米曲霉CPA毒素的5-氟色氨酸分子探針研究

江 崢，胡江春，王 楠*，2

（1．中國科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；2.浙江大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 舟山 316021；3.中國科學(xué)院大學(xué) 研究生院，北京 100049）

米曲霉（Aspergillus oryzae）和黃曲霉（A.flavus）均屬于曲霉屬環(huán)繞亞屬（Circumdati）。前者在我國和其他東亞國家均有很長的應(yīng)用于食品釀造和發(fā)酵的歷史，后者因產(chǎn)生強(qiáng)致癌物質(zhì)黃曲霉素而成為食品安全的威脅。比較基因組學(xué)研究表明，米曲霉和黃曲霉類似于同一個(gè)種而非兩個(gè)獨(dú)立的種。米曲霉應(yīng)是在人類長期的馴化過程中通過水平基因轉(zhuǎn)移從黃曲霉的一個(gè)類群（Group I）進(jìn)化而來的，在這個(gè)過程中米曲霉逐漸丟失了部分關(guān)鍵基因，造成了不完整的或沉默的黃曲霉素生物合成基因簇[1]。然而，兩個(gè)菌株往往均含有cpa生物合成基因簇[2]，它負(fù)責(zé)合成一類經(jīng)常被忽略的真菌毒素CPAs（cyclopiazonic acids）[3-6]。已知的CPA類化合物約30個(gè)[7]，其中α-CPA是納摩級的Ca2+-ATP酶抑制劑和神經(jīng)毒素[8-10]。除釀造食品外，米曲霉經(jīng)常生長于谷物[11-12]及絕大多數(shù)加工食物上[13]，造成食品安全隱患。通常對CPA的檢測是針對個(gè)別CPA生物合成途徑產(chǎn)物，如α-CPA[14]。但是，由于CPA常常以多種化學(xué)形態(tài)存在，客觀上對針對性的檢測造成了挑戰(zhàn)[15]。例如，α-CPA可以繼續(xù)經(jīng)P450酶氧化和N—甲基化生成speradine類衍生物[16-18]，speradine還可繼續(xù)在酶促或者自發(fā)條件下生成多種氧化及環(huán)化產(chǎn)物[19-20]。假設(shè)CPA生物合成可以被人為中斷在早期步驟，即可實(shí)現(xiàn)將所有衍生物進(jìn)行富集整合的目的。這將使檢測目標(biāo)集中于單個(gè)或有限個(gè)數(shù)的檢測對象，從而極大地方便了針對CPAs的檢測與監(jiān)控。

從已知的CPA的生物合成機(jī)制來看（圖1），CpaS（聚酮合酶-非核糖體肽合成酶，PKS-NRPS）首先利用色氨酸、乙酰輔酶A及丙二酰輔酶A為前體合成第一個(gè)中間產(chǎn)物cAATrp[21]；CpaD（異戊烯基轉(zhuǎn)移酶）繼而催化異戊烯基化反應(yīng)生成β-CPA[22]；β-CPA再通過分子環(huán)化反應(yīng)生成為α-CPA[23-24]；后者依次在CpaH（P450單加氧酶）和CpaM（甲基轉(zhuǎn)移酶）的作用下修飾成speradine類衍生物[25]；此外，還存在許多speradine繼續(xù)經(jīng)氧化的產(chǎn)物，但它們的形成機(jī)制尚不清楚。

圖1 CPA生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of CPA

基于該生物合成途徑及上述科學(xué)假設(shè)，作者嘗試將鹵代色氨酸嵌入CPA生物合成途徑，利用其下游酶對底物的特異性造成生物合成的提前中斷并引起非天然中間產(chǎn)物的富集，這種表觀富集效應(yīng)將為發(fā)展新型特異性CPA毒素檢測方法提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)菌株A.oryzae HMPF28：分離自大連凌水橋潮間帶采集的繁茂海綿中，保存于中科院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究及浙江大學(xué)海洋學(xué)院海洋生物與藥物研究所。

培養(yǎng)基：用人工海水配制改良察氏液體培養(yǎng)基（組 分g/dL）：蔗 糖3，NaNO30.2，K2HPO40.1，KCl 0.05，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001；自 然pH，固體培養(yǎng)基為上述改良察氏液體培養(yǎng)基中加入2 g/dL瓊脂。

人工海水（組分g/dL）：CaCl20.147，硼砂0.002 6，KCl 0.068，MgCl21.078，NaCl 2.35，EDTA 0.000 03，NaHCO30.019 6，Na2SiO30.003，Na2SO40.4。

1.1.2 主要儀器與試劑5-Fluoro-L-tryptophan（5-F-Trp）：購自Acros公司；色譜甲醇及乙腈：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他培養(yǎng)基成分：市售分析純級試劑。高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：安捷倫6230液質(zhì)聯(lián)用儀（HPLC-TOF-MS）；色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；固相萃取小柱：PEP-SPE（官能化聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取柱）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 5-F-Trp的Feeding實(shí)驗(yàn)與樣品預(yù)處理從甘油管中取200μL菌株保藏液，均勻涂布到改良察氏固體培養(yǎng)基上，用封口膜將培養(yǎng)皿密封，倒置放于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)5 d。將活化后的菌株接種到含100 mL改良察式液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于恒溫培養(yǎng)箱中于28℃、180 r/min培養(yǎng)8 d。利用二次添加法，分別在培養(yǎng)48 h后添加至終濃度為0.5 mmol/L的外源底物5-F-Trp固體與72 h添加至最終濃度為1 mmol/L的外源底物5-FTrp固體，對照組不添加5-F-Trp。所得發(fā)酵液經(jīng)離心除去菌體，上清液中的代謝產(chǎn)物采用PEP-SPE進(jìn)行富集。將100 mL發(fā)酵液通過活化的PEP-SPE小柱進(jìn)行吸附，先用4 mL超純水洗去雜質(zhì)，再用4 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液洗脫得待分析樣品。

1.2.2 LC-MS分析

1）LC-MS分析條件 色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流量：0.5 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的超純水（流動(dòng)相A），色譜乙腈（流動(dòng)相B）。

2）洗脫條件 0~10 min：體積分?jǐn)?shù)88%流動(dòng)相A和12%流動(dòng)相B至65%流動(dòng)相A和35%流動(dòng)相B梯度洗脫；10~30 min：65%流動(dòng)相A和35%流動(dòng)相B至30%流動(dòng)相A和70%流動(dòng)相B梯度洗脫；30~37 min：30%流動(dòng)相A和70%流動(dòng)相B至100%流動(dòng)相B梯度洗脫；37~43 min：100%流動(dòng)相B等梯度洗脫；43~50 min：88%流動(dòng)相A和12%流動(dòng)相B平衡。

正離子總離子流模式掃描，同時(shí)檢測波長220、285 nm的紫外色譜圖，提取色譜法高分辨離子峰對相應(yīng)代謝物進(jìn)行定性分析。質(zhì)譜儀條件：電噴霧離子源（ESI源）；離子模式：正離子模式；噴霧電壓：3 kV；汽化溫度：300℃；毛細(xì)管溫度：270℃；掃描范圍：相對分子質(zhì)量150~2 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株A.oryzae HMP-F28的主要代謝產(chǎn)物

在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下，未添加底物的HMP-F28菌株發(fā)酵液中可見CPA產(chǎn)物α-CPA（m/z 337.1547[M+H]+，產(chǎn)物6）及β-CPA（m/z 339.170 3[M+H]+，產(chǎn)物5）的典型準(zhǔn)分子離子峰，其中α-CPA（m/z 337.1547[M+H]+）為主要代謝產(chǎn)物，見圖2。除此之外，還發(fā)現(xiàn)二酮哌嗪cyclo（N-methyl-Lue-Trp）（m/z 314.1863[M+H]+，產(chǎn)物1）的產(chǎn)生。這說明米曲霉HMP-F28是一個(gè)CPA產(chǎn)生菌株，其主要CPA存在形式為α-CPA，同時(shí)也存在speradine型經(jīng)氧化和甲基化的衍生物3和衍生物4。同時(shí)其他類型代謝物相對較少，是一個(gè)較理想的檢驗(yàn)外源分子探針嵌入目標(biāo)生物合成途徑的細(xì)胞體系。

圖2 A.oryzae HMP-F28的主要代謝產(chǎn)物Fig.2 Major metabolites produced by A.oryzae HMP-F28

2.2 5-F-Trp分子進(jìn)入CPA代謝途徑的產(chǎn)物

當(dāng)在HMP-F28發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5-F-Trp后，可以清楚地觀察到原CPA類色譜峰的消失（圖3），同時(shí)在23.7 min處發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的色譜峰的出現(xiàn)。這說明外源添加物對CPA生物合成途徑發(fā)揮了預(yù)期阻滯作用，使其主要終產(chǎn)物含量急劇減少乃至消失。進(jìn)一步提取該新色譜峰的高分辨質(zhì)譜圖可知，該代謝物給出了m/z 289.098 3[M+H]+及C15H14FN2O3+準(zhǔn)分子離子峰，對應(yīng)分子式C15H13FN2O3，這與預(yù)期的CPA生物合成途徑中第一個(gè)中間體cAATrp的5-氟代衍生物相符合（圖4），因此將該新產(chǎn)物鑒別為5-F-cAATrp（衍生物7）。在添加5-F-Trp底物后，菌株中富集5-F-cAATrp，說明5-F-Trp可以進(jìn)入CPA生物合成途徑并經(jīng)CpaS酶的催化生成的5-F-cAATrp。但是除了5-F-cAATrp外，其生物合成下游代謝產(chǎn)物并未見明顯富集，意味著5-F-cAATrp相對于天然底物cAATrp來說不是一個(gè)CpaD合適的底物。這造成5-F-cAATrp從CpaS釋放后，立即被CpaD的底物特異性限制，無法再次進(jìn)入CPA生物合成途徑并被繼續(xù)加工成下游產(chǎn)物。

圖3 不添加底物（上）及添加5-F-Trp（下）的A.oryzae HMP-F28代謝圖譜Fig.3 Metabolic profiles of A.oryzae HMP-F28 without（upper panel）or with（lower panel）the addition of 5-F-Trp

圖4 5-F-Trp轉(zhuǎn)為為5-F-cAATrp的示意圖Fig.4 Conversion of 5-F-Trp into 5-F-cAATrp

值得注意的是，一般情況下當(dāng)外源底物進(jìn)入了某個(gè)天然產(chǎn)物的生物合成途徑后，通常仍然會(huì)觀察到目標(biāo)生物合成途徑天然產(chǎn)物的產(chǎn)生。這是因?yàn)椋瑹o論是原始添加物或者添加物經(jīng)該途徑修飾的衍生物對于相應(yīng)的催化酶來說都不是天然底物，因此很難超過天然底物對催化酶活性位點(diǎn)的競爭。本研究結(jié)果顯示，5-F-Trp的添加造成了α-CPA及下游產(chǎn)物的消失，同時(shí)也未見上游cAATrp及β-CPA的積累，這意味著5-F-Trp對原CPA途經(jīng)的抑制最早可能發(fā)生在CpaS酶NRPS模塊中的A domain（腺苷酸化結(jié)構(gòu)域）對色氨酸的激活步驟，尤其當(dāng)5-FTrp過量存在時(shí)，大量的5-F-色氨酰AMP的產(chǎn)生使T domain（硫酯化結(jié)構(gòu)域）難以捕捉到天然底物色氨酰AMP并生成cAATrp。綜上可知，5-F-Trp應(yīng)是CpaS酶各個(gè)結(jié)構(gòu)域的較合適的底物，因而可以抑制CPA生物合成途徑所有天然產(chǎn)物及中間體的產(chǎn)生；同時(shí)，5-F-cAATrp并非異戊烯基轉(zhuǎn)移酶CpaD的合適底物，造成5-F-Trp的非天然衍生產(chǎn)物經(jīng)CpaS加工后立即被CpaD限制形成早期產(chǎn)物富集，這種富集效應(yīng)非常有利于對米曲霉、青霉可能含有活躍CPA毒素生物合成基因簇的定性檢測和定量測定。

3 結(jié) 語

作者以CPA毒素產(chǎn)生菌米曲霉為研究對象，發(fā)現(xiàn)添加外源5-F-Trp可以阻斷CPA毒素(α-CPA及β-CPA)的產(chǎn)生；同時(shí)因5-F-Trp可嵌入CPA的生物合成途徑并造成非天然上游產(chǎn)物5-F-cAATrp的大量富集，這種富集效應(yīng)可將所有CPA代謝途徑的下游產(chǎn)物整合為單一化合物5-F-cAATrp。考慮到α-CPA可經(jīng)過N-甲基化、多重氧化反應(yīng)等一系列后修飾步驟生成多達(dá)30余種毒素衍生物，因而通過探針分子5-F-Trp可有效整合這些復(fù)雜的后修飾衍生物。利用這種方法可將多個(gè)代謝物的定性與定量工作簡化為針對單一目標(biāo)化合物的檢測和分析。這對于實(shí)現(xiàn)CPA毒素的高效檢測、保障食品安全等方面具有較好的參考價(jià)值。