福建云霄地方茶樹品種資源生化成分特征分析與評(píng)價(jià)

陳瀟敏，趙 峰，金 珊，吳文晞，王鵬杰，葉乃興*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2 福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福州 350122；3 福建恒正檢測(cè)技術(shù)有限公司，福州 350100)

茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]種質(zhì)資源是茶樹品種選育和茶樹生物學(xué)基礎(chǔ)研究的原始材料，也是茶樹種質(zhì)創(chuàng)新、生產(chǎn)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]，兒茶素、生物堿、茶氨酸等成分優(yōu)異茶樹資源的挖掘、篩選是茶樹育種的重要目標(biāo)[2]。云霄位于福建東南部，屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，地形多丘陵、低山，地貌多花崗巖露巖，具有悠久的茶葉種植和制作歷史[3]，該地區(qū)野生茶樹資源豐富，主要分布于云霄縣火田鎮(zhèn)白石村大帽山、小帽山、小尖山及周邊山地，總面積在100 hm2以上[4-6]。特別是近年在該地區(qū)發(fā)現(xiàn)了野生禿房茶樹群體種，相關(guān)的形態(tài)學(xué)調(diào)查也表明，該地區(qū)野生茶樹體高大，葉色、葉片大小、花果等性狀各異，且茶樹分布規(guī)律，屬有性系群體[7-8]。

兒茶素、嘌呤生物堿、氨基酸組分是茶樹品種鮮葉中的最主要的生化成分，其組分構(gòu)成及含量決定了茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣以及適制性，從而決定了茶樹資源的開發(fā)利用價(jià)值，兒茶素、生物堿、茶氨酸等生化成分特異茶樹品種是今后茶樹育種的主要目標(biāo)之一[9]。近年來在茶樹生化成分特異資源的篩選、評(píng)價(jià)鑒定已取得顯著進(jìn)展[10-11]，但是高含量的表沒食子兒茶素-3-O-甲基-沒食子酸酯(EGCG3″Me)、苦茶堿等特異茶樹種質(zhì)資源尚待進(jìn)一步挖掘。本課題組對(duì)采集自福建省云霄縣地方茶樹資源聚集度較高的南烏山、梁山和小帽山，3個(gè)區(qū)域內(nèi)共23份云霄縣地方茶樹資源的兒茶素、嘌呤生物堿和氨基酸組分進(jìn)行了分析，旨在挖掘出優(yōu)特異茶樹種質(zhì)資源，為茶樹品種創(chuàng)新和特異資源的創(chuàng)新利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料于2021年3月采集福建省云霄縣23份茶樹品種資源的一芽二葉鮮葉,參試茶樣信息見表1。采用液氮固樣，以干冰保存并轉(zhuǎn)運(yùn)至福建農(nóng)林大學(xué)茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，冷凍干燥后粉碎過60目篩。

表1 23份云霄地方茶樹品種資源信息

1.1.2 儀器與設(shè)備UltiMate 3000 高效液相色譜儀(美國，賽默飛世爾科技公司)，C18反相色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)(中國，廣州菲羅門公司)；NexeraX2 LC-30A高效液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)，串聯(lián)Sciex 4500 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國，Sciex公司)；C18反相色譜柱(2.6 μm，2.1×100 mm)(中國，廣州菲羅門公司)；AB204-N分析天平(美國，梅特勒公司)；超純水系統(tǒng)(中國，Medium Touch，上海和泰儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 兒茶素組分測(cè)定方法采用高效液相色譜法，參照王麗麗等[12]方法稍作修改，具體步驟如下：

色譜條件：流動(dòng)相A為0.2%甲酸-水溶液(v∶v)，流動(dòng)相B為甲醇；流速，1.00 mL/min；柱溫，40 ℃；進(jìn)樣量，10 μL。梯度洗脫條件，0～2 min，88% A；2～10 min，88%～75% A；10～15 min，75%～73% A；15～25 min，73%～68% A；25～30 min，68% A；30～32 min, 68%～88% A。前處理方法：分別稱取0.200 g樣品，分別加入30 mL甲醇，渦旋，超聲提取30 min，冷卻后于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜。

1.2.2 嘌呤生物堿組分測(cè)定方法參照陳瀟敏等[13]，采用液質(zhì)聯(lián)用方法測(cè)定。

1.2.3 氨基酸組分測(cè)定方法按照Zhou等[14]，采用AQC衍生液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

9種兒茶素標(biāo)品：表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methylgallate)，EGCG3″Me]、兒茶素(catechin, C)、表兒茶素(epicatechin, EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallicacid, EGCG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)、沒食子兒茶素(gallocatechin, GC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate, GCG)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate, CG)；4種嘌呤生物堿標(biāo)品：咖啡堿(caffeine, CAF)、可可堿(theobromine, TB)、苦茶堿(theacrine, TC)、茶堿(theophylline, TP)；33種氨基酸標(biāo)品：丙氨酸(alanine, Ala)、α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid, α-ABA)、β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid, β-ABA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)、精氨酸(arginine, Arg)、天冬氨酸(aspartic acid, Asp)、瓜氨酸(citrulline, Cit)、羥脯氨酸(hydroxyproline, Hy-pro)、胱氨酸[cystine,(Cys)2]、組氨酸(histidine, His)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、羥賴氨酸(hydroxylysine, Hy-Lys)、異亮氨酸(isoleucine, Ile)、亮氨酸(leucine, Leu)、賴氨酸(lysine Lys)、蛋氨酸(methionine, Met)、1-甲基-L-組氨酸(1-methyl-L-histidine, 1-M-His)、3-甲基-L-組氨酸(3-methyl-L-histidine, 3-M-His)、鳥氨酸(ornithine, Orn)、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)、脯氨酸(proline, Pro)、肌氨酸(sarcosine, Sar)、絲氨酸(serine, Ser)、蘇氨酸(threonine, Thr)、色氨酸(tryptophan, Trp)、酪氨酸(tyrosine, Tyr)、纈氨酸(valine, Val)、天冬酰胺(asparagine, Asp)、半胱氨酸(L-cysteine, Cys)、茶氨酸(theanine, Thea)、谷氨酰胺(glutamine, Gln)、谷氨酸(glutamic acid, Glu)、甘氨酸(glycine, Gly)，均購于源葉生物科技有限公司(中國，上海)，純度均大于98%。色譜純甲醇(中國，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；色譜純乙腈(中國，上海默克化工技術(shù)有限公司)，色譜純甲酸(中國，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。甲酸銨(中國，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 云霄地方茶樹品種資源兒茶素組分分析

本研究測(cè)定了9種主要兒茶素，即EGC、C、EGCG、EC、EGCG3″Me、ECG、GC、GCG和CG，其中GC、GCG和CG在23份資源中均未檢測(cè)(圖1)；其余的6種兒茶素組分在23份茶樹種質(zhì)中的平均含量分別為16.00、1.86、104.55、4.64、14.23和19.17 mg·g-1(表2)。23份茶樹品種資源中，兒茶素總量在73.54～260.31 mg·g-1，其中，EGCG的含量最高，EC和C在不同品種資源中含量均較低。另外，在23份云霄地方茶樹品種資源中均檢測(cè)到EGCG3″Me，其最大值為33.65 mg·g-1，均值大于10 mg·g-1，說明云霄地方茶樹群體蘊(yùn)含豐富的EGCG3″Me資源。由表2還可知，23份茶樹品種資源中，兒茶素各組分含量及總量等7個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)在31.46%～109.75%，變異范圍較大，其中C含量的變異系數(shù)最大。遺傳多樣性指數(shù)(H′)在1.27～1.99，其中EGC、EC的遺傳多樣性指數(shù)較高。

表2 23份云霄地方茶樹品種資源兒茶素含量的分布特征和變異情況

23份云霄地方茶樹品種資源的兒茶素指數(shù)(CI)如圖2所示。前人研究報(bào)道福建地區(qū)的兒茶素指數(shù)較低，而云南地區(qū)的兒茶素指數(shù)較高，可能是因?yàn)楦＝ú铇滟Y源EGCG含量較高，從而導(dǎo)致CI值低。從圖中可以看出，該地區(qū)的茶樹資源CI值均低于0.5，最高為L02(0.26)，這一結(jié)果與前人研究相一致。

2.2 云霄地方茶樹品種資源嘌呤生物堿組分分析

在23份茶樹品種資源中，均未檢測(cè)出茶堿，部分茶樹品種資源中含有可可堿和苦茶堿(圖3)?？Х葔A、苦茶堿、可可堿及嘌呤生物堿總量的分布范圍分別在14.59～46.45、0.00～33.50、0.00～1.69和15.28～70.42 mg·g-1，平均含量分別為32.58、7.63、0.73和40.95 mg·g-1(表3)?？Х葔A和嘌呤生物堿總量的變異系數(shù)均小于30%，而苦茶堿的變異系數(shù)最大，為161.16%。各組分的遺傳多樣性指數(shù)(H′)為1.15～2.07，其中可可堿和總量均大于2.00，說明其具有較高的多樣性。

表3 23份云霄地方茶樹品種資源嘌呤生物堿含量的分布特征和變異情況

在栽培茶樹品種中，嘌呤生物堿的分布模式主要是以咖啡堿為主，含有少量的可可堿和微量的茶堿?？嗖鑹A僅在部分苦茶中含有。本研究的23份云霄地方茶樹品種資源中，南烏山及小帽山地區(qū)僅有4份資源檢出苦茶堿，且含量均低于10 mg·g-1(X01除外)，而在梁山地區(qū)的茶樹品種資源(L01～L06)均檢測(cè)出苦茶堿，且含量均高于10 mg·g-1(L05除外)。L06和L07的苦茶堿含量高于其咖啡堿含量，其嘌呤生物堿模式異于普通茶樹，可作為苦茶堿形成機(jī)理研究及特異資源育種材料(圖4)。

2.3 云霄地方茶樹品種資源游離氨基酸構(gòu)成分析

茶氨酸(Thea)是茶樹鮮葉中的主要氨基酸，其與谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)均為鮮味氨基酸。在23份茶樹種質(zhì)中，這3種物質(zhì)的平均值分別為12.74、1.55和0.66 mg·g-1，變異系數(shù)均大于66%。丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和蘇氨酸(Thr)為甜味氨基酸，在23份茶樹品種資源中平均值分別為0.45、0.20和0.35 mg·g-1?？辔栋被崛缋野彼?Tyr)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)和異亮氨酸(Ile)含量較高，除了異亮氨酸(Ile)，其余3個(gè)組分含量平均值均超過了0.3 mg·g-1。不同氨基酸組分變異系數(shù)差異較大，其中天冬酰胺(Asn)、甘氨酸(Gly)、β-氨基丁酸(β-ABA)、谷氨酰胺(Gln)和精氨酸(Arg)的變異系數(shù)均超過了100%。可見，云霄地方茶樹品種資源的氨基酸組分存在豐富變異(表4)。

表4 23份云霄地方茶樹品種資源氨基酸含量的分布特征和變異情況

2.4 不同區(qū)域云霄地方茶樹品種資源滋味物質(zhì)成分分析

為探究云霄不同區(qū)域茶樹品種資源之間的差異物質(zhì)，我們以6種兒茶素組分、3種嘌呤生物堿及20種氨基酸為指標(biāo)，進(jìn)行單因素方差分析，篩選獲得影響不同區(qū)域云霄地方茶樹品種資源滋味物質(zhì)的差異物質(zhì)。結(jié)果如圖5所示，29種物質(zhì)在3個(gè)類群中有16種物質(zhì)含量存在極顯著差異，如EGC、EC、EGCG3″Me、苦茶堿(TC)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)，而EGCG、咖啡堿(CAF)、茶氨酸(Thea)等13種物質(zhì)含量在3個(gè)類群中無顯著差異。以各類群的EGCG3″Me、苦茶堿(TC)、酪氨酸(Tyr)及丙氨酸(Ala)含量數(shù)據(jù)繪制箱型圖(圖6)可知，小帽山茶樹資源的EGCG3″Me及酪氨酸(Tyr)含量極顯著高于其他2個(gè)類群，而梁山茶樹資源的苦茶堿(TC)及纈氨酸(Val)含量極顯著高于其他2個(gè)類群，南烏山茶樹資源的4種物質(zhì)含量均為最低。

偏最小二乘法判別分析(PLS-DA,partial least squares discriminant analysis)是一種常用來處理分類和判別問題的方法，能夠較為直觀地區(qū)分組間差異。對(duì)不同生長區(qū)域云霄地方茶樹品種資源的主要滋味成分進(jìn)行sPLS-DA分析，以貢獻(xiàn)率最高的兩個(gè)主成分為橫縱坐標(biāo)軸繪制各類群的得分圖(圖7)。從圖中可以看出，云霄不同區(qū)域的茶樹品種資源在滋味成分上具有較大差異。梁山和小帽山地區(qū)的茶樹資源沒有完全分開，而南烏山地區(qū)的茶樹資源與其他兩個(gè)區(qū)域完全分開。該結(jié)果說明，梁山和小帽山地區(qū)的茶樹資源品質(zhì)構(gòu)成較為相近，而南烏山地區(qū)與前二者間存在較為明顯的差異。

以23份云霄地方茶樹品種資源的29種物質(zhì)含量繪制聚類熱圖(圖8)，從圖中可以看出不同區(qū)域的云霄地方茶樹品種資源在生化成分上都具有各自的特點(diǎn)。如圖中區(qū)域1為南烏山茶樹資源高含量的生化成分，主要是氨基酸組分，如丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)。區(qū)域2展示了梁山較高含量的組分，如天冬酰胺(Asn)、賴氨酸(Lys)等氨基酸組分，除此之外，梁山茶樹資源還具有高含量的苦茶堿(TC)。區(qū)域3為小帽山茶樹資源的高含量組分，主要是兒茶素組分，如EGC、EGCG、EGCG3″Me、ECG等，除此之外，咖啡堿(CAF)在該類群也具有較高的含量。

2.5 云霄地方茶樹優(yōu)異資源的篩選

根據(jù)生化成分測(cè)定結(jié)果，參照王新超等[16]的茶樹優(yōu)異資源篩選指標(biāo)，從23份云霄地方茶樹品種資源中篩選出一批生化成分特異的品種資源(表5)，包括5份高兒茶素茶樹資源，2份高EGCG茶樹資源、6份高EGCG3″Me茶樹資源、2份高嘌呤生物堿茶樹資源、2份高苦茶堿資源和1份高茶氨酸茶樹資源。

表5 云霄地方茶樹優(yōu)異資源的篩選

3 討 論

3.1 云霄地方茶樹品種資源總體生化成分特征

云霄地方茶樹品種資源中兒茶素組分均以EGCG、ECG和EGC為高含量組分,其中EGCG含量最高，這與前人的研究結(jié)果一致[12,16]。研究表明，中國茶樹種質(zhì)具有豐富的多樣性，但中國茶樹種質(zhì)的整體兒茶素指數(shù)(CI)較低，除云南茶樹資源的CI大于0.5，其他地區(qū)的茶樹種質(zhì)資源的CI值均不足0.5[17]。本研究結(jié)果顯示，云霄地方茶樹品種資源的CI值也較低，最大值僅為0.26。EGCG3″Me(表沒食子兒茶素-3-O-甲基-沒食子酸酯)是茶葉中一種天然被修飾的兒茶素物質(zhì)，相較于EGCG,它的抗過敏和消炎等藥理作用更強(qiáng)，尤其是花粉過敏反應(yīng)的抑制效果極佳[18-20],但是目前中國發(fā)現(xiàn)天然含有EGCG3″Me的茶樹并不多[21-23]，而在云霄地方茶樹群體中均檢測(cè)到了EGCG3″Me，且部分資源含量較高，如小帽山3號(hào)(X03)含量高達(dá)33.65 mg·g-1。這也為茶樹中甲基化兒茶素的積累及分子研究提供了試驗(yàn)材料。

云霄地方茶樹品種資源中嘌呤生物堿組分含量及構(gòu)成與普通茶樹相一致，以咖啡堿為主要嘌呤生物堿，含有少量的可可堿，均未檢測(cè)到茶堿。而在部分資源中檢測(cè)到了苦茶堿，其中梁山1號(hào)(L01)和梁山6號(hào)(L06)苦茶堿含量大于30 mg·g-1。迄今為止，含有苦茶堿的野生茶樹資源研究集中于福建、廣東、貴州、云南、江西等地區(qū)[23-28]，福建高苦茶堿茶樹種質(zhì)資源豐富，‘梁山1號(hào)’和‘梁山6號(hào)’的發(fā)現(xiàn)，可為高苦茶堿茶樹品種培育及開發(fā)利用提供茶樹資源材料。

云霄地方茶樹品種資源中氨基酸組分種類豐富，不同滋味的氨基酸種類均有檢出。氨基酸組分是茶葉滋味和香氣形成的重要前體物質(zhì)，其組分的多樣性為云霄高香優(yōu)質(zhì)茶葉產(chǎn)品的加工制作奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。該群體中的梁山6號(hào)(L06)屬于高茶氨酸特異資源。

3.2 不同區(qū)域的云霄地方茶樹種質(zhì)資源生化成分特點(diǎn)

魏沙沙等[29]對(duì)自然分布的尤溪4個(gè)區(qū)域(赤墓村、光明村、丘山村、赤墓村非保護(hù)區(qū))37份苦茶單株進(jìn)行主要滋味物質(zhì)檢測(cè)，結(jié)果表明4個(gè)區(qū)域均有各自特征，其中赤墓村苦茶苦味程度較高，酯型兒茶素以及可可堿含量較高；光明村苦茶苦味最低，丘山村苦茶的賴氨酸等含量較高，赤墓村非保護(hù)區(qū)群體的鮮味氨基酸如天冬氨酸含量更高。本研究發(fā)現(xiàn)云霄南烏山、梁山、小帽山3個(gè)區(qū)域的茶樹資源也具有明顯的區(qū)域特點(diǎn)。梁山茶樹資源均含有苦茶堿(TC)，且部分茶樹資源含量較高，如‘梁山1號(hào)’(L01)和‘梁山6號(hào)’(L06)，苦茶堿含量均超過30 mg·g-1。小帽山茶樹資源兒茶素組分較為特異，ECGC和EGCG3″Me含量較高。高EGCG3″Me含量的茶樹種質(zhì)資源的分布具有一定的區(qū)域性特征。研究發(fā)現(xiàn)廣東和福建兩省含有EGCG3″Me的茶樹種質(zhì)資源較多，高于云南等地[30]。南烏山茶樹資源表現(xiàn)為某些氨基酸組分如丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)含量較高。區(qū)域特色的形成與區(qū)域間的地理位置、環(huán)境差異密切相關(guān)，具體形成機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。茶樹資源的區(qū)域特色性為當(dāng)?shù)夭枞~資源利用及加工提供了一定的理論基礎(chǔ)。

致謝：本研究實(shí)驗(yàn)樣品采集承蒙云霄縣茶葉科學(xué)研究會(huì)王彩云、方德音、蔡捷英、王金煥等各位老師，漳州仙隱峰茶葉有限公司張木山董事長、福建省顧恒生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司張英豪董事長的大力支持，特此致謝！