HPLC-PDA測定不同產(chǎn)地、不同部位明日葉中4-羥基德里辛和黃當(dāng)歸醇的含量

梁麗萍，張鳳艷*，桑迎迎，趙 丹，王海玲，宋梓慧，左雯雯，孫 娜

（1.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071；2.青島市食品檢驗(yàn)所，山東 青島 266071）

明日葉（Angelica keiskei Koidzumi）屬于傘形花科，當(dāng)歸屬，是一種常綠直立的草本植物，產(chǎn)于日本太平洋沿海地區(qū)，因生長迅速及再生特性而得名[1]。明日葉主要作為食物使用，在日本有治療流感、發(fā)燒等疾病的傳統(tǒng)用法，但日本未批準(zhǔn)其用于醫(yī)療用途[2]。我國部分地區(qū)于2008年陸續(xù)開始種植明日葉，現(xiàn)分布多個(gè)省份，如海南、山東、江蘇、四川、云南、貴州和廣東等。2019年，我國衛(wèi)健委批準(zhǔn)其成為新食品原料[3]。目前，明日葉食用方式通常是將其嫩莖葉涼拌、炒、汆湯，或?qū)⑵涑粗茷榇貌?、干磨成粉狀。明日葉含有在植物界較少見的查爾酮類活性物質(zhì)，對糖尿病、高血壓、高血脂、心血管疾病、癌癥等有預(yù)防和治療作用[4-7]；其中重要的查爾酮類物質(zhì)有4-羥基德里辛和黃當(dāng)歸醇[8]。不同產(chǎn)地明日葉元素分析已有報(bào)道[9]，但功效成分含量鮮有報(bào)道。有研究表明，不同部位明日葉中查爾酮類成分含量有區(qū)別[10]。本文分析測定6個(gè)地區(qū)采集的新鮮明日葉樣品，比較不同產(chǎn)地、不同部位明日葉中4-羥基德里辛和黃當(dāng)歸醇含量，以為其功效成分提取產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4-羥基德里辛（4-HD，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司，純度93.3 %）；對照品：黃色當(dāng)歸醇（XAG，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司，純度99.3 %），甲醇（色譜純，德國默克公司），乙腈（色譜純，美國Burdick & Jackson）。

樣品：新鮮明日葉植株，不同產(chǎn)地和不同部位樣品情況見表1。采集時(shí)間為2020年5月。樣品粉碎分裝后于-20 ℃條件下貯存。

表1 不同來源的明日葉樣品

儀器：高效液相色譜儀（配P D A檢測器，美國安捷倫公司）； 氮?dú)獯蹈蓛x（美國Organomation公司N-EVAP），MultiReax漩渦振蕩器（德國Heidolph公司），3-30KS冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司），Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司），XS205Du電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），粉碎機(jī)（山東九陽公司）、勻漿機(jī)（德國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液制備：準(zhǔn)確稱取4-HD 9.90 mg，XAG 11.30 mg，置入10 ml量瓶，用甲醇定容至刻度，超聲溶解配置成標(biāo)準(zhǔn)儲備液。各吸取1 ml儲備液，配成混合對照品儲備液。準(zhǔn)確吸取混合對照品儲備液200，150，100，50，5 μl置入1 ml小瓶，加甲醇定容至1 ml，搖勻，配制成一系列梯度濃度的工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 現(xiàn)有樣品提取方式較復(fù)雜[11]，需多次提取且使用不同的有機(jī)溶劑和旋蒸濃縮處理方式，耗時(shí)約6 h，過程復(fù)雜，且極易損失目標(biāo)化合物。

本實(shí)驗(yàn)樣品前處理步驟為：稱取粉碎后樣本5 g（精確至0.01 g），用10.0 ml甲醇溶液勻漿2 min，離心后取上清過0.45 μm濾膜，備用。根據(jù)目標(biāo)物極性，使用甲醇作為提取溶劑，勻漿提取后直接過膜上機(jī)，耗時(shí)約10 min，本方法方便快捷且減少了溶劑轉(zhuǎn)換、濃縮等過程對目標(biāo)物造成的損失。

1.2.3 儀器工作參數(shù) 檢測波長的選擇：對混合對照品溶液在HPLC-PDA 中進(jìn)行分離掃描，370 nm 處有最大吸收值，故掃描波長定為370 nm。

色譜條件：硅膠色譜柱Thermo NO.30005-254630（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1 %甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序如下：0～10 min，10 %A；10～15.0 min，60 %A；15.00～15.10 min，10 %A；15.10～18.00 min，10 %A。流速1.0 ml/min，柱溫40 ℃，檢測波長370 nm，進(jìn)樣量5 μl，檢測時(shí)間18 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積S為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析。4-HD回歸方程為 Y=7.45515X-48.70171，R2=0.9993；XAG回歸方程為Y=7.20151X+6.95512，R2=0.999 88。結(jié)果表明4-HD、XAG在4.95～495 μg/ml、5.65～565 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對照品HPLC圖譜見圖1，表明4-HD、XAG 兩個(gè)峰之間的分離度 R=5.3，色譜條件適用于 4-HD、XAG 分離和檢測，分離效果良好。

圖1 混合對照品儲備液HPLC色譜圖

2.2 精密度

分別稱取同一樣品6份，稱樣量5.00 g，進(jìn)行前處理后分別進(jìn)樣測定，得XAG峰面積的RSD值為1.93 %，4-HD峰面積的RSD值為1.87 %，精密度良好。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別稱取6份芹菜樣品（模擬空白基質(zhì)）適量共6份，稱樣量5.00 g。分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（C4-HD=990 μg/ml；CXAG=1130 μg/ml）100 μl，進(jìn)樣測定，得XAG的平均回收率為102.3 %，4-HD的平均回收率為 98.4 %，RSD 值均小于2 %，回收率良好。

2.4 檢出限

分別稱取6份芹菜樣品（模擬空白基質(zhì)）適量共6份，稱樣量5.00 g。分別加入混合對照品儲備液（C4-HD=990 μg/ml；CXAG=1130 μg/ml）10 μl，進(jìn)樣測定，添加4-HD 、XAG在2 μg/g濃度水平下，前處理上機(jī)后S/N均大于3。經(jīng)改進(jìn)的前處理方法處理上機(jī)后，在該濃度下能夠有效的避免基質(zhì)干擾，準(zhǔn)確定性。

2.5 樣品檢測

按表1對不同產(chǎn)地、不同部位明日葉進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。運(yùn)用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析研究，不同產(chǎn)地、不同部位明日葉樣品4-HD、XAG含量區(qū)別明顯，結(jié)果見圖2。經(jīng)檢測，地域情況：南方地區(qū)（如福建）明日葉中4-HD含量和XAG含量明顯較高，但江蘇的樣品含量明顯低，日照樣品中兩種功效成分的含量高于青島地區(qū)。明日葉不同部位情況：4-HD、XAG主要分布在莖、根中，分布規(guī)律為鮮根＞鮮莖＞鮮葉。

表2 不同產(chǎn)地、不同部位明日葉中 4-HD和XAG的含量

圖2 不同產(chǎn)地、不同部位明日葉中4-HD、XAG含量趨勢

3 結(jié)論

本方法建立了一種明日葉中4-HD和XAG的快速檢測方法。方法驗(yàn)證表明，4-HD在4.95～495 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9993；平均回收率為98.4 %；最低檢出限為2 μg/g。XAG在5.65～565 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999 88；平均回收率為102.3 %，最低檢出限為2 μg/g。

對測定6地區(qū)樣品中功效成分4-HD和XAG的檢測分析結(jié)果表明，由不同地域看，南方地區(qū)（如福建）明日葉中4-HD含量和XAG含量明顯較高，但江蘇的樣品含量明顯低，可能與江蘇樣本生長時(shí)間較短有關(guān)；日照樣品中兩種功效成分的含量高于青島地區(qū)。由明日葉不同部位看，4-HD、XAG主要分布在莖、根中，分布規(guī)律為鮮根＞鮮莖＞鮮葉。明日葉植株不同部位的代謝累積不均勻，部位選擇性明顯。本方法對明日葉中功效成分提取產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了參考依據(jù)。