黃芩清熱除痹膠囊HPLC指紋圖譜初步研究及3個成分含量測定

劉劍橋，劉曉闖，劉健，張艷艷，王團結(jié)，周安

黃芩清熱除痹膠囊為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有清熱利濕、通絡(luò)除痹之效，臨床用于治療濕熱痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1]，療效確切。本文通過對其進行指紋圖譜[2]初步研究，并建立黃芩苷、黃芩素、梔子苷 3 個指標成分 HPLC 含量測定方法[3-4]，為其制劑工藝及質(zhì)量控制研究提供參考[5]，提高制劑質(zhì)量控制水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 Agilent 1260 高效液相色譜儀和Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）色譜柱購自美國 Agilent 公司；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；CP225D 型十萬分之一電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.2 藥品與試劑 黃芩清熱除痹膠囊由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；黃芩苷（批號：24512-63-8）、黃芩素（批號：491-67-8）和梔子苷（批號：21967-41-9）均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇均為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 供試品溶液制備 取膠囊內(nèi)容物約 0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 50% 甲醇 25 ml，超聲處理 30 min，放冷，濾過。置 25 ml 量瓶中，加 50% 甲醇至刻度，搖勻，即得。

1.2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取梔子苷、黃芩苷、黃芩素適量，置于 5 ml 容量瓶中，分別用甲醇定容，得單一對照品溶液，濃度分別為 1.824、1.063、2.042 mg/ml。精密移取各單一對照品溶液 1 ml 于 10 ml 容量瓶中，甲醇定容，得混合對照品溶液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈- 0.1% 甲酸水溶液；流速：1.00 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μl；檢測波長：238 nm。

采用梯度洗脫進行洗脫，梯度設(shè)置見表1。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 指紋圖譜及共有模式的建立 將 S1 ～ S12 共 12 個批次供試品溶液，進樣檢測，數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版）分析，利用中位數(shù)法，時間窗為 0.1 min，生成 12 個批次黃芩清熱除痹膠囊下的指紋圖譜共有模式（圖1）。

圖1 12 批次黃芩清熱除痹膠囊共有模式下的指紋圖譜及對照譜圖（R：對照譜）

2.1.2 共有峰的指認 將黃芩清熱除痹膠囊提取物色譜圖與對照品色譜圖比對，指認出 3 個對應(yīng)色譜峰，分別為梔子苷、黃芩苷、黃芩素（圖2）。

圖2 黃芩清熱除痹膠囊提取物及對照品色譜圖（1：梔子苷；2：黃芩苷；3：黃芩素；A：供試品溶液；B：混合對照品溶液）

2.1.3 指紋圖譜相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版），將各批次樣品色譜圖與對照譜圖相比對，計算相似度。12 批次的指紋圖譜與對照譜之間的相似度分別為 0.999、0.999、0.991、0.999、0.998、0.962、0.998、0.998、0.996、0.999、0.999、0.995，相似度均在 0.9 以上，說明本次研究中的 12 批次黃芩清熱膠囊與對照譜之間相似度良好，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.2 含量測定

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液各適量，進樣檢測。供試品色譜圖和混合對照品色譜圖在相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰且待測成分峰形良好、分離度均大于 1.5，理論板數(shù)以梔子苷、黃芩苷、黃芩素峰計均大于3000。

2.2.2 方法學(xué)考察

⑴對照品標準曲線：Y黃芩苷= 1096.8X + 8.2582，r= 0.9994，Y黃芩素= 1575.4X - 0.7328，r= 0.9997，Y梔子苷= 1410.2X +1.0977，r= 0.9996。 3 種物質(zhì)分別在 0.3796 ～ 0.7593、0.0438 ～ 0.7875、0.0557 ～ 1.0029 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合定量檢測要求。

⑵定量限與檢測限：梔子苷、黃芩苷、黃芩素的檢測限分別為 1.570、0.308、2.042 μg/ml；定量限分別為 6.270、1.540、18.677 μg/ml。

⑶精密度：梔子苷、黃芩苷、黃芩素峰面積 RSD 分別為 1.29%、2.50%、0.67%（n = 5），儀器精密度良好。

⑷穩(wěn)定性：梔子苷、黃芩苷、黃芩素峰面積 RSD 分別為 1.85%、1.70%、1.11%（n = 5），供試品溶液在 24 h 內(nèi)有著良好的穩(wěn)定性。

⑸重復(fù)性：梔子苷、黃芩苷、黃芩素峰面積 RSD 分別為 2.71%、1.51%、1.15%（n = 5），方法重復(fù)性好。

⑹加樣回收率：梔子苷、黃芩苷、黃芩素平均回收率分別為 97.7%、99.5%、101.9%，RSD 分別為 1.21%、2.39%、2.34%（n = 5）。

2.2.3 樣品含量測定 精密稱取 12 批次的黃芩清熱除痹膠囊，按照“1.2.1.1”項下方法，制成供試品溶液，測定樣品中的梔子苷、黃芩苷、黃芩素 3 種成分含量，結(jié)果見表2。

表2 12 批次黃芩清熱除痹膠囊提取物中3 種成分含量（%）

3 討論

本研究建立了 12 批次黃芩清熱除痹膠囊的 HPLC 指紋圖譜，相似度分析符合要求，同時測定了 3 種指標成分黃芩苷、黃芩素、梔子苷的含量，為其制劑工藝研究及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

由于黃芩清熱除痹膠囊的現(xiàn)行提取工藝為傳統(tǒng)水提工藝，而組方中藥所含多種活性成分為脂溶性成分。如黃芩苷、黃芩素、苦杏仁苷及薏苡仁油等成分水溶性差，是其色譜指紋圖譜色譜峰信息不豐富的主要原因，在下一步研究工作中，擬結(jié)合指紋圖譜研究、藥效學(xué)實驗對其提取溶媒及工藝進行優(yōu)化。