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    特殊食品中3種B族維生素檢測方法的研究進展

    2022-12-07 09:55:09于瑞莉馮永巍黃麗俊
    食品與藥品 2022年1期
    關(guān)鍵詞:生物素葉酸檢出限

    于瑞莉,馮永巍,黃麗俊,楊 婷

    (無錫市食品安全檢驗檢測中心,國家市場技術(shù)創(chuàng)新中心(特殊食品),江蘇 無錫 214000)

    特殊食品是指為滿足某些特殊人群的生理需要,或某些疾病患者的營養(yǎng)需要,按特殊配方而專門加工的食品,包括保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品(簡稱特醫(yī)食品)和特殊膳食等。在食品原料中,葉酸、生物素和維生素B12(VB12)是常添加的3種水溶性B族維生素,是人體維持正常生理機能的一類重要且典型的微量營養(yǎng)素,在體內(nèi)不能自身合成,必須通過食物或外界環(huán)境獲取和補充[1]。由于特殊食品針對的人群特殊,其添加量要求嚴格,因此對于這3種水溶性B族維生素的含量測定有非常重要的作用。但由于基質(zhì)成分復(fù)雜,B族維生素添加量較低,且易受光熱分解[2],使檢測難度大大增加。本文對葉酸、生物素和維生素B12常用的分光光度計法,熒光法、高效液相色譜、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、微生物法和免疫法進行詳細分析討論,旨在為檢測工作者尋找一種簡便、精準、快速的檢測方法提供指導(dǎo)。

    1 性質(zhì)

    葉酸(floic acid,維生素B9),包括天然的葉酸和用于強化食品和膳食補充劑的合成葉酸,其化學(xué)名稱是蝶酰谷氨酸,由蝶呤、對氨基苯甲酸和L-谷氨酸組成,對光敏感。葉酸缺乏會使單碳代謝嚴重異常,可導(dǎo)致慢性疾病和發(fā)育障礙,包括神經(jīng)管缺陷[3]、巨紅細胞型貧血、癌癥及神經(jīng)障礙等多種疾病。但是過量攝入合成葉酸又會引起并發(fā)癥[4-5],如干擾人體對鋅的吸收,增加下一代患自閉癥的風(fēng)險等。一般正常人葉酸的需求量為200~400 μg/d,世界衛(wèi)生組織建議成人至少為200 μg/d,孕婦和母乳為400 μg/d,不同年齡、不同階段的人需求量不同[6]。

    生物素(biotin,維生素B7),是合成維生素C的必要物質(zhì)。含3個不對稱碳原子的雙環(huán)化合物[7]共有8種同分異構(gòu)體,穩(wěn)定性較好。作為羧化酶、羧基轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶的輔酶參與人體的糖異生、脂肪酸和氨基酸代謝、能量傳遞過程。其長期攝入不足會影響蛋白質(zhì)及RNA合成,降低身體免疫力[8]。

    維生素B12(cobalamin,鈷胺素),是一類含有鈷離子的咕啉類化合物總稱[9],是唯一含有金屬離子的水溶性維生素,在空氣中不穩(wěn)定,對光敏感。以輔酶形式參與各種代謝過程,在造血和健全神經(jīng)系統(tǒng)功能方面有重要作用。缺乏維生素B12不僅導(dǎo)致巨幼紅細胞貧血,還會引起心臟病,神經(jīng)紊亂,老年癡呆和帕金森綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10-11]。

    國家食品安全監(jiān)督抽檢對特殊食品中3種B族維生素的含量要求非常嚴格(見表1)[12]。由表可見,特殊膳食食品中尤其是孕、乳母營養(yǎng)補充食品、嬰兒配方食品對維生素添加量有嚴格的要求,特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方奶粉和嬰幼兒配方奶粉對3種B族維生素含量區(qū)間要求更窄,含量更低,需要檢測方法具備更高的靈敏度和更低的檢出限。

    2 檢測方法

    2.1 比色法

    維生素檢測開展初期,比色法有較廣的普適性。葉酸檢測分為直接比色和衍生物比色法兩種。直接比色法是在堿性溶液中將葉酸溶解,測定葉酸的特征峰吸收值,從而確定樣品中葉酸含量。衍生法則需對樣品進行前處理,使用衍生化試劑與葉酸反應(yīng),合成其他穩(wěn)定且具有特征吸收峰的物質(zhì)后再進行紫外測定。常用的衍生試劑有茚三酮、高錳酸鉀、N-(1-N)-二乙二胺等[19]。生物素測定則用無水乙醇提取,在硫酸乙醇溶液中生成橙紅色化合物,在一定范圍內(nèi)顏色深淺與生物素含量成正比,根據(jù)吸光度即可判斷生物素的含量[20]。維生素B12在 278,361和550 nm波長處有最大吸收,可使用紫外-可見光分光光度計法進行含量測定[21]。該方法雖然操作簡單,但易被樣品中其他物質(zhì)干擾,受儀器分辨率和樣品本底的影響較大,影響測定結(jié)果的準確度和精確性,因此不太適宜特殊食品中葉酸、生物素和維生素B12的檢測。

    2.2 熒光法

    對于自身含有熒光特性或是與標記物結(jié)合發(fā)光的 B 族維生素,可使用熒光法測定。生物素和維生素B12不具有熒光特性,關(guān)于此方法的研究鮮有報道。只有葉酸結(jié)構(gòu)中的吡嗪嘧啶環(huán)含有特殊的吸收光譜,紫外光可將其轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物,采用熒光法和其他檢測手段相結(jié)合的方式進行測定。陳瓊等[22]采用固相萃取-HPLC柱后氧化衍生熒光法測定運動營養(yǎng)食品中葉酸的含量,趙海燕等[23]采用HPLC-柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測方法,用于強化食品中葉酸測定。具有靈敏度高,重現(xiàn)性強的優(yōu)點,但它的缺點在于前處理復(fù)雜,不具備高效快速的特點,且檢出限較低,適用于特殊膳食但不適用于特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品中葉酸的檢測。

    2.3 高效液相色譜法

    高效液相色譜法(HPLC)已普遍用于特殊膳食中維生素測定。耿瑛等[24]采用鈦膠反相色譜柱,建立了同時測定功能飲料中的生物素、葉酸、維生素B12等5種維生素的HPLC法。孫璐璐等[25]通過固相萃取-HPLC實現(xiàn)了對營養(yǎng)強化餅干中維生素B12含量的快速精確測定,檢出限0.1 mg/kg。

    HPLC一般適用于添加形式明確,且含量較高的特殊膳食中維生素的檢測。但李貽[26]用HPLC和HPLC-MS分析嬰幼兒配方乳粉中B12含量,得出結(jié)論:HPLC因檢測重復(fù)性好,結(jié)果準確,適用于維生素B12含量高的樣品,但是靈敏度不高,儀器檢出限較高,對于含量低的樣品不宜準確檢出。所以由于方法的局限性,特醫(yī)食品中葉酸、維生素B12的檢測較少采用HPLC。

    2.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

    液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)相對于HPLC,有更強大的組分分離與鑒定能力,也有較低的檢出限;不僅可準確測定維生素含量較高的特殊膳食,也可測定特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品中維生素含量。張辰辰等[27]利用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定特醫(yī)食品中生物素、葉酸、維生素B12等8種維生素,定量限為4~10 μg/100 g,加標回收率達85.52 %~116 %,RSD為0.49 %~4.10 %。陳美君等[28]建立了一種能同時測定嬰幼兒配方奶粉中 11 種 B 族維生素的超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,采用電噴霧離子源正離子模式,方法線性范圍良好,樣品前處理方法簡單,靈敏度高。盧蘭香等[29]采用免疫親和柱進行凈化,建立了LC-MS測定特醫(yī)食品中生物素的方法。

    但是LC-MS/MS的測定與其標準溶液相關(guān)性較強,而這3種維生素在特殊食品中的存在形式較復(fù)雜。葉酸衍生物種類多,LC-MS/MS測定的只是不同衍生物的含量,盡管Ndawa等[30]將衍生物轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸或多種純化方式分別測得多種衍生物含量,但是葉酸及其衍生物不穩(wěn)定,且易在提取和測定過程中發(fā)生氧化降解或衍生物間相互轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致難以準確測定葉酸總量。而維生素B12的主要存在形式包括羥基鈷胺素、氰基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素[31],不同于允許添加到食品中的維生素B12的種類(氰鈷胺、羥鈷胺和鹽酸氰鈷胺)[32],且維生素B12幾乎都是借助于微生物發(fā)酵獲得,其基質(zhì)復(fù)雜,儀器法難以滿足準確測定要求。生物素有8種同分異構(gòu)體,陳杰峰等[33]通過同位素內(nèi)標和LC-MS/MS測定的嬰幼兒配方奶粉中B6和生物素含量,其中生物素質(zhì)控樣品測定值(每100 g 含0.1906 mg)低于質(zhì)控樣品特性值區(qū)間(每100 g 含1.346±0.093 mg),且6個實際樣品的檢測結(jié)果普遍低于國標法,最高偏差達3.9 %,可見LC-MS/MS并不能準確測定嬰幼兒配方食品中生物素的含量。LC-MS/MS作為更先進的手段,盡管具有較低的檢出限,更高靈敏度,更簡單的操作,但是在特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品葉酸、生物素和維生素B12檢測的準確性和全面性方面還存在缺陷。

    2.5 微生物法

    目前,傳統(tǒng)微生物法是我國現(xiàn)行檢測標準,同時也是美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)和美國藥典(USP)的推薦方法。我國現(xiàn)行檢測方法為:《GB5009.211-2014 食品安全標準 食品中葉酸的測定》[34]、《GB5009.259-2016食品安全標準 食品中生物素的測定》[35]和《GB5413.14-2010食品安全標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》[36]。

    葉酸主要是以葉酸衍生物的形式存在[37],最主要的天然葉酸形式包括[38]:5-甲酰四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、四氫葉酸和葉酸;不同葉酸衍生物又包含單谷氨酸形式和多聚谷氨酸形式的葉酸,具有生物活性的多達100余種[39-40]。生物素共有8種同分異構(gòu)體,但只有全順式結(jié)構(gòu)的D-生物素具有生理活性[41],D-生物素的存在形式又分為游離狀態(tài)與結(jié)合狀態(tài)。維生素B12的存在形式也不單一。微生物法利用相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌種對特定維生素有很強的特異性,在一定條件下,其生長和繁殖速度與溶液中維生素的含量成一定對應(yīng)關(guān)系;可測定具有生物活性的維生素,測定結(jié)果更準確,范圍廣,靈敏度高,能滿足含量低和基質(zhì)復(fù)雜的特殊食品檢測。

    但是國標中傳統(tǒng)微生物法的諸多缺點也限制了該法的實際應(yīng)用范圍。如葉酸、維生素B12對光敏感,分析過程均需避光操作,對環(huán)境要求高;實驗關(guān)鍵點多,且要求平行管之間結(jié)果偏差不得超過10 %;由于產(chǎn)品實際含量一般高于標示值,精準把握樣品稀釋倍數(shù),使其落入合適的線性區(qū)間的難度加大,導(dǎo)致對檢驗員的操作水平和檢測經(jīng)驗要求提高;為了保證測定用菌種的活力需傳代2~3代,萊士曼氏乳酸桿菌活力較差,菌種活化時間需2~4 d,維生素的檢測周期一般需要4~6 d;另外如果保存不當或傳代過多,菌種易變異失去對維生素的特異性,嚴重影響檢測結(jié)果。葉酸測定中所使用的鼠李糖乳桿菌只可測定出單尾形式的葉酸或含2~3個谷氨酸尾的葉酸,對長鏈的谷氨酸葉酸衍生物的響應(yīng)較弱[42]。生物素的8種異構(gòu)體中只有1種具有較高的生物活性,采用微生物法不能分離并測定出該種異構(gòu)體的含量。另外,陳緒華等[43]研究發(fā)現(xiàn),國產(chǎn)培養(yǎng)所含本底較高,標準曲線線性較差。

    此外,微生物法實驗過程中需大量的玻璃器皿,所有玻璃器皿及用具均需嚴格清洗、酸泡和干熱滅菌,工作量較大。近年,研究人員也對國標微生物法進行了改進。主要優(yōu)化方向是縮小反應(yīng)體系,如微孔板式定量檢測試劑盒。涂曉波等[44]對奶粉中生物素、葉酸及維生素B12,利用自主研發(fā)與進口維生素檢測試劑盒進行了對比分析,發(fā)現(xiàn)自主研發(fā)試劑盒操作較簡便。楊小平等[45]采用EP管代替試管,通過等比例縮小反應(yīng)測定嬰幼兒配方奶粉中葉酸含量,加標回收率為98 %-107.5 %。余文等[46]采用96孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng),酶標儀代替分光光度計,實現(xiàn)了快速檢測。但是也存在檢測結(jié)果偏低的情況,另外試劑盒比較昂貴,檢測成本高,普及率較低。諸多問題使微生物法將逐漸被其他簡便、快速、準確的方法替代。

    2.6 免疫法

    免疫學(xué)分析技術(shù)是基于免疫學(xué)原理設(shè)計的對目標樣本進行定性或定量檢測的實驗手段。通過免疫分析技術(shù),可實現(xiàn)對抗原、抗體等免疫相關(guān)物質(zhì)的測定。其中,酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型的免疫測定技術(shù),是目前最具有發(fā)展前景的技術(shù)之一,在特殊食品領(lǐng)域已逐步開始應(yīng)用。李江等[47]采用間接競爭ELISA方法,得出嬰幼兒配方奶粉中維生素B12含量,快速靈敏、準確、操作簡便、無需貴重儀器設(shè)備,檢出限3 μg/kg。葉酸測定中,由于單谷氨酸葉酸、多谷氨酸葉酸、葉酸衍生物與葉酸結(jié)合蛋白的親和性不相同,會影響測定的靈敏度,楊霈瑤[19]提出了通過制備葉酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的抗體,并在此基礎(chǔ)上利用酶免疫試驗的基本原理,建立一種簡單快速的檢測方法。樂振竅等[48]采用ELISA測定功能食品中維生素B12的含量,結(jié)果準確度和精密度與AOAC方法達到同等效果。Kong等[49]開發(fā)了一種間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同營養(yǎng)強化中維生素B12的 4 種主要形式(氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺)的方法,其檢測限為0.065 ng/ml,回收率為81 %~122 %。

    此外,熒光免疫層析技術(shù)是免疫法中的基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的另一種新型膜檢測技術(shù)。主要基于抗原抗體特異性識別原理和層析反應(yīng)模式,能快速、準確地測定特殊食品中維生素含量。劉海英[50]對生物素含量的檢測采用熒光微球免疫層析方法,熒光微球等發(fā)射光譜型標記物因信號強度可隨激發(fā)光增強而增強,可有效降低層析方法的檢測限。以EDC/NHS介導(dǎo)的兩步法偶聯(lián)合成適用于免疫層析檢測的熒光微球探針。熒光微球探針粒度均一、化學(xué)及光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。以此建立的以生物素為目的物的免疫層析檢測方法,最終檢測限可達3 ng/ml,遠低于其他檢測方法;靈敏度亦高于微生物法及HPLC,且檢測時間較短,檢測成本低廉。

    3 討論

    維生素B12、葉酸和生物素的檢測方法正處于優(yōu)化和創(chuàng)新的發(fā)展期,找到適合特殊食品中不同樣品基質(zhì)的最佳方法是目前研究人員的努力方向。分光光度法雖然操作簡單,但測定結(jié)果的準確度低和精確性差,因此不適于檢測特殊食品中3種維生素。熒光法可靠性存在缺陷,需要和其他檢測手段結(jié)合,由于生物素和維生素B12無紫外和熒光發(fā)色集團,只適用于特殊膳食中葉酸測定,不適于其他特殊食品的測定;HPLC適用于添加形式明確,且含量較高的特殊膳食中3種維生素檢測,但對于某些基質(zhì)成分較復(fù)雜、含量低于儀器檢出限的特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品,檢測還存在缺陷。LC-MS/MS做為更先進的手段,檢出限低,靈敏度高,操作簡單,但準確性和全面性方面還有不足。微生物法雖然是目前針對特殊食品這3種維生素的首選方法,特異性好、靈敏度較高,但由于操作關(guān)鍵點多,微生物生長周期長,工作量大,對環(huán)境、人員、菌種和培養(yǎng)基要求高等問題,應(yīng)用有限;相比之下,作為目前研究熱點的免疫法而言,有檢驗靈敏度高、檢測限低、特異性好、樣本處理量大、檢驗時間短、準確、操作簡便、無需貴重儀器設(shè)備等諸多優(yōu)點,更適用于特殊食品,尤其是特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品的檢測,具有廣泛的開發(fā)空間和應(yīng)用前景。

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