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    NtSPX4基因敲除對煙草苗期磷吸收和生長發(fā)育的影響研究

    2022-03-07 05:15:36單玉靜王召軍程澤華余婧雷波閆筱筱張洪映崔紅
    中國煙草學(xué)報(bào) 2022年1期
    關(guān)鍵詞:煙株株系結(jié)構(gòu)域

    單玉靜,王召軍,程澤華,余婧,雷波,閆筱筱,張洪映,崔紅*

    生物技術(shù)

    基因敲除對煙草苗期磷吸收和生長發(fā)育的影響研究

    單玉靜1,王召軍1,程澤華1,余婧2,雷波2,閆筱筱1,張洪映1,崔紅1*

    1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué),煙草學(xué)院,鄭州市文化路95號 450002;2 貴州省煙草科學(xué)研究院,煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽龍灘壩路29號 550081

    【目的】為探究基因在煙草磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用?!痉椒ā客纯寺×藷煵荩↙.)K326中基因,通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了和均發(fā)生純合突變的K326株系S42,在不同磷濃度的Hoagland溶液培養(yǎng)條件下,對S42株系的生長發(fā)育、物質(zhì)積累、磷吸收相關(guān)基因表達(dá)及有效磷含量變化進(jìn)行研究。【結(jié)果】煙草基因組中存在兩個(gè)同源基因,分別命名為和。其中CDS全長為924 bp,編碼氨基酸序列與祖先種林煙草NsylSPX4相同;CDS全長為933 bp,編碼氨基酸序列與祖先種絨毛煙草NtomSPX4相同。S42株系中和均在第52 bp處插入一個(gè)堿基T,導(dǎo)致NtSPX4蛋白翻譯提前終止。在標(biāo)準(zhǔn)Hoagland溶液培養(yǎng)條件下, S42株系的生長發(fā)育與對照無明顯差異;在高磷條件下,S42株系生長發(fā)育受到抑制,生物量較對照降低了約45%;在低磷條件下,S42株系生長勢優(yōu)于對照,生物量較對照提高了約39%。RT-PCR分析表明,在正常磷條件下,S42株系中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和的表達(dá)水平與對照基本一致,在高磷和低磷條件下,S42株系中和基因表達(dá)水平均顯著高于對照K326。有效磷檢測分析表明,不同磷濃度條件下,S42株系中有效磷含量均極顯著高于對照K326?!窘Y(jié)論】基因敲除在低磷條件下可以促進(jìn)煙株的生長發(fā)育,在高磷條件下對煙株生長發(fā)育有一定的抑制作用,在煙草磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中具有負(fù)向調(diào)控作用。

    煙草;;基因編輯;磷脅迫;磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

    磷是植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一,參與植物體內(nèi)多種代謝過程,缺磷會抑制細(xì)胞的分裂和增殖,造成植株生長發(fā)育遲緩甚至停止[1]。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì),我國約有2/3的土壤缺磷,并且由于土壤對磷的強(qiáng)烈化學(xué)固化作用,土壤中可吸收利用的有效磷極度缺乏[2]。通過分子手段篩選培育磷高效基因型的植物是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的研究方向之一。

    植物對磷的應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一百多個(gè)基因參與了植物的缺磷反應(yīng)[3-5]。研究表明含有SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)參與磷酸鹽穩(wěn)態(tài),包括磷轉(zhuǎn)運(yùn)和對磷缺乏的適應(yīng)[6]。SPX結(jié)構(gòu)域通常位于蛋白質(zhì)的N端,含有三個(gè)高度保守的子結(jié)構(gòu)域,每個(gè)子結(jié)構(gòu)域包含30~40個(gè)氨基酸。根據(jù)是否含有其他保守結(jié)構(gòu)域,SPX結(jié)構(gòu)域蛋白分為四個(gè)亞家族[7-8],擬南芥和水稻中第一亞家族的成員分別有4個(gè)(AtSPX1-4)和6個(gè)(OsSPX1-6)。擬南芥中,AtSPX1蛋白以磷依賴的方式抑制轉(zhuǎn)錄因子AtPHR1的活性,參與磷穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[9]。在水稻中研究發(fā)現(xiàn),是磷吸收的負(fù)調(diào)控因子。在正常情況下,OsSPX4通過SPX結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子OsPHR2蛋白的C端互作,抑制其進(jìn)入細(xì)胞核,從而影響下游磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)[10]。低磷脅迫能導(dǎo)致OsSPX4 蛋白泛素化,然后被26S蛋白酶體降解,從而釋放出PHR2并進(jìn)入細(xì)胞核行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,導(dǎo)致磷饑餓誘導(dǎo)基因表達(dá)上調(diào),從而增強(qiáng)植株對磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。因此,基因在植物對磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用。

    磷對煙株的抗性、煙葉品質(zhì)起著重要的作用[12]。缺磷會造成煙株生長緩慢、根系發(fā)育不良、成熟期推遲、葉片狹小、葉色暗綠,調(diào)制后的葉片缺乏光澤、油分不足、主要化學(xué)成分的含量及比例受到影響[13-14]。研究表明,植物體對磷素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用過程主要是由位于質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(,)家族調(diào)控[15],低磷能夠誘導(dǎo)家族的多數(shù)基因特異性表達(dá)或表達(dá)量上調(diào)。、是煙草中已經(jīng)克隆出的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,在缺磷水平下其轉(zhuǎn)錄本大量增加[16]。有研究表明在煙草中和的表達(dá)可能受到類似擬南芥和水稻中的SPX-PHR信號途徑調(diào)控[17]。但目前關(guān)于基因在煙草磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能還未見報(bào)道。因此,本研究采用同源克隆的方法獲得了煙草中的基因,創(chuàng)制基因敲除株系,通過研究不同磷濃度下煙苗的生長發(fā)育、磷吸收相關(guān)基因的表達(dá)和磷含量的變化,闡明對煙草磷吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,為培育磷高效煙草品種奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料為煙草主栽品種K326,培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件為14 h光,(28±1)℃/10 h暗,(24±1)℃,濕度為60%±2%。

    1.2 基因克隆及生物信息學(xué)分析

    以水稻中的基因序列在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/organism/Nicotiana tabacum/ genome)中進(jìn)行比對,獲得同源基因序列。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物(F1:5’-ATGAAATTC GGGAAAGAATTTA-3’,R1:5’-CTATTCTGGTGGAT GGGAATCC-3’),以K326葉片cDNA為模板擴(kuò)增基因CDS序列,反應(yīng)條件為98℃,5 min;98℃,30 s,58℃,30 s,72℃,45 s,35個(gè)循環(huán);72℃,5 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目標(biāo)片段并連接到pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性菌斑,提取質(zhì)粒后送金唯智公司進(jìn)行測序。

    NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)在線分析基因的保守結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN和MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化樹分析。

    1.3 組織表達(dá)模式分析

    分別取K326的根、莖、葉和花4個(gè)組織樣品,經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存。RNA提取按照TIANGEN公司試劑盒(DP441)說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄程序參照novoprotein公司的NovoScript? Plus All-in-one 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行。

    以煙草核糖體蛋白基因?yàn)閮?nèi)參(擴(kuò)增引物為F2:5’-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3’,R2:5’-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3’)[18],分別對(擴(kuò)增引物為F3:5’-TGAGACGATGGGA ATACGTAA-3’,R3:5’-GCTTCCAAAGGAAATAGGA GC-3’)和(擴(kuò)增引物為F4:5’-CAACCCTTC TTTACAACGGAG-3’,R4:5’-CCTCCTGTTGGCCC TTCTG-3’)進(jìn)行RT-PCR分析。反應(yīng)條件為95℃,2 min;95℃,15 s,60℃,15 s,72℃,20 s,40個(gè)循環(huán);溶解曲線為:95℃,15 s,60℃,15 s,20 min內(nèi)升至95℃,95℃,15 s。用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[19]。

    1.4 載體構(gòu)建

    根據(jù)和的CDS序列,在36-55 bp處設(shè)計(jì)gRNA靶位點(diǎn)序列(Targeting Sequence:5’-AGAAACCCTACCCGAATGGA-3’),該靶位點(diǎn)序列能同時(shí)敲除和兩個(gè)基因,并在靶位點(diǎn)序列5’端添加I酶切位點(diǎn),敲除載體與孟盈等人所用載體相同[20]?;瘜W(xué)合成靶位點(diǎn)序列及其反向互補(bǔ)序列,退火后形成Oligo二聚體,Oligo二聚體與CRISPR/Cas9載體經(jīng)I酶切后進(jìn)行連接,反應(yīng)體系如下:CRISPR/Cas9載體2.0 μL,Oligo二聚體1.0 μL,Enzyme Mix 1.0 μL,無菌水補(bǔ)充至10.0 μL,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng),挑選陽性菌斑,提取質(zhì)粒進(jìn)行測序,獲得NtSPX4-knockout基因編輯載體。

    1.5 遺傳轉(zhuǎn)化與分子鑒定

    采用凍融法[21]將NtSPX4-knockout基因編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101,煙草轉(zhuǎn)化采用葉盤轉(zhuǎn)化法[22],侵染后的葉片轉(zhuǎn)移到含有6.0 mg·L-1潮霉素、0.15 mg·L-1NAA、1 mg·L-16BA、500 mg·L-1噻孢霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)和篩選,分化芽轉(zhuǎn)至含有8.0 mg·L-1潮霉素、0.1 mg·L-1NAA、500 mg·L-1噻孢霉素的MS培養(yǎng)基上生根成苗。提取潮霉素抗性植株的DNA,在靶位點(diǎn)上下游根據(jù)和序列分別設(shè)計(jì)特異性引物(F5:5’-TTCATCACATGAT CACATCAG-3’,R5:5’-GGTAAATAAAATTCAGCAA ACAGA-3’;F6:5’-CAGTTGTTTAATTCCAACTAAG TG-3’,R6:5’-TGCAAGTGCGGGGGAGGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序篩選靶位點(diǎn)發(fā)生堿基突變的株系。

    1.6 磷濃度對煙苗生長發(fā)育的影響

    煙草種子消毒后,均勻等量點(diǎn)在浸透蒸餾水的海綿上(30 cm×20 cm×1 cm),置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng),種子露白后進(jìn)行光照培養(yǎng)。待煙苗長至兩葉一心期時(shí),將海綿轉(zhuǎn)移至不同磷濃度的Hoagland溶液中進(jìn)行培養(yǎng)。高磷處理(HP)中磷濃度為10 mmol·L-1、對照處理(MP)中磷濃度為1 mmol·L-1、低磷處理(LP)中磷濃度為0.005 mmol·L-1,其它元素濃度保持一致。低磷處理用KCl補(bǔ)充溶液中的K+,高磷處理用NaH2PO4補(bǔ)充溶液中的pi,調(diào)節(jié)PH至6.0。培養(yǎng)過程中,每天定時(shí)定量更換溶液,觀察記錄煙苗的生長發(fā)育狀況。

    1.7 煙苗生物量及有效磷含量測定

    處理20 d后,將海綿上的煙株取出稱重,每個(gè)處理10個(gè)生物學(xué)重復(fù),進(jìn)行煙苗生物量的測定。

    處理20 d后,每個(gè)處理取5株煙苗,混合均勻,進(jìn)行有效磷含量的測定,測定方法參照文獻(xiàn)中的步 驟[23]。

    1.8 磷吸收相關(guān)基因表達(dá)水平分析

    處理20 d后,取煙株根組織樣,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以為內(nèi)參,分別對(GenBank accession:AB020061,擴(kuò)增引物F7:5’-ATGGGCTTC TTTACTGATGC-3’,R7:5’-TTCCCATTTTATCTCC GAGCC-3’)和(GenBank accession:AB042951,擴(kuò)增引物F8:5’-CTTGGGCGTTTATACTACACC-3’,R8:5’-CCATGATAATCAAAGTCATACC-3’)進(jìn)行RT-PCR分析。反應(yīng)體系同方法1.3。

    1.9 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2003進(jìn)行整理,使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NtSPX4基因克隆及生物信息學(xué)分析

    煙草K326中,有兩條序列與水稻基因高度同源,在N端均具有一個(gè)典型的單一的SPX結(jié)構(gòu)域,分別命名為、。經(jīng)克隆、測序發(fā)現(xiàn),編碼區(qū)長924 bp,編碼區(qū)長933 bp,NtSPX4-2在60-62位較NtSPX4-1多了3個(gè)脯氨酸,二者氨基酸相似性為96.77%(圖1)。

    注:NtSPX4:烤煙;NsylSPX4:林煙草;NtomSPX4:絨毛煙草;BXSPX4:香料煙巴斯瑪;TN90SPX4:白肋煙TN90;NbSPX4:本氏煙。

    蛋白序列比對和進(jìn)化樹分析表明NtSPX4-1與林煙草中的NsylSPX4氨基酸序列相同,NtSPX4-2與絨毛煙草中的NtomSPX4氨基酸序列相同,說明和來源于不同的祖先種。在白肋煙TN90、香料煙巴斯瑪中均有兩條與NtSPX4-1和NtSPX4-2氨基酸序列分別相同的拷貝。在本氏煙中,NbSPX4-1與NtSPX4-1相似性為97.11%,NbSPX4-2與NtSPX4-2相似性為97.52%。NtSPX4-1、NtSPX4-2與番茄SlSPX4相似性分別為89.39%、92.32%,與水稻OsSPX4相似性分別為56.87%、56.19%,與擬南芥AtSPX4相似性分別為61.77%、60.55%(圖2)。該結(jié)果表明,NtSPX4在栽培煙草不同類型、不同品種之間高度保守,與本氏煙NbSPX4和番茄SlSPX4親緣關(guān)系較近,與水稻OsSPX4及擬南芥AtSPX4的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    圖2 NtSPX4及其同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

    2.2 NtSPX4基因組織表達(dá)模式分析

    和的組織表達(dá)特異性分析結(jié)果如圖3,、在根、莖、葉和花中均有表達(dá),在根和花中的表達(dá)水平顯著高于。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥和水稻中含有SPX結(jié)構(gòu)域的大多數(shù)基因也在不同器官中廣泛表達(dá),并且這些基因在根中能夠較快地響應(yīng)低磷脅迫從而調(diào)控磷的吸收及磷向其他器官的轉(zhuǎn)運(yùn)[7,24-26]。由此推測,煙草中和不僅參與了磷的吸收,也可能參與了磷的分配,并且在磷吸收過程中起到更加重要的作用。

    注:圖中*表示基因表達(dá)量差異在P <0.05水平具有顯著性。

    2.3 NtSPX4基因敲除和分子鑒定

    基因敲除的測序結(jié)果顯示有19株與野生型序列一致(圖4-a),25株在gRNA區(qū)域出現(xiàn)雙峰(圖4-b),1株發(fā)生純合突變(圖4-c),基因編輯效率約為58%。對圖4-c所示的單株S42進(jìn)行擴(kuò)增并測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)和在靶位點(diǎn)處均發(fā)生了如圖4-c所示的突變,說明和均發(fā)生了純合突變,在第52 bp處插入一個(gè)堿基T,這導(dǎo)致了的移碼突變,蛋白翻譯提前中止(圖4)。

    注:下劃線部分為PAM序列。

    2.4 磷濃度對NtSPX4純合突變株系生長發(fā)育和物質(zhì)積累的影響

    磷濃度對煙苗生長發(fā)育和物質(zhì)積累的影響結(jié)果顯示(圖5),處理20 d后,在磷濃度為1 mmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)Hoagland溶液(MP)中,S42株系與K326生長發(fā)育正常,二者無明顯差異;在磷濃度為10 mmol·L-1的高磷Hoagland溶液(HP)中,S42株系與對照K326相比生長發(fā)育受到抑制,對照K326莖圍較粗,株高較高,葉片較大,說明高磷對S42株系生長有一定抑制作用;在磷濃度為0.005 mmol·L-1的低磷Hoagland溶液(LP)中,S42株系與對照K326生長發(fā)育均受到抑制,出現(xiàn)發(fā)育遲緩、葉色深綠、葉片變厚等現(xiàn)象,但總體上S42株系株高較高,葉片數(shù)較多,葉片較大,生長勢優(yōu)于對照K326。生物量檢測結(jié)果表明,K326煙苗的鮮重隨著磷濃度的升高而增加,S42株系在正常磷濃度下生物量積累最高,在高磷和低磷條件下生物量減少,高磷條件下S42株系的生物量較對照降低了約45%左右,低磷條件下S42株系的生物量較對照提高了39%左右。說明基因的敲除,在高磷條件下對煙株的生長發(fā)育有一定的抑制作用,但在低磷條件下有助于煙株的生長發(fā)育和物質(zhì)積累。

    注:圖中*表示不同材料間差異在P<0.05水平具有顯著性。

    2.5 NtSPX4基因敲除對磷吸收相關(guān)基因表達(dá)及有效磷含量的影響

    不同磷濃度下煙株、的表達(dá)水平的測定結(jié)果顯示(圖6A、6B),在正常磷濃度處理下,S42株系和對照K326中,和基因的表達(dá)水平無顯著差異;在高磷和低磷濃度處理下,S42株系中和表達(dá)水平顯著高于對照K326。其中,高磷情況下,S42株系中表達(dá)量是對照的2倍,表達(dá)量是對照的4.4倍;低磷情況下,S42株系中表達(dá)量是對照的1.6倍,表達(dá)量是對照的1.5倍。該結(jié)果表明,基因的敲除可促進(jìn)煙草磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、的表達(dá)。S42株系和K326煙株的有效磷含量檢測結(jié)果如圖6C所示,在低磷、高磷以及正常磷濃度處理下,S42株系中可利用的有效磷含量均極顯著高于對照K326。這與磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、基因的表達(dá)趨勢基本一致,證明了基因的敲除提高了煙株對磷元素的吸收能力,促進(jìn)了有效磷的積累。

    注:圖中*表示不同材料間差異在P<0.05水平具有顯著性;**表示不同材料間差異在P<0.01水平具有顯著性。

    3 討論與結(jié)論

    植物磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控機(jī)制研究已取得較多進(jìn)展,但鮮有研究將其應(yīng)用于磷高效煙草品種的定向改良。水稻基因是磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)調(diào)控因子,該基因缺失突變體中磷含量顯著增加[27],煙草中基因功能尚未得到深入研究。本研究對煙草進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)同源基因,分別來源于祖先種林煙草和絨毛煙草,在第一外顯子區(qū)域60-62位處比多了3個(gè)脯氨酸。組織表達(dá)特異性分析表明,整體表達(dá)水平高于,而且在根和花中顯著高表達(dá),推測其在磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中具有比較重要的作用,這還需要對分別進(jìn)行功能研究來驗(yàn)證。

    本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了K326的基因純合突變株系S42,在此基礎(chǔ)上,研究S42株系與對照在不同磷濃度條件下生長發(fā)育、物質(zhì)積累、基因表達(dá)及有效磷含量等方面的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常磷濃度培養(yǎng)條件下,雖然S42株系中有效磷含量顯著高于對照株系,但S42株系的生長發(fā)育與對照無明顯差異,說明此時(shí)煙株體內(nèi)的有效磷含量處于適宜的范圍內(nèi),由此推測在煙株體內(nèi)有效磷含量在適宜的范圍內(nèi)時(shí),基因敲除對煙株生長發(fā)育沒有明顯影響;與正常磷濃度相比,在低磷脅迫下S42株系和對照中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、的表達(dá)水平均提高,但S42株系的增加程度顯著高于對照株系,與之相應(yīng)的,S42株系中有效磷含量也顯著高于對照株系,說明敲除株系能夠更好的響應(yīng)低磷脅迫,從而比對照表現(xiàn)出更優(yōu)的生長勢;而在高磷脅迫下,與正常磷濃度相比,對照株系中的表達(dá)水平均降低,但S42株系中的表達(dá)水平則未發(fā)生顯著下降,說明敲除株系不能正常響應(yīng)高磷脅迫,仍然保持較高的磷吸收水平,造成體內(nèi)磷濃度過高而使生長發(fā)育受到抑制。結(jié)果表明基因敲除可顯著提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、的表達(dá)水平和有效磷含量,促進(jìn)植株生長發(fā)育和物質(zhì)積累,該結(jié)果與水稻中研究報(bào)道相一致。不同的是,在水稻中突變體在正常條件下表現(xiàn)出“磷毒害”現(xiàn)象,植株葉尖發(fā)黃,但煙草中基因的敲除并未出現(xiàn)這一現(xiàn)象,這可能是由于單子葉植物與雙子葉植物對磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及分配利用存在差異,還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

    本研究結(jié)果表明,K326中基因的敲除,不僅使其在正常磷濃度的1/200的低磷脅迫條件下仍具有一定的耐受能力,而且在正常磷濃度10倍的高磷脅迫條件下煙株無明顯的磷中毒現(xiàn)象。鑒于K326本身是耐低磷且磷高效型品種[28],因而利用該基因?qū)ζ渌椎托У臒煵萜贩N進(jìn)行定向改良具有更為重要的意義,但本研究只是分析了敲除對煙株苗期磷吸收的影響,接下來還需要進(jìn)行不同磷供應(yīng)條件下的田間小區(qū)對比試驗(yàn),以比較該基因?qū)熤暾麄€(gè)發(fā)育周期的綜合性狀及烤后煙葉的產(chǎn)量品質(zhì)的影響。有研究表明水稻OsSPX4蛋白降解促使氮吸收關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NLP3易位至細(xì)胞核,從而提高植株對氮的吸收及積累[11]。關(guān)于在提高煙草氮利用效率中的調(diào)控作用將是下一步研究的重點(diǎn)。

    [1] 李廷軒,葉代樺,張錫洲,等. 植物對不同形態(tài)磷響應(yīng)特征研究進(jìn)展[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2017, 23(06): 1536-1546.

    LI Tingxuan, YE Daihua, ZHANG Xizhou, et al. Research advances on response characteristics of plants to different forms of phosphorus[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2017, 23(06): 1536-1546.

    [2] Carroll P. Vance, Claudia Uhde-Stone, Deborah L. Allan. Phosphorus acquisition and use: critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource[J]. New Phytologist, 2003, 157(3): 423-447.

    [3] 王慶竹,尚先文,湯緯瑋,等. 馬尾松基因的克隆及耐低磷功能分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2019, 27(06): 1016-1024.

    WANG Qingzhu, SHANG Xianwen, TANG Weiwei, et al. Cloning and low phosphorus tolerance function analysis offrom[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2019, 27(06): 1016-1024.

    [4] 劉允熙,羅佳佳,雷健,等. 柱花草磷高效種質(zhì)篩選及根系形態(tài)對低磷脅迫的響應(yīng)分析[J]. 草地學(xué)報(bào),2021, 29(05): 876-883.

    LIU Yunxi, LUO Jiajia, LEI Jian, et al. Screening of phosphorus efficiency germplasm and analysis of root morphology responding to phosphorus deficiency in[J]. Acta Agrestia Sinica, 2021, 29(05): 876-883.

    [5] 劉國選,陳康,陸星,等. 大豆調(diào)控根系響應(yīng)低磷脅迫的功能研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2021, 42(04): 33-41.

    LIU Guoxuan, CHEN Kang, LU Xing, et al. Function ofin soybean regulating root response to low phosphorus stress[J]. Journal of South China Agricultural University, 2021, 42(04): 33-41.

    [6] Ji-Yul Jung, Martina K Ried, Michael Hothorn, et al. Control of plant phosphate homeostasis by inositol pyrophosphates and the SPX domain[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2018, 49: 156-162.

    [7] David Secco, Chuang Wang, Bulak A. The emerging importance of the SPX domain-containing proteins in phosphate homeostasis[J]. New Phytologist, 2012, 193(4): 842-851.

    [8] Lin Shu-l, Santi Carole, Jobet Edouard, et al. Complex regulation of two target genes encoding SPX-MFS proteins by rice miR827 in response to phosphate starvation[J]. Plant & cell physiology, 2015, 51(12): 2119-31.

    [9] Puga María Isabel, Mateos Isabel, Charukesi Rajulu, et al. SPX1 is a phosphate-dependent inhibitor of Phosphate Starvation Response 1 in[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(41): 14947-14952.

    [10] Wen yuan Ruan, Meina Guo, Xueqing Wang, et al. Two RING-Finger ubiquitin E3 ligases regulate the degradation of SPX4, an internal phosphate sensor, for phosphate homeostasis and signaling in rice[J]. Molecular Plant, 2019, 12(8): 1060-1074.

    [11] Bin Hu, Zhimin Jiang, Wei Wang, et al. Nitrate–NRT1.1B– SPX4 cascade integrates nitrogen and phosphorus signalling networks in plants[J]. Nature Plants, 2019, 5(4): 401-413.

    [12] 朱列書. 煙草營養(yǎng)學(xué)[M]. 長春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,2003: 106.

    ZHU Lieshu. Tobacco Nutrition[M]. Changchun: Jilin Science and Technology Press, 2003: 106.

    [13] 岳倫勇,何華波,朱列書,等. 煙草的磷素營養(yǎng)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(23): 238-240.

    YUE Lunyong, HE Huabo, ZHU Lieshu, et al. Study on phosphorus nutrition of tobacco[J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2014(23): 238-240.

    [14] 章新,李明,楊碩媛,等. 磷素水平對煙葉化學(xué)成分和感官評吸質(zhì)量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010, 38(10): 5091- 5093+5109.

    ZHANG Xin, LI Ming, YANG Shuoyuan, et al. Effects of phosphorus level on chemical constituents and sensory quality of tobacco[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2010, 38(10): 5091-5093+5109.

    [15] Daniel P. Schachtman, Robert J. Reid, S.M. Ayling. Phosphorus uptake by plants: from soil to cell[J]. Plant Physiology, 1998, 116(2): 447-453.

    [16] Motoshi Kai, Kouji Takazumi, Hirofumi Adachi, et al. Cloning and characterization of four phosphate transporter cDNAs in tobacco[J]. Plant Science, 2002, 163(4): 837-846.

    [17] Daniel P. Schachtman, Ryoung Shin. Schachtman, Shin. Nutrient sensing and signaling: NPKS[J]. Annual Review of Plant Biology, 2007, 58: 47-69.

    [18] Sung-Chul Park, Yun-Hee Kim, Chang Yoon Ji, et al. Stable internal reference genes for the normalization of real-time PCR in different sweet potato cultivars subjected to abiotic stress conditions[J]. PLoS ONE, 2017, 7(12).

    [19] Kenneth J, Livak, Thomas D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

    [20] 孟盈,閆筱筱,王召軍,等.基因表達(dá)對煙草腺毛發(fā)生的影響[J]. 中國煙草學(xué)報(bào),2019, 25(02): 85-92+98.

    MENG Ying, YAN Xiaoxiao, WANG Zhaojun, et al. Effects ofexpression on tobacco trichomes[J].Acta Tabacaria Sinica, 2019, 25(02): 85-92+98.

    [21] 高樂. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)RNAi大豆花葉病毒基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

    GAO Le. Studies on agrobacterium-mediated soybean transformation with RNAigene of soybean mosaic virus[D].Nanjing: Nanjing Agricultural College, 2015.

    [22] 王關(guān)林,方宏均. 植物基因工程技術(shù)原理與技術(shù)[M]. 科學(xué)出版社,1998, 229-609.

    WANG Guanlin, FANG Hongjun. Principles and Techniques of Plant Genetic Engineering Technology[M]. Science Press, 1998, 229-609.

    [23] 季敏杰. 轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)煵萘孜蘸蛥仓采挠绊慬D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2017.

    JI Minjie. Effect of transcription factorgene on phosphorus uptake and arbuscular mycorrhizal symbiosis in tobacco[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural College, 2017.

    [24] Yong Wang, Cecile Ribot, Enea Rezzonico, et al. Structure and expression profile of thegene family indicates a broad role in inorganic phosphate homeostasis[J]. Plant Physiology, 2004, 135(1): 400-411.

    [25] Ke Duan, Keke Yi, Lei Dang, et al. Characterization of a sub-family ofgenes with the SPX domain reveals their diverse functions in plant tolerance to phosphorus starvation[J]. The Plant Journal, 2008, 54(6): 965-975.

    [26] Wang Zhiye, Hu Han, Huang Hongjie, et al. Regulation ofandon expression of OsSPX domain genes and Pi-starvation signaling in rice[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2009, 51(7): 663-674.

    [27] 鐘永嘉.與調(diào)控水稻磷信號和磷平衡的功能研究[D]. 杭州:浙江大學(xué),2015.

    ZHONG Yongjia. Function ofandon Pi- signaling and Pi-homeostasis in rice[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2015.

    [28] 龔絲雨. 煙草苗期耐低磷基因型篩選及生理機(jī)制研究[D]. 南昌:江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2019.

    GONG Siyu. Screening of low-phosphorus tolerant genotypes and its physiological mechanism of tobacco at seedling stage[D]. Nanchang: Jiangxi Agricultural University, 2019.

    Effect ofgene knockout on phosphorus absorption and growth of tobacco plants in seedling stage

    SHAN Yujing1, WANG Zhaojun1, CHENG Zehua1, YU Jing2, LEI Bo2, YAN Xiaoxiao1, ZHANG Hongying1, CUI Hong1*

    1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Guizhou Academy of Tobacco Science, Key Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guiyang 550081, China

    [Objective] This study aims to explore the role ofgene on phosphorus absorption and transport in tobacco plant. [Methods] In this research, we cloned thegene from tobacco (L.) cultivar K326 and obtained aandhomozygous mutant strain S42of K326 by CRISPR/Cas9 technology. The expressions of genes related to the growth, material accumulation, phosphorus absorption and available phosphorus content of S42and K326 were analyzed under different phosphorus concentration treatments. [Results] Twoparalogue genes were found in tobacco genome, namedand. The full length ofcoding sequence is 924 bp, and the amino acid sequence is identical to that of; the full length ofcoding sequence is 933 bp, and the amino acid sequence is identical to that of. In strain S42, bothandinserted a base T at 52 bp, which caused the premature of NtSPX4 protein translation. Under the standard Hoagland solution condition, we found that there was no significant difference between S42and K326 in growth. Under high-phosphorus condition, the growth of S42was inhibited, and the biomass was reduced by about 45% compared to that of the control. Under low-phosphorus condition, the growth of S42was better than that of the control, and the biomass was increased by about 39% compared to that of the control. RT-PCR analysis showed that the expression levels of the phosphorus transporter genesandin S42showed no significant difference compared with the control under normal phosphorus condition. Under high- phosphorus and low-phosphorus conditions, the expression levels of theandgenes in S42were significantly up-regulated. The available phosphorus detection analysis showed that the available phosphorus content in S42was significantly higher than that of the control under all treatments. [Conclusion] This study shows thatgene knockout can promote tobacco growth under low-phosphorus condition, while inhibit its growth under high-phosphorus condition.has a negative regulatory effect on phosphorus absorption and transport for tobacco plants.

    tobacco;; gene editing; phosphorus stress; phosphorus transporter

    Corresponding author. Email:cuihonger_13@163.com

    國家煙草專賣局科技計(jì)劃項(xiàng)目110202101005(JY-05)

    單玉靜(1996—),碩士研究生,煙草生物技術(shù),Email:1614504615@qq.com

    崔紅(1966—),教授,博士研究生導(dǎo)師,Email:cuihonger_13@163.com

    2021-08-30;

    2021-12-28

    單玉靜,王召軍,程澤華,等. NtSPX4基因敲除對煙草苗期磷吸收和生長發(fā)育的影響研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào),2022,28(1). SHAN Yujing, WANG Zhaojun, CHENG Zehua, et al. Effect of NtSPX4 gene knockout on phosphorus absorption and growth of tobacco plants in seedling stage[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(1). doi: 10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0152

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