以藜麥為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵工藝

陳櫻之，劉紅梅，呂晴，蔡倩倩，肖萍,2*

1. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院（天津 300392）；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心（天津 300392）；3. 黃河三角洲京博化工研究院有限公司（濱州 256500）

藜麥原產(chǎn)于南美洲，是一種營養(yǎng)全面的偽谷物。其蛋白質(zhì)含量高于普通谷物，氨基酸組成合理，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白[1-2]；且富含人體所必需的ω-3和ω-6等多種不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)營養(yǎng)素[3]。隨著雜糧產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展及深入研究，其“綠色、天然、營養(yǎng)”等特性被廣大消費(fèi)者熟知。但是，國內(nèi)藜麥產(chǎn)品多為初加工，主要是藜麥米，其他深加工產(chǎn)品較少[4]。

紅茶菌，又稱康普茶，是以茶、糖、水為原料，經(jīng)過酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等多種微生物共同發(fā)酵形成的發(fā)酵飲品[5]。紅茶菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生很多對人體有益的物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、降血脂等保健功效[6-8]。在以往研究中基本都是以茶葉為發(fā)酵基質(zhì)并對其發(fā)酵產(chǎn)品的功能特性進(jìn)行研究。隨著研究的不斷深入，其基質(zhì)呈現(xiàn)出多樣式選擇，如咖啡豆提取液、橡樹樹葉、小麥草汁、蛇果、蓍草等[9-13]。但尚未應(yīng)用于藜麥發(fā)酵，這為藜麥的深加工提供了新思路。因此，試驗(yàn)將制備不同形式的藜麥發(fā)酵基質(zhì)，以紅茶菌作為菌種，確定藜麥基質(zhì)的最佳添加方式，在此基礎(chǔ)上對紅茶菌發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶（福建正山堂茶葉有限公司）；白藜麥（金昌西域神話食品有限公司）；MRS肉湯、YPD培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）；α-淀粉酶、糖化酶（天津市諾奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；LGR20-W高速冷凍離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；STARTER3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅茶菌活化

按料水比1∶150 g/mL沖泡茶水后，加入10%白砂糖溶解。冷卻后加入紅茶菌母液，于25 ℃培養(yǎng)至表面出現(xiàn)薄膜，備用。

1.3.2 指標(biāo)分析

1.3.2.1 總酚和黃酮質(zhì)量濃度測定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalten法測定發(fā)酵液總酚質(zhì)量濃度[13]；以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定發(fā)酵液黃酮質(zhì)量濃度[14]。

1.3.2.2 pH的測定

紅茶菌發(fā)酵液，以10 000 r/min離心15 min，取上清液，利用pH計(jì)測定。

1.3.2.3 微生物指標(biāo)的測定

發(fā)酵液梯度稀釋后分別涂布于醋酸菌、MRS和YPD培養(yǎng)基上，其中醋酸菌和酵母菌于30 ℃培養(yǎng)24 h，乳酸菌于37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 藜麥基質(zhì)添加形式對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

1.3.3.1 藜麥研磨液對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

稱取10%白砂糖，充分溶解后加入10%藜麥研磨粉，攪拌均勻后接種10%紅茶菌菌液，于25 ℃培養(yǎng)。

1.3.3.2 藜麥水提液對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

按料水比1∶10 g/mL沸水浸提15 min，過濾；加入10%白砂糖，冷卻后接種10%紅茶菌菌液，于25 ℃培養(yǎng)。

1.3.3.3 藜麥磨漿液對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

藜麥磨漿液的制備參考李興等[15]的方法。將磨漿液快速加熱至沸騰，加入10%的白砂糖，保溫5 min；冷卻后接種10%菌液，于25 ℃培養(yǎng)。

1.3.3.4 藜麥糖化液對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

藜麥糖化液的制備參考李貞景等[16]的方法。在糖化液中加入10%白砂糖，冷卻后接種10%菌液，于25 ℃培養(yǎng)。

1.3.4 以藜麥為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

分別選取料水比（6∶100，10∶100，14∶100和18∶100 g/mL）、加糖量（6%，8%，10%和12%）、接種量（6%，8%，10%和12%）、培養(yǎng)溫度（20，25和30 ℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.5 以藜麥為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以培養(yǎng)溫度、接種量、加糖量、料水比為考察因素，按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥基質(zhì)添加形式對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

不同藜麥基質(zhì)添加形式對發(fā)酵液中總酚、黃酮質(zhì)量濃度的影響如圖1所示。4種紅茶菌發(fā)酵液中總酚、黃酮濃度的變化趨勢相似，即總酚、黃酮質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，在第2天時質(zhì)量濃度達(dá)到最高值，之后開始逐漸下降，原因可能是發(fā)酵時間增加導(dǎo)致發(fā)酵液中的酚類、黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)被微生物利用消耗。另外，紅茶菌發(fā)酵藜麥研磨液時總酚、黃酮質(zhì)量濃度最高，其次為藜麥水提液和糖化液，藜麥磨漿液作為發(fā)酵基質(zhì)時，其總酚和黃酮質(zhì)量濃度最低。

圖1 藜麥基質(zhì)添加形式對總酚和黃酮質(zhì)量濃度的影響

紅茶菌發(fā)酵液中乳酸菌、醋酸菌和酵母菌的菌落數(shù)如圖2所示：發(fā)酵2 d時，4種發(fā)酵液中3種微生物數(shù)量均處于最高值，且醋酸菌＞乳酸菌＞酵母菌。研究證明，由茶糖水培養(yǎng)出來的紅茶菌菌液中，一般只存在極少量的乳酸菌，甚至檢測不到乳酸菌。紅茶菌發(fā)酵咖啡液時，發(fā)酵液中3種微生物數(shù)量為酵母菌＞乳酸菌＞醋酸菌[17]。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)量大于酵母菌?？梢?，由于發(fā)酵基質(zhì)的營養(yǎng)成分不同會造成發(fā)酵液中菌相結(jié)構(gòu)的差異性。

以磨漿液作為基質(zhì)發(fā)酵時醋酸菌數(shù)量最高且pH最低[圖2（d）]，由此可知，pH的變化可以直接反映醋酸菌的數(shù)量變化。同時，在發(fā)酵周期內(nèi)4種發(fā)酵液的pH均處于下降趨勢，在發(fā)酵3～4 d時隨著醋酸菌數(shù)量的降低，pH逐漸趨于平穩(wěn)。以藜麥研磨液為基質(zhì)時，其中的全部營養(yǎng)物質(zhì)可被微生物利用以供其生長，酵母菌和乳酸菌數(shù)量為最高值。而以藜麥水提液為基質(zhì)時，微生物只能利用溶于水的營養(yǎng)物質(zhì)，造成微生物數(shù)量下降。在制備磨漿液時，可能由于高溫破壞藜麥中的熱敏感物質(zhì)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量降低，影響微生物生長。而在制備糖化液時，發(fā)現(xiàn)糖化液黏度較高，導(dǎo)致溶解氧較低，影響酵母菌的有氧呼吸，造成數(shù)量的減少。有研究表明，紅茶菌發(fā)酵過程中酵母菌作為“啟動子”，在發(fā)酵初期會將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并通過進(jìn)一步糖酵解產(chǎn)生乙醇后醋酸菌開始大量繁殖，而乳酸菌也會利用酵母菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行生長繁殖[18]，由于酵母菌的減少，所以進(jìn)行糖化液發(fā)酵時醋酸菌和乳酸菌數(shù)量也較低。綜合以上結(jié)果，選擇藜麥研磨液作為紅茶菌發(fā)酵基質(zhì)。

圖2 藜麥基質(zhì)添加形式對微生物數(shù)量及pH的影響

2.2 以藜麥為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同料水比對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

如表2所示，隨著料水比升高，總酚、黃酮質(zhì)量濃度及微生物數(shù)量處于先升后降趨勢。料水比10∶100 g/mL時，除pH外，其他指標(biāo)均達(dá)到最高，隨后開始下降。pH在整個過程中一直處于上升趨勢，其原因可能是隨著料水比增加，發(fā)酵液初始pH升高，導(dǎo)致發(fā)酵后的pH也相應(yīng)比較高。綜合考慮，選擇料水比6∶100，10∶100和14∶100 g/mL進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表2 不同料水比對總酚、黃酮質(zhì)量濃度及pH、微生物數(shù)量的影響

2.2.2 不同加糖量對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

當(dāng)蔗糖添加量為6%～8%時，隨著加糖量升高，總酚、黃酮質(zhì)量濃度及酵母菌、乳酸菌、醋酸菌菌落數(shù)升高，pH降低；當(dāng)加糖量8%時，總酚、黃酮的質(zhì)量濃度達(dá)到最高，此時蔗糖含量維持較豐富水平，菌體優(yōu)先利用直接營養(yǎng)成分而減少對黃酮、總酚的分解利用，使活性成分更多被保留；當(dāng)加糖量大于8%時，菌落數(shù)開始下降，pH上升（表3）。其原因可能是糖添加過量，發(fā)酵液的滲透壓較高，從而使微生物的生長受到抑制[19]。綜合考慮，選擇加糖量6%～10%進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表3 不同加糖量對總酚、黃酮質(zhì)量濃度及pH、微生物數(shù)量的影響

2.2.3 不同接種量對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

如表4所示，隨著接種量增加，總酚、黃酮的質(zhì)量濃度和菌落數(shù)呈現(xiàn)升高趨勢，pH下降。接種量8%時，總酚、黃酮質(zhì)量濃度和微生物數(shù)量達(dá)到最高值，pH最低。接種量大于8%時，由于菌體大量生長繁殖，所需要的營養(yǎng)物質(zhì)會增多，導(dǎo)致發(fā)酵原料中的各類成分被過度分解利用，出現(xiàn)含量下降的趨勢[20]。因此，選擇接種量6%，8%和10%進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表4 不同接種量對總酚、黃酮質(zhì)量濃度及pH、微生物數(shù)量的影響

2.2.4 不同培養(yǎng)溫度對紅茶菌發(fā)酵效果的影響

如表5所示，隨著溫度升高，總酚、黃酮質(zhì)量濃度以及酵母菌、乳酸菌和醋酸菌數(shù)量逐漸增大，25 ℃時達(dá)到最高值，之后逐漸降低。

表5 不同培養(yǎng)溫度對總酚、黃酮質(zhì)量濃度及pH、微生物數(shù)量的影響

2.3 以藜麥為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果采用綜合評分法進(jìn)行分析，黃酮質(zhì)量濃度、總酚質(zhì)量濃度及微生物數(shù)量分別進(jìn)行隸屬度計(jì)算。試驗(yàn)設(shè)計(jì)總酚、黃酮的權(quán)重取40，微生物的權(quán)重取20，經(jīng)過計(jì)算得出的綜合分?jǐn)?shù)作為總指標(biāo)進(jìn)行直觀分析。由表6可知，組合D3B2A2C1的綜合分?jǐn)?shù)最高。各因素對紅茶菌發(fā)酵藜麥的影響程度依次為D＞B＞A＞C。由于表6中的試驗(yàn)6與直接分析結(jié)果一致，不需要做驗(yàn)證試驗(yàn)。因此最佳工藝為料水比14∶100 g/mL、接種量8%、溫度25 ℃、加糖量6%，此條件下發(fā)酵液中總酚和黃酮質(zhì)量濃度為0.652 mg/mL和0.233 mg/mL，乳酸菌、酵母菌、醋酸菌菌落數(shù)為6.811，6.511和7.863 lg CFU/g，微生物總量21.185 lg CFU/g。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)號 A B C D結(jié)果 綜合評分總酚質(zhì)量濃度/(mg·mL-1) 黃酮質(zhì)量濃度/(mg·mL-1) 微生物數(shù)量/(lg CFU·g-1) 總酚隸屬度黃酮隸屬度微生物隸屬度綜合分/分6 2 2 1 3 0.652 0.233 21.185 0.961 1.000 1.000 98.442 7 3 3 1 2 0.487 0.098 20.229 0.532 0.282 0.000 32.575 8 3 2 2 1 0.304 0.082 20.345 0.057 0.197 0.121 12.586 9 1 1 1 1 0.282 0.085 20.138 0.000 0.213 0.094 10.386 K1 39.4544.7547.1311.72 K2 52.4953.8738.9343.33 K3 40.7334.0546.6777.62極差R 13.0419.83 8.2065.90因素主次 D＞B＞A＞C最優(yōu)組合 D3B2A2C1

3 結(jié)論

試驗(yàn)對原料藜麥進(jìn)行不同處理，制備藜麥研磨液、水提液、磨漿液和糖化液，結(jié)果表明，研磨液為紅茶菌發(fā)酵的最佳基質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，確定出紅茶菌發(fā)酵藜麥的最佳條件：料水比14∶100 g/mL，接種量8%，溫度25 ℃，加糖量6%。該課題的研究結(jié)果一方面可豐富紅茶菌發(fā)酵產(chǎn)品的種類，為相關(guān)食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，另一方面可提高藜麥的利用和經(jīng)濟(jì)價值，對藜麥的深加工和開發(fā)利用有重要意義。