了中國油菜細胞質雄性不育類型，而且將有利于拓寬目前油菜雜種優(yōu)勢利用的遺傳基礎。