上海市11種常規(guī)粳稻抗稻瘟病基因分子標記檢測

謝水鋒　宗士鵬　余飛宇　趙國超　李建粵

摘? 要： 利用分子標記檢測技術(shù)，對9種參加2020年上海市水稻區(qū)域試驗的品種和2種本課題組新培育的新品系的共10個抗稻瘟病基因位點進行了檢測. 結(jié)果顯示，，， 3個基因在11種水稻中出現(xiàn)的頻率達100%，，，，，和抗性基因在11種水稻中出現(xiàn)的頻率分別為18.18%，9.09%，36.36%，90.90%，9.09%和81.81%. 此外，11種水稻中都沒有檢測到抗性基因. 研究結(jié)果為聚合更多抗稻瘟病基因，培育廣譜抗稻瘟病水稻新品種提供了一定的科學(xué)依據(jù).

關(guān)鍵詞： 水稻（）; 抗稻瘟病基因; 分子標記

中圖分類號： S 511??? 文獻標志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2022）01-0056-08

Molecular marker detection of rice blast resistance genes in 11 Shanghai conventional varieties

In this study， by using these known molecular markers together with PCR technology， 10 rice blast resistance gene loci were amplified in 9 new rice varieties that were involved in 2020 Shanghai Regional Trial and 2 rice lines that were developed in our laboratory. Our results indicated that the occurrence frequency of， ， and genes was 100%， while the distribution frequency of ， ， ， ， ， and genes in 11 tested rice varieties/lines was 18.18%， 9.09%， 36.36%， 90.9%， 9.09%， 81.81%， and 0， respectively. Collectively， the results of this study provided scientific evidence for pyramiding more blast resistant genes and breeding new rice varieties with broad-spectrum rice blast resistance.

rice （）; blast resistance genes; molecular marker

稻瘟病是水稻的三大主要病害之一，嚴重影響稻米產(chǎn)量和品質(zhì).目前防治稻瘟病的方法主要可分為依賴于農(nóng)藥的化學(xué)防治和種植稻瘟病抗性品種兩種.相比于化學(xué)防治，種植抗病品種防治稻瘟病不僅能夠降低水稻種植成本，還能夠緩解由于大量使用農(nóng)藥導(dǎo)致的環(huán)境污染以及農(nóng)藥殘留問題.稻瘟病病菌具有極強的變異性，單個抗稻瘟病基因的水稻品種的抗病性呈現(xiàn)逐年減弱的趨勢，因此，培育高效抗稻瘟病水稻新品種需要聚集多個抗病優(yōu)良基因，以及具有廣譜抗性的基因.

傳統(tǒng)稻瘟病抗性接種鑒定方法不僅工作量大，費事費力，還容易受到病原菌毒力和天氣條件等因素的限制，選擇誤差較大，效率低下.分子標記輔助選擇技術(shù)是直接選擇抗病基因，效率高，不受天氣環(huán)境的影響，有利于抗性基因的快速聚合.

目前，已有100多個抗稻瘟病基因被報道，其中30多個基因已被克隆.隨著對稻瘟病抗性基因的深入研究，已開發(fā)出大量抗稻瘟病基因的分子標記，這些分子標記可被用于將多個優(yōu)良抗稻瘟病基因聚集到一個水稻基因組的研究中，有利于培育廣譜抗病水稻新品種.MIAH等利用分子標記輔助選擇將，，導(dǎo)入“MR129”水稻，獲得高效的抗稻瘟病改良品種.SINGH等利用分子標記輔助選擇和逐步回交的方法，將和導(dǎo)入到恢復(fù)系“PRR78”中，獲得含有，抗稻瘟病基因的新恢復(fù)系.本研究分析了10個抗稻瘟病基因在11種水稻中的分布情況，為今后利用分子標記輔助選擇技術(shù)培育聚合多種抗病基因的水稻新品種提供了分子依據(jù).

1? 材料與方法

試驗材料

本試驗收集了11個水稻材料進行稻瘟病抗性基因分析，其中9個是參加2020年上海市水稻區(qū)域試驗的新品種：“武香粳968”“嘉87”“賢城美谷2號”“滬稻16-89”“浙禾香2號”“青香軟20”“光明粳6號”“滬香粳201”和“滬軟1212”;2個是本課題組新培育的優(yōu)質(zhì)水稻品系：“上師大21號”和“上師大22號”. 在基因檢測中使用的對照材料“中植抗2號”由中科院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心何祖華研究員的課題組提供.

試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

參考前人報道，合成了能夠檢測10個抗稻瘟病基因位點的特異性引物（表1）.引物由北京擎科生物科技有限公司合成.

1.2.2 分子標記檢測抗稻瘟病基因

采用CTAB法提取水稻葉片總DNA.

PCR擴增的反應(yīng)體系共20 μL，10 μL PCR Mix，每種引物各0.4 μL（2 mmol?L），水稻基因組DNA提取液1 μL，用ddHO補足至20 μL.不同的抗稻瘟病基因聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）反應(yīng)程序，除了退火溫度和延伸時間不相同外（表1），其他PCR反應(yīng)程序均為：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s，退火時間30 s，延伸溫度72 ℃，共30個循環(huán);72 ℃再次延伸5 min，最后12 ℃放置5 min.

PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量濃度為0.03 g?mL的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，核酸染液染色，利用紫外凝膠成像儀拍照記錄檢測結(jié)果.

2? 結(jié)果與分析

基因檢測

抗稻瘟病基因存在于第6染色體上，是的等位基因.用Pi2-F/Pi2-R引物對供試材料抗稻瘟病基因進行檢測，PCR產(chǎn)物中存在450 bp片段的為抗病品種/系，PCR產(chǎn)物中存在282 bp片段的為感病品種/系.在受測的11個品種/系中，只有“浙禾香2號”和“上師大21號”擴出450 bp的目的片段（圖1（a））.結(jié)果表明“浙禾香2號”和“上師大21號”含有抗性基因.

基因檢測

抗稻瘟病基因存在于第9染色體上.利用Pi5-F/Pi5-R引物對供試材料基因進行檢測，PCR產(chǎn)物中存在206 bp片段的為抗病品種/系，存在307 bp片段的為感病品種/系.在11個樣品中（圖1（b）），只有“滬稻16-89”的PCR產(chǎn)物擴增出了206 bp條帶，表明該品種含有抗性基因.

基因檢測

位于第6染色體上的抗稻瘟病基因Pi9，是抗稻瘟病主效基因之一.利用Pi9-F/Pi9-R引物對試驗材料中抗稻瘟病基因進行檢測，PCR產(chǎn)物中含有291 bp特異性片段的為抗病品種/系，含397 bp特異性條帶的為感病品種/系.PCR檢測結(jié)果（圖1（c））發(fā)現(xiàn)：11個供試水稻中，4個品種/系包括“賢城美谷2號”“滬稻16-89”“青香軟20”和“滬軟1212”能擴出291 bp條帶，含有抗病基因.

基因檢測

抗稻瘟病基因存在第6染色體上，對多數(shù)的稻瘟病生理小種表現(xiàn)出廣譜抗性.采用“中植抗2號”作為對照，利用M80410-F/M80410-R引物對供試樣品進行檢測.PCR產(chǎn)物含有517 bp片段的為抗病品種/系，無擴增條帶的為感病品種/系.PCR檢測結(jié)果（圖1（d））發(fā)現(xiàn)：11種供試水稻中均無擴增條帶，表明它們均不含抗病基因.

基因檢測

抗稻瘟病基因位于第11染色體上，由-和-組成.利用Pikm1-F/Pikm1-R和Pikm2-F/Pikm2-R引物分別對Pikm1和Pikm2位點進行檢測.檢測出174 bp條帶的為Pikm1抗病品種/系，檢測出290 bp條帶的為Pikm2抗病品種/系.若同時檢測到這2個條帶該品種/系含有完整的抗性基因.從圖1（e）和1（f） 檢測結(jié)果可以看出，11個受試水稻中，“武香粳968”“浙禾香2號”“青香軟20”“光明粳6號”和“上師大21號”均含有Pikm1抗性位點，均能擴增出174 bp條帶.而“嘉87”“青香軟20”和“上師大21號”均擴增出了290 bp條帶，均含有Pikm2抗性位點.11個受試水稻中，只有“上師大21號”同時含有Pikm1抗性位點和Pikm2抗性位點，因此，“上師大21號”含有完整的抗性基因.

基因檢測

利用Pi36-F/Pi36-R引物進行PCR擴增檢測，PCR產(chǎn)物有628 bp目的條帶的為含抗病基因的品種/系，無擴增條帶的為不含有抗病基因的品種/系.在11種受試水稻中（圖1（g）），“武香粳968”“嘉87”“滬稻16-89”“浙禾香2號”“青香軟20”“光明粳6號”“滬香粳201”“滬軟1212”“上師大21號”和“上師大22號”都擴增出628 bp，它們都含有基因.只有“賢城美谷2號”無擴增產(chǎn)物，不含有基因.

基因檢測

經(jīng)Pi37-F/Pi37-R引物檢測，具有抗稻瘟病基因的品種/系的，PCR條帶中含有716 bp條帶，而不含有抗性基因品種/系的PCR產(chǎn)物則無擴增條帶. 11種受試水稻的PCR檢測結(jié)果（圖1（h））表明，11種水稻均含抗稻瘟病基因.

基因檢測

利用Pi41-F/Pi41-R引物對供試樣品抗稻瘟病基因進行檢測，具有抗病基因的水稻PCR條帶中含有176 bp特異性條帶，不含有抗病基因的水稻則無擴增條帶.PCR檢測結(jié)果（圖1（i））顯示，11種水稻均含有抗性基因.

基因檢測

經(jīng)Pid2-F/Pid2-R引物檢測，具有抗稻瘟病基因-的PCR條帶中含有779 bp條帶.不含有-抗病基因水稻的PCR產(chǎn)物則無擴增條帶.經(jīng)檢測（圖1（j））發(fā)現(xiàn)，11種水稻均含-抗稻瘟病基因.

基因檢測

位于第2染色體上，對水稻的穗頸瘟有一定的抗性.根據(jù)LIU等設(shè)計的一套檢測抗病等位基因的顯性標記Pibdom和感病Pib等位基因的顯性標記Lys145，對供試材料的基因進行檢測.抗病顯性分子標記Pibdom能夠擴增出365 bp的特異性條帶，感病顯性分子標記Lys145能夠擴增出803 bp的特異性條帶.檢測結(jié)果如圖1（k）和1（l）所示，“武香粳968”“嘉87”“滬稻16-89”“浙禾香2號”“青香軟20”“光明粳6號”“滬香粳201”“上師大21號”和“上師大22號”擴增出了365 bp，含有抗病基因.而“賢城美谷2號”和“滬軟1212”擴增出了803 bp，不含抗病基因.

種水稻個抗稻瘟病基因的分布情況

盡管11種水稻都含有多個抗稻瘟病基因，但是每種水稻的抗性基因數(shù)量不相同.檢測發(fā)現(xiàn)“滬稻16-89”和“上師大21號”含有7個抗稻瘟病基因，而“賢城美谷2號”含有抗病基因數(shù)量最少，只有4個，其他的水稻品種大多數(shù)都含有5～6個基因（表2）.

本次研究發(fā)現(xiàn)，9個參加2020年上海市水稻區(qū)域試驗的新品種以及本課題組新培育的2個優(yōu)質(zhì)水稻品系都含有，和-抗性基因.和出現(xiàn)的次數(shù)都只有1次，出現(xiàn)頻率為9.09%;因為在11個樣品中都沒有檢測到抗性基因，的出現(xiàn)頻率為0（圖2）.

3? 討 論

本研究利用10個抗稻瘟病基因分子標記對9個參加2020年上海市區(qū)域試驗和2個本課題組培育的新品系進行檢測，分析了11種水稻稻瘟病抗性基因的分布情況.結(jié)果顯示，11種水稻均含，和這3個抗性基因，其他7個抗性基因（，，，，，和）在11種水稻中的分布各不相同（表2），其中，和在11種水稻中出現(xiàn)的頻率較低，在11種水稻中出現(xiàn)的頻率為0，說明這4個抗性基因在上海市抗稻瘟病水稻育種中具有巨大的開發(fā)潛力.2017年HAN等報道發(fā)現(xiàn)上海22種常規(guī)粳稻都含有抗病基因;ZHAI等在12種浙江省常規(guī)晚粳稻品種也都檢測到抗病基因.本研究發(fā)現(xiàn)：在11種被檢測水稻中有9種水稻都含有抗病基因，表明抗病基因在粳稻中具有很大分布幾率，但也不是所有粳稻品種都含有抗病基因.

LI等發(fā)現(xiàn)，含有的水稻對6個強致病性小種均表現(xiàn)出較好的抗性，但是只含有單個基因的水稻抗病性較差.因此，與其他主效基因聚在一起時，水稻才能表現(xiàn)較強的稻瘟病抗性.HUANG等對重慶地區(qū)73個水稻骨干親本稻瘟病抗性進行研究發(fā)現(xiàn)，含有3～4個抗稻瘟病基因的水稻親本的抗病率均為100%，也說明了抗稻瘟病基因聚合可以提高水稻的稻瘟病抗性.WU等的研究結(jié)果顯示：含抗性基因數(shù)量多的水稻，對稻瘟病菌有較好的抗性效應(yīng).此外，ZHANG等研究發(fā)現(xiàn)，水稻中抗稻瘟病基因數(shù)量和稻瘟病抗性有一定的關(guān)系，隨著抗性基因數(shù)量的增加，水稻的稻瘟病抗性也不斷提高.因此培育抗稻瘟病水稻需要聚集多種主效抗病基因來形成稻瘟病的廣譜抗性，但基因聚合不是簡單地將抗性基因疊加起來，需要考慮抗性基因之間的關(guān)系，例如，，，和-互為復(fù)等位基因，同時也需要和田間性狀相結(jié)合，選擇既抗性強又有很好農(nóng)藝性狀的水稻進行育種，從而培育出優(yōu)質(zhì)的抗稻瘟病水稻.

本研究結(jié)果表明，9個參加2020年上海市水稻區(qū)域試驗的品種和2個本課題組培育的新品系都具有較多抗稻瘟病基因，但是這些水稻實際的稻瘟病抗性還需進一步田間試驗進行驗證. 本研究結(jié)果為上海市利用分子標記輔助選擇培育廣譜、持久的抗稻瘟病水稻研究提供了參考.

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（責任編輯：顧浩然，包震宇）

收稿日期： 2021-12-02

基金項目： 上海市科委現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目（19391900500）

作者簡介： 謝水鋒（1995—），男，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳學(xué)方面的研究. E-mail： 1000496741@smail.shnu.edu.cn

* 通信作者： 趙國超（1983—），男，副教授，主要從事植物分子遺傳學(xué)方面的研究. E-mail： zgc1983@shnu.edu.cn;

李建粵（1958—），女，教授，主要從事植物分子遺傳學(xué)方面的研究. E-mail： lijianyue01@shnu.edu.cn

引用格式： 謝水鋒， 宗士鵬， 余飛宇， 等. 上海市11種常規(guī)粳稻抗稻瘟病基因分子標記檢測 [J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2022，51（1）：56?63.

?XIE S F， ZONG S P， YU F Y， et al. Molecular marker detection of rice blast resistance genes in 11 Shanghai conventional??varieties [J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：56?63.