β-1,3-葡聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的表達與性質(zhì)

張佳妮，徐 巖，喻曉蔚*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.39和3.2.1.6）作用于β-葡聚糖主鏈中的β-1，3-糖苷鍵，在制備活性葡寡糖、酵母裂解、預(yù)防真菌病害等方面有廣泛應(yīng)用[1-2]。來源于藤黃節(jié)桿菌的βglⅠ（Athrobacter luteu ATCC 21606，βglⅠ）是糖苷水解酶64家族的內(nèi)切型β-1，3-葡聚糖酶，該酶在酵母裂解活性上具有突出優(yōu)勢，可用于酵母營養(yǎng)物的抽提[1]。酵母細胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、氨基酸和核苷酸，其抽提物在食品風(fēng)味改善上具有廣泛應(yīng)用，采用條件溫和的酶解法進行細胞破壁，營養(yǎng)成分損失小，可有效利用胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)[3]。但是野生菌的βglⅠ表達水平低，僅3.5 U/mL[4]，因而商品化的藤黃節(jié)桿菌β-1，3-葡聚糖酶成本高，價格昂貴，亟待提高該酶的表達水平。薛偉[5]等人利用大腸桿菌胞內(nèi)表達βglⅠ，粗酶液裂解活性達161 U/mL，但革蘭氏陰性細菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素等有害成分，不適于進行食品表達應(yīng)用。食品級安全菌株枯草芽孢桿菌常作為原核外源蛋白質(zhì)分泌表達的宿主，主要通過蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、轉(zhuǎn)運和折疊等方面優(yōu)化來提高異源蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌中的表達量[6-8]。

在本研究中，利用枯草芽孢桿菌異源表達βglⅠ，通過優(yōu)化篩選信號肽、RBS、5′UTR序列以期獲得βglⅠ的高產(chǎn)菌株，并對βglⅠ進行純化及酶學(xué)性質(zhì)研究。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

Bacillus subtilis WB600、Escherichia coli JM109和表達質(zhì)粒pNSWP：江南大學(xué)釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室保存。

1.2 試劑與儀器

A.luteuβglⅠ基因：金唯智公司進行密碼子優(yōu)化并合成；引物、四環(huán)素抗生素（Tetracycline hydrochloride）：購自上海生工；PCR產(chǎn)物純化試劑盒：購自康為世紀(jì)；DNA Marker、Protein Marker、高保真聚合酶PrimeSTAR：購自TaKaRa公司；MultiF Seamless Assembly Mix：購自ABclonal公司；AZCLCurdlan：購自Megazyme公司。

AKTA蛋白質(zhì)純化儀：GE公司；PCR儀、酶標(biāo)儀、電泳儀：BIO-RAD公司；紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：氯化鈉1 g/dL，蛋白胨1 g/dL，酵母浸粉0.5 g/dL。

TB培養(yǎng)基：蛋白胨1.2 g/dL，酵母浸粉2.4 g/dL，K2HPO4·3H2O 1.64 g/dL，KH2PO40.23 g/dL，甘 油0.5 g/dL。

1.4 基因克隆與重組表達系統(tǒng)的構(gòu)建

采用MultiF Seamless Assembly Mix試劑盒通過無縫克隆技術(shù)將密碼子優(yōu)化的βglⅠ基因連接到pNSWP載體上，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pNSWP-βglⅠ，該質(zhì)粒在大腸桿菌中表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性，在枯草芽孢桿菌中表現(xiàn)出四環(huán)素抗性。βglⅠ基因位于該載體上枯草芽孢桿菌α淀粉酶啟動子PamyE以及amyE信號肽下游，從而進行分泌表達。將測序正確的重組質(zhì)粒從大腸桿菌JM109中提取、純化后，采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞中，涂布在LB（+Tetracyclines 20μg/mL）平板上，挑取陽性單克隆，PCR驗證，獲得重組菌株WB600/pNSWP-βglⅠ，以空載體轉(zhuǎn)化菌株WB600/pNSWP為陰性對照。采用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建各個突變質(zhì)粒，并構(gòu)建相應(yīng)突變菌株。

1.5 重組菌株的發(fā)酵以及βglⅠ的表達

將重組菌株劃線于LB平板（+Tetracycline 20 μg/mL）上培養(yǎng)12 h后，將單個菌落接種到5 mL LB培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)9～10 h。吸取2.5 mL種子液接種于50 mL TB培養(yǎng)基中，添加四環(huán)素至終質(zhì)量濃度為20μg/mL。將搖瓶置于37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，每隔6 h取樣測定發(fā)酵樣品的相關(guān)參數(shù)，包括OD600、酶活、SDS-PAGE。

1.6 親和層析純化βglⅠ

在βgl I蛋白質(zhì)的C端添加6 His純化標(biāo)簽，搖瓶發(fā)酵48 h后收集發(fā)酵液，然后采用60%飽和度、pH 8.0的硫酸銨溶液于0℃濃縮沉淀粗酶液4～5 h。收集蛋白質(zhì)沉淀并用pH 8.0 Tris-HCl（20 mmol/L）緩沖液透析處理，用Ni2+親和層析柱純化βgl I。純化的βgl I置于終體積分數(shù)為10%的甘油中，液氮速凍后于-80℃保存。

1.7 βglⅠ酶活測定

βglⅠ酶活測定方法參照Brumm P的方法[9]。反應(yīng)體系由5 mg AZCL-Curdlan[10-12]底物、490μL pH 6.0（100 mmol/L）磷酸鉀緩沖液以及10μL酶液組成，在50℃、1 000 r/min下反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后立即加入50μL HCl（4 mol/L）終止反應(yīng)，吹吸混勻后冰浴2 min。然后于12 000 r/min離心3 min，收集上清液，取200μL上清液于96孔板中，使用酶標(biāo)儀測定A590。將10μL酶液替換為緩沖液作為空白對照。

單位酶活U定義為，在50℃及pH 6.0條件下，使5 mg AZCL-Curdlan底物溶液的上清液在590 nm處吸光值每分鐘增加0.1所需要的酶量為一個單位（U）。

式中：△A為樣品上清液A590減去空白對照上清液A590；V為反應(yīng)酶液體積，mL；t為反應(yīng)時間，min。

1.8 最適溫度及最適pH值的測定

參照1.7酶活測定方法，測定純化的酶溶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、80℃下的酶活，確定βglⅠ的最適反應(yīng)溫度。

參照1.7酶活測定方法，在最適反應(yīng)溫度下測定純化的酶溶液在pH 4.0、pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 9.0的酶活，確定βglⅠ的最適反應(yīng)pH值。

1.9 溫度穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性的測定

參照1.7酶活測定方法，探究βglⅠ的溫度穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性。

溫度穩(wěn)定性測定：將純化的酶溶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、80℃下孵育30 min后，在最適溫度及最適pH條件下測定殘余酶活。

pH值穩(wěn)定性測定：將純化的酶溶液在pH 4.0、pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 9.0的緩沖液中4℃孵育6 h后，在最適溫度及最適pH值條件下測定殘余酶活。

1.10 金屬離子對酶促反應(yīng)的影響

參照1.7酶活測定方法，在酶活力測定反應(yīng)體系中分別加入K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+至終濃度為5 mmol/L，然后在最適反應(yīng)條件下測定酶活。所 選 金 屬 鹽 為KCl、CaCl2、MgSO4、MnSO4·H2O、CuSO4、ZnSO4·7H2O。為防止金屬離子與緩沖液產(chǎn)生離子沉淀反應(yīng)，使用pH 6.0（100 mmol/L）檸檬酸緩沖液代替磷酸緩沖液配制各反應(yīng)體系。

2 結(jié)果

2.1 重組酶在枯草芽孢桿菌中的表達

在WB600/pNSWP-βglⅠ表達體系中，βglⅠ基因由枯草芽孢桿菌α淀粉酶啟動子PamyE啟動轉(zhuǎn)錄表達。參照培養(yǎng)方法1.5進行WB600/pNSWP-βglⅠ搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵60 h后結(jié)束，發(fā)酵趨勢見圖1。在WB600/pNSWP-βglⅠ發(fā)酵24 h后，βglⅠ表達量開始增加；48 h時酶活可達195 U/mL；60 h時OD600開始下降，但酶活持續(xù)增高。

圖1 WB600/pNSWP-βglⅠ搖瓶發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curves of WB600/pNSWP-βglⅠin shake flask

2.2 信號肽對βglⅠ表達的影響

在本研究中，采用半理性篩選的方法選擇表1中10條信號肽，替換載體上初始信號肽SPamyE（SP0），分別包括Tat分泌類型和Sec分泌類型信號肽。

表1 枯草芽孢桿菌中的表達信號肽Table 1 Signal peptides expressed in Bacillus subtilis

在發(fā)酵48 h時取樣測定各菌株的酶活與生物量，以出發(fā)菌株SP0（WB600/pNSWP-βglⅠ）為對照。在生物量生長上除SP10生物量偏高，各菌株無明顯差異。SP1和SP10導(dǎo)致重組βglⅠ未表達，SP4與SP9的酶活顯著提高，前者為Tat分泌類型，后者屬于Sec分泌類型。相較于出發(fā)菌株SP0酶活195 U/mL，以SP4為信號肽酶活提高了40%，以SP9為信號肽酶活提高了33%，見圖2。在本研究中，Tat分泌類型的SP4（LipA）更有利于βglⅠ在WB600表達系統(tǒng)中表達，該重組菌株命名為WB600/pNSWPSPLipA-βglⅠ。

圖2 信號肽對βglⅠ在WB600中表達的影響Fig.2 Effect of signal peptide on the expression ofβglⅠin WB600

2.3 RBS及5′UTR對βglⅠ表達的影響

RBS（Ribosome-Binding Site，RBS）序列優(yōu)化以及5′UTR（5′Untranslated region，5′UTR）序列優(yōu)化均在pNSWP-SPLipA-βglⅠ質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建。RBS序列在翻譯上影響目的蛋白質(zhì)的表達量。在枯草芽孢桿菌中，RBS序列中的核心區(qū)SD（Shine-Dalgarno，SD）序列大多符合“AAGGAGG”序列特點[18-19]，該序列與16S rRNA 3′末端反向互補，其中啟動子PgsiB下游的RBS被認為是已知枯草芽孢桿菌翻譯強度非常強的天然RBS序列[20-21]。設(shè)計6條RBS序列替換載體上初始RBSamyE（R0）序列，見表2。5′UTR序列對mRNA的穩(wěn)定性有一定影響。研究表明，若5′UTR含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且游離核苷酸較少，則更有利于mRNA的穩(wěn)定，半衰期則更長[22]。選擇5′末端含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)且半衰期大于20 min的5′UTR序列：sp82、aprE、cry3A，替換載體上初始amyE 5′UTR，其中sp82和cry3A 5′UTR上游接PamyE上分解代謝物操縱子amyO[24]序列，下游接初始RBSamyE（R0）序列；aprE 5′UTR替換amyE 5′UTR全部序列，見表3。對照為出發(fā)菌株上amyE 5′UTR，經(jīng)查閱其半衰期僅為5 min[23]。

表2 枯草芽孢桿菌相關(guān)RBS序列Table 2 Related RBS sequences of Bacillus subtilis

表3 枯草芽孢桿菌相關(guān)5’UTR序列Table 3 Related 5′UTR sequences of Bacillus subtilis

以SP0（WB600/pNSWP-βglⅠ）為出發(fā)菌株作為實驗對照，48 h發(fā)酵結(jié)束，RBS優(yōu)化結(jié)果見圖3。其中R3比出發(fā)菌株高120 U/mL，但與SP4（WB600/pNSWP-SPLipA-βglⅠ）相比僅高出40 U/mL，即高出約0.15倍，表達優(yōu)勢不明顯。R1為將RBSamyE的SD序列突變?yōu)榕c16S rRNA 3′末端嚴(yán)格反向互補序列“AAAGGAGG”，結(jié)果反而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達量下降。R4、R5、R6為“RBS Calculator v2.1”（https：//salislab.net/software/design_rbs_calcu-lator）[18，28]以 最高翻譯強度優(yōu)化的不同長度的RBS序列，但對于βglⅠ的表達量無明顯提高。

圖3 RBS序列對βglⅠ在WB600中表達的影響Fig.3 Effect of RBS sequence on the expression ofβglⅠin WB600

5′UTR序列均選擇天然序列，替換初始amyE 5′UTR，發(fā)酵48 h結(jié)束，結(jié)果見圖4。sp82和aprE 5′UTR序列均導(dǎo)致βglⅠ表達量下降，反之，cry3A 5′UTR對于βglⅠ在枯草芽孢桿菌中的表達貢獻極大，比SP4（WB600/pNSWP-SPLipA-βglⅠ）酶活高出169 U/mL，比出發(fā)菌株SP0（WB600/pNSWP-βglⅠ）高出249 U/mL，約1.2倍。SDS-PAGE結(jié)果見圖5，βglⅠ相對分子質(zhì)量大小在57 000左右[14]，pNSWPcry3A-SPLipA-βglⅠ在該位置條帶比對照pNSWP-βglⅠ粗。

圖4 5′UTR序列對βglⅠ在WB600中表達的影響Fig.4 Effect of 5′UTR sequence onβglⅠexpression in WB600

圖5 βglⅠSDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE profile ofβglⅠ

2.4 βglⅠ的酶學(xué)特性分析

最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測定結(jié)果見圖6，以最高比活為100%。βglⅠ在50℃左右顯示出最高比活；溫度超過60℃時，不再利于βglⅠ的酶促反應(yīng)；低于45℃條件下孵育30 min對βglⅠ酶活影響較?。坏?0℃條件下孵育30 min，酶活開始有明顯下降；55℃孵育30 min后，βglⅠ接近于徹底失活。

圖6 βglⅠ的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.6 Optimum reaction temperature and temperature stability ofβglⅠ

最適pH和pH穩(wěn)定性的測定結(jié)果見圖7。βglⅠ的最適pH值在6.0左右，最適反應(yīng)條件下比活約為973 U/mg。酶活在pH 5.5～6.5較高，該酶的穩(wěn)定性較強，在pH 4.0～9.0孵育6 h后，依然有80%以上殘余酶活。

圖7 βglⅠ的最適pH值和pH值穩(wěn)定性Fig.7 Optimum pH and pH stability ofβglⅠ

近期研究發(fā)現(xiàn)，許多糖苷水解酶含有βγ-結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有Ca2+結(jié)合位點，這表明Ca2+對于糖苷水解酶的酶促反應(yīng)具有一定貢獻[29-30]。因而作者研究了K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+6種金屬離子對βglⅠ的酶活影響[30]，結(jié)果見圖8。與不添加任何金屬離子的對照相比，6種金屬離子對βglⅠ的酶促反應(yīng)無明顯影響。

圖8 金屬離子對βglⅠ酶促反應(yīng)的影響Fig.8 Effect of metal ions onβglⅠenzymatic reaction

3 討 論

藤黃節(jié)桿菌來源的βglⅠ在裂解酵母制備酵母抽提物中具有突出的優(yōu)勢。然而，βglⅠ在生產(chǎn)中存在野生型或外源表達水平低的問題，且還未有報道其在枯草芽孢桿菌中表達。本研究采用食品級安全菌株枯草芽孢桿菌表達βglⅠ，并通過優(yōu)化表達元件來提高βglⅠ的產(chǎn)量，對拓展βglⅠ在食品、飼料中的應(yīng)用具有重要意義。

在本研究中，采用了較強組成型啟動子PamyE以及amyE信號肽將βglⅠ在WB600中進行分泌表達，進一步通過優(yōu)化信號肽、RBS和5′UTR提高了βglⅠ的表達量。信號肽決定新合成蛋白質(zhì)的分選、轉(zhuǎn)運，對于目的蛋白質(zhì)在異源宿主中的表達也有一定影響。研究發(fā)現(xiàn)，信號肽具有如下特征能夠更加有效地促進蛋白質(zhì)分泌，如含有帶正電荷更高的N-結(jié)構(gòu)域，更疏水的H-結(jié)構(gòu)域和更保守的C-結(jié)構(gòu)域[31-32]。作者比較了11條信號肽，結(jié)果顯示，Tat分泌類型的SP4（LipA）與Sec分泌類型的SP9（Mpr）能夠提高βglⅠ的胞外表達水平，發(fā)酵上清液中粗酶酶活比出發(fā)菌株SP0分別高0.4倍和0.3倍，這兩條信號肽的N-結(jié)構(gòu)域正電荷數(shù)和H-結(jié)構(gòu)域疏水性都處于較高水平。CAZY數(shù)據(jù)庫（http：//www.cazy.org/GH64_characte-rized.html）中表明βglⅠ蛋白質(zhì)通過Tat分泌途徑分泌至胞外環(huán)境中，在本研究中，Tat分泌類型的信號肽SP4（LipA）更有利于βglⅠ在枯草芽孢桿菌WB600宿主中表達，這可能與βglⅠ屬于Tat分泌途徑蛋白質(zhì)有關(guān)。

RBS是翻譯起始和蛋白質(zhì)表達的關(guān)鍵控制元件[28]。在本研究中，初始RBS采用了PamyE下游的RBS序列“AATAAGGAGTGT”，為了增強翻譯強度從而提高目的蛋白質(zhì)的表達量，比較了7條RBS序列的表達效果。結(jié)果顯示，R3（RBSgsiB）表達量最高，粗酶酶活比出發(fā)菌株SP0高0.61倍。這可能是因為RBSgsiB的SD序列“5′-AAAGGAGG-3′”與16S rRNA 3′末端“3′-UUUCCUCC-5′”相互作用強度高，且距離翻譯起始位點ATG具有最佳的9 bp間隔。RBSgsiB被認為是枯草芽孢桿菌中翻譯強度非常強的天然RBS序列[20]。

5′UTR元件與mRNA的穩(wěn)定性密切相關(guān)，從而影響目的蛋白質(zhì)的表達量。在本研究中，amyE 5′UTR被用作初始5′UTR序列。據(jù)報道，該序列引導(dǎo)的amyE mRNA半衰期為5 min[23]。為了提高mRNA的穩(wěn)定性，從而提高βglⅠ的表達量，作者比較了4條5′UTR序列。結(jié)果顯示，cry3A 5′UTR更有利于βglⅠ的表達，與出發(fā)菌株相比酶活提高了1.2倍。據(jù)文獻報道，cry3A 5′UTR引導(dǎo)的mRNA半衰期為20 min，其5′末端含有與翻譯起始無關(guān)的SD序列“GAAAGGAGG”，該序列與16S rRNA 3′末端嚴(yán)格反向互補，是其穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素[33]。

βglⅠ的酶學(xué)特性研究較少，目前僅在最適pH以及底物特異性方面有相關(guān)報道[4]。作者對βglⅠ在溫度、pH、金屬離子影響等方面進行了研究。結(jié)果顯示，βglⅠ在50℃下顯示出最高酶活，在低于40℃下穩(wěn)定性較強。以往報道中并未探究βglⅠ的最適反應(yīng)溫度，測定活性時將βglⅠ置于37℃條件下反應(yīng)，然而37℃下βglⅠ的酶活顯示較低[4-5，14，34]。其他內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶也多在50℃左右顯示最高酶活[30，35-37]。βglⅠ的最適反應(yīng)pH值在6.0左右，這與已報道的βglⅠ的葡聚糖酶活性最適pH相符合[4]。βglⅠ在pH 4.0～9.0顯示出較高的pH穩(wěn)定性，孵育6 h后依然具有大于80%的殘余酶活。其他內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶也在pH 4.0～9.0條件下具有大于80%的殘余酶活[30，35]。

4 結(jié) 語

本研究實現(xiàn)了βglⅠ在枯草芽孢桿菌中的表達，通過優(yōu)化信號肽、RBS和5′UTR將其表達量提高了1.2倍，并研究了其酶學(xué)特性，為拓寬βglⅠ的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。