靶向蛋白非催化功能的藥物開(kāi)發(fā)新策略

楊欣語(yǔ)，宋宜輝，余斌

（鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001）

蛋白質(zhì)在與生理功能密切相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。完整的結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)發(fā)揮正常生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。一個(gè)經(jīng)典的蛋白酶常由保守的催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域組成。催化結(jié)構(gòu)域與酶的催化活性直接相關(guān)，而非催化結(jié)構(gòu)域則主要通過(guò)催化功能非依賴的方式如支架蛋白功能、變構(gòu)調(diào)控和蛋白-蛋白相互作用等確定底物的特異性，或協(xié)調(diào)其與信號(hào)通路不同組分之間的相互作用，進(jìn)而調(diào)控酶的活性[1-2]。鑒于蛋白酶催化功能的重要性，長(zhǎng)期以來(lái)靶向蛋白酶保守的催化功能開(kāi)發(fā)抑制劑一直是藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但這類(lèi)抑制劑卻面臨著選擇性不高、特異性不強(qiáng)和臨床副作用多等挑戰(zhàn)，而蛋白非催化功能的特異性為高選擇性抑制劑的開(kāi)發(fā)提供了研究方向，也日漸引起了大家的關(guān)注?；诘鞍踪|(zhì)非催化功能的最新研究進(jìn)展和抑制劑開(kāi)發(fā)策略，本文通過(guò)系統(tǒng)總結(jié)靶向蛋白非催化功能開(kāi)發(fā)抑制劑的新策略，即非催化結(jié)構(gòu)域策略、變構(gòu)調(diào)控策略和蛋白-蛋白相互作用策略，為靶向蛋白非催化功能的抑制劑開(kāi)發(fā)提供研究思路。

1 蛋白非催化結(jié)構(gòu)域策略

酶的非催化結(jié)構(gòu)域可作為支架蛋白，通過(guò)與信號(hào)通路中的其他組分結(jié)合，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如胺氧化酶蛋白中的賴氨酰氧化酶樣蛋白-2（lysyl oxidase-like 2 protein，LOXL2）N末端特有的富含半胱氨酸的清道夫受體（scavenger receptor cysteine-rich，SRCR）結(jié)構(gòu)域可通過(guò)非依賴催化作用的支架功能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)和血管的生成[3]。研究表明，蛋白質(zhì)非催化結(jié)構(gòu)域參與調(diào)控RNA代謝，DNA修復(fù)，細(xì)胞分裂、分化和基因組穩(wěn)定性等各種細(xì)胞過(guò)程，與諸多疾病如癌癥和血栓的發(fā)生密切相關(guān)[4-7]。與傳統(tǒng)的靶向蛋白保守催化功能的藥物不同，針對(duì)蛋白特異性非催化結(jié)構(gòu)域開(kāi)發(fā)的小分子抑制劑可能具有更高的選擇性，在疾病治療領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景。目前已成功靶向了多個(gè)蛋白的非催化結(jié)構(gòu)域，如賴氨酸特異性去甲基化酶4A（lysine-specific demethylase 4A，KDM4A）的TUDOR結(jié)構(gòu)域和局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的非催化黏著斑定位區(qū)（focal adhesion targeting，F(xiàn)AT）等[6,8]，部分代表性的抑制劑如表1所示。

表1 蛋白非催化結(jié)構(gòu)域策略相關(guān)靶點(diǎn)研究現(xiàn)狀Table 1 Current status of research on targets with non-catalytic domain strategy

1.1 靶向賴氨酸特異性去甲基化酶4A的非催化結(jié)構(gòu)域研究現(xiàn)狀

在人類(lèi)基因組中，含有Jumonji C結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶（Jumonji C domain-containing histone demethylase，JHDM）家族成員組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶4（histone lysine-specific demethylase 4，KDM4）包 含A、B、C、D和E 5種不同的亞型，可以催化組蛋白H3第9位賴氨酸（histone H3 lysine 9，H3K9）和組蛋白H3第36位賴氨酸（histone H3 lysine 36，H3K36）的去甲基化[9-12]。5種亞型KDM4的N端均含由Jumonji N和Jumonji C組成的保守催化結(jié)構(gòu)域，分別為JmjN和JmjC，但C末端差異較大，僅4A、4B和4C 3種亞型的C末端包含獨(dú)特的串聯(lián)植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，PHD）和TUDOR結(jié)構(gòu)域（PDB ID：5D6X）[6]。研究表明：KDM4A、4B和4C的過(guò)表達(dá)與各種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是抗癌藥物開(kāi)發(fā)的重要作用靶點(diǎn)[13-15]。目前報(bào)道的KDM4小分子抑制劑主要靶向其保守的催化結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其作用機(jī)制可分為3大類(lèi)： 1）金屬螯合抑制劑，如N-草酰甘氨酸（N-oxalylglycine，NOG）是一類(lèi)α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）輔助因子的模擬物，通過(guò)與酶催化位點(diǎn)的Fe（Ⅱ）分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合而抑制KDM4蛋白的酶活性[16]。但這類(lèi)化合物的親水性結(jié)構(gòu)往往導(dǎo)致其具有較差的細(xì)胞穿透能力，因而限制了其臨床應(yīng)用[17]。2）金屬輔助因子干擾物，如雙硫侖（disulfiram）和依布硒（ebselen），通過(guò)阻止輔助因子如鐵和鋅的結(jié)合而抑制KDM4的酶催化活性[13]。3）組蛋白底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如MS275，其通過(guò)與底物組蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而達(dá)到抑制效果[13]。但由于KDM4酶家族催化機(jī)制的保守性，這些抑制劑面臨著選擇性差的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，含有TUDOR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程，如RNA 代謝、DNA損傷反應(yīng)和染色質(zhì)修飾中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，靶向KDM4中獨(dú)特的非催化TUDOR結(jié)構(gòu)域也成為開(kāi)發(fā)高選擇性抑制劑的潛在研究方向[4-5]。KDM4A也稱為含Jumonji結(jié)構(gòu)域蛋白2A（Jumonji domain containing 2A，JMJD2A），在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、促進(jìn)腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。與抗心律失常藥物胺碘酮類(lèi)似，化合物WAG-003通過(guò)靶向KDM4A的TUDOR結(jié)構(gòu)域中等抑制KDM4A的酶活性[13]?；衔颪，N-desethylami也對(duì)KDM4A的TUDOR結(jié)構(gòu)域具有抑制作用[18]。此外，共晶結(jié)構(gòu)顯示（PDB ID：5VAR）（見(jiàn)圖1），化合物3可直接與TUDOR結(jié)構(gòu)域的三甲基賴氨酸結(jié)合口袋結(jié)合而發(fā)揮抑制作用，為靶向KDM4酶家族的TUDOR結(jié)構(gòu)域開(kāi)發(fā)更高選擇性和高效力的非催化功能抑制劑奠定基礎(chǔ)[19]。

圖1 化合物3靶向KDM4A非催化TUDOR結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：5VAR）Figure 1 Crystal structure of compound 3 targeting the non-catalytic TUDOR domain of KDM4A (PDB ID: 5VAR)

1.2 靶向局部黏著斑激酶的非催化結(jié)構(gòu)域研究現(xiàn)狀

FAK也稱為蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase 2，PTK2），是一種由PTK2基因編碼的非受體型酪氨酸激酶，在整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要作用[20]。FAK由N端的4.1-埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白（FERM）結(jié)構(gòu)域、位于中心的激酶結(jié)構(gòu)域和C端2個(gè)富含脯氨酸的基序即富含脯氨酸基序1（proline-rich 1，PR1）和PR2及黏著斑定位區(qū)FAT結(jié)構(gòu)域組成（PDB ID：2QVX）[20]。其中位于中心的激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)揮酶催化功能。N端的FERM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)FAK與整合素和生長(zhǎng)因子受體等蛋白的直接相互作用，并通過(guò)與位于中心的激酶結(jié)構(gòu)域的直接結(jié)合而阻止底物與催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，保護(hù)FAK免受肉瘤蛋白激酶（sarcoma，Src）磷酸化的激活。C端的FAT結(jié)構(gòu)域包含多種蛋白-蛋白相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，引導(dǎo)FAK到各種細(xì)胞的黏著斑復(fù)合物中[20-22]。Tyr397是FAK的一個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，其自磷酸化介導(dǎo)了多個(gè)下游信號(hào)通路的激活[23]。在靜息狀態(tài)下，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域和中央激酶結(jié)構(gòu)域形成自抑制分子內(nèi)相互作用，F(xiàn)AK處于無(wú)活性狀態(tài)。一旦FERM結(jié)構(gòu)域和中央激酶結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用被阻斷，F(xiàn)AK將被激活[20]。FAK的活化可增強(qiáng)Tyr397等位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而激活FAK依賴的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、生存和遷移等活動(dòng)[24]。此外，F(xiàn)AK在轉(zhuǎn)移性腫瘤中過(guò)表達(dá)，其激活介導(dǎo)的p53降解也在細(xì)胞的增殖和存活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因而FAK是一個(gè)重要的腫瘤治療靶點(diǎn)[20]。目前報(bào)道的FAK小分子抑制劑分為兩大類(lèi)：激酶依賴性酶功能抑制劑和激酶非依賴性支架功能抑制劑。其中激酶依賴性抑制劑如TAE-226、PF-573228、PF-562271、PF-4554878和GSK-2256098等均靶向FAK激酶結(jié)構(gòu)域的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)抑制FAK的Tyr397或Tyr861位點(diǎn)的磷酸化而抑制FAK的活性，但這類(lèi)抑制劑在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有一定的局限性[20,24-25]。而另一類(lèi)激酶非依賴性小分子抑制劑如CFAK-C4通過(guò)靶向FAK非催化結(jié)構(gòu)域的支架功能而發(fā)揮抑制作用[26-27]。血管生長(zhǎng)因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3）是一種受體酪氨酸激酶，參與腫瘤細(xì)胞及其附近的淋巴管內(nèi)皮和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤的淋巴管生成[28-29]。CFAK-C4是一種靶向FAK 的FAT結(jié)構(gòu)域的VEGFR-3結(jié)合位點(diǎn)而開(kāi)發(fā)的小分子抑制劑，可以破壞VEGFR-3與FAK的相互作用。臨床前研究證明：CFAK-C4在包括胰腺癌、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和晚期黑色素瘤等諸多癌癥中呈現(xiàn)出治療效果，目前已被美國(guó)FDA認(rèn)定為孤兒藥[23-24,30]。因此，靶向FAK非催化結(jié)構(gòu)域的支架功能開(kāi)發(fā)阻斷FAK介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的高度特異性藥物將成為一種可行且有潛力的抑癌策略[26]。

1.3 靶向蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A1的非催化結(jié)構(gòu)域研究現(xiàn)狀

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A1（protein disulfide isomerase A1，PDIA1）是一種定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的硫醇二硫醚氧化還原酶，可催化其底物蛋白上半胱氨酸殘基之間二硫鍵的氧化、還原和異構(gòu)化，是重要的折疊催化劑。PDIA1包含2種不同類(lèi)型的類(lèi)硫氧化還原結(jié)構(gòu)域，即催化結(jié)構(gòu)域（a和a'）和非催化結(jié)構(gòu)域（b和b'）（PDB ID：4EKZ）（見(jiàn)圖2）。2種類(lèi)型結(jié)構(gòu)域的序列同源性為37%，均具有Cys-Gly-His-Cys（CGHC）活性位點(diǎn)基序，但卻獨(dú)立地發(fā)揮二硫鍵氧化、還原和異構(gòu)化功能。其中催化結(jié)構(gòu)域a和a'發(fā)揮催化功能，非催化型結(jié)構(gòu)域b和b'則通過(guò)支架功能發(fā)揮底物募集作用[31]。PDIA1參與如血小板活化、血栓形成和病毒感染等生物過(guò)程，其活性失調(diào)與諸多疾病如癌癥、心血管和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前靶向PDIA1抑制劑可分為兩大類(lèi)：催化a型結(jié)構(gòu)域抑制劑如RB-11-ca和KSC-34和非催化b型結(jié)構(gòu)域抑制劑如ML359、Rutin和BAP2。其中，化合物ML359和Rutin具有一定的體外抑制血小板聚集的活性，可有效地阻斷體內(nèi)血栓的形成。并且這2個(gè)化合物均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，為抗血栓的藥物治療奠定了基礎(chǔ)[32-33]?；衔顱AP2及其類(lèi)似物通過(guò)靶向PDIA1的b型非催化結(jié)構(gòu)域抑制DNA修復(fù)基因的表達(dá)進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤效果，因而B(niǎo)AP2可與DNA損傷劑聯(lián)合使用從而聯(lián)合治療惡性膠質(zhì)瘤[7,34]。

圖2 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A1的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：4EKZ）Figure 2 Crystal structure of PDIA1 (PDB ID: 4EKZ)

2 變構(gòu)調(diào)控策略

變構(gòu)調(diào)節(jié)是指小分子化合物與酶蛋白分子活性位點(diǎn)之外的某一位點(diǎn)特異性結(jié)合，通過(guò)改變酶蛋白分子的構(gòu)象變化而改變酶的活性[35]。與傳統(tǒng)的作用于活性位點(diǎn)的藥物相比，靶向變構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑具有更高的選擇性、較低的脫靶毒性和較低的劑量要求等優(yōu)勢(shì)[35-36]。因而尋找調(diào)控蛋白酶變構(gòu)調(diào)控機(jī)制的化合物也逐漸成為新藥研發(fā)的新策略。目前已針對(duì)多個(gè)靶蛋白如含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（src-homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2，SHP2）、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）、斷裂點(diǎn)簇集區(qū)（breakpoint cluster region，BCR）-艾貝爾遜酪氨酸激酶（Abelson tyrosine kinase， ABL）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）等的變構(gòu)調(diào)控機(jī)制成功開(kāi)發(fā)了多個(gè)變構(gòu)抑制劑[37-40]，部分代表性的抑制劑如表2所示。

表2 變構(gòu)調(diào)控策略相關(guān)靶點(diǎn)研究現(xiàn)狀Table 2 Current status of research on targets with allosteric regulation strategy

2.1 靶向含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2的變構(gòu)調(diào)控研究現(xiàn)狀

SHP2是由PTPN11基因編碼的一種非受體酪氨酸磷酸酶，是多個(gè)信號(hào)通路如RAS-RAF-MAPK-ERK、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-AKT-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Janus激 酶（Janus Kinase，JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等的關(guān)鍵調(diào)控因子[41-42]。SHP2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族（protein tyrosine phosphatase，PTP）的一員，全長(zhǎng)為593個(gè)氨基酸，由N末端的2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域N-SH2和C-SH2，中間保守的蛋白酪氨酸磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域PTP和C端尾巴組成[43]。在基底狀態(tài)下，SHP2采取自抑制構(gòu)象（PBD ID：2SHP），N-SH2結(jié)構(gòu)域被鉚定到PTP結(jié)構(gòu)域上，催化位點(diǎn)被堵塞。磷酸化蛋白的結(jié)合或激活突變將解除SHP2的自抑制狀態(tài)，SHP2將采取開(kāi)放構(gòu)象（PBD ID：6CRF）（見(jiàn)圖3）。N-SH2結(jié)構(gòu)域?qū)⑦h(yuǎn)離PTP結(jié)構(gòu)域，催化位點(diǎn)被釋放，SHP2的酶活性被激活，進(jìn)而激活下游的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路[44-45]。臨床研究表明，SHP2的激活或過(guò)表達(dá)與努南綜合征、青少年單核粒細(xì)胞白血病、豹皮綜合征等多種類(lèi)型疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是治療疾病的潛在藥物作用靶點(diǎn)[46-48]。目前已經(jīng)報(bào)道了多個(gè)靶向SHP2催化位點(diǎn)的中等活力小分子抑制劑，如NSC-87877、Ⅱ-B08和cefsulodin衍生物等，這些抑制劑可通過(guò)下調(diào)SHP2的PTP活性而達(dá)到治療疾病的目的。通過(guò)對(duì)多樣性小分子化合物庫(kù)的篩選，筆者所在課題組也發(fā)現(xiàn)了2種結(jié)構(gòu)新穎的SHP2的PTP抑制劑SYK-85和WS-635[49]。但由于PTP家族催化結(jié)構(gòu)域的序列保守性，這些藥物的特異性通常較低，并且PTP催化位點(diǎn)的高度溶劑化和極性性質(zhì)也阻礙了SHP2小分子抑制劑的臨床開(kāi)發(fā)[50-60]。為了克服以上缺點(diǎn)，2016年諾華團(tuán)隊(duì)基于SHP2獨(dú)特的變構(gòu)調(diào)控機(jī)制建立了一套多重高通量篩選方案，開(kāi)發(fā)了首個(gè)高效、高選擇性且具有良好口服生物利用度的SHP2變構(gòu)抑制劑SHP-099，SHP-099的開(kāi)發(fā)為后續(xù)SHP2變構(gòu)抑制劑的開(kāi)發(fā)提供了結(jié)構(gòu)骨架[44]。截至目前，已有8個(gè)高效、高選擇性且口服有效的變構(gòu)SHP2小分子抑制劑，即TNO155、RMC-4630、RLY-1971、JAB-3068、JAB-3312、BBP-398、ERAS-601和SH3809進(jìn)入臨床研究，以評(píng)估其單用或聯(lián)用在實(shí)體瘤和獲得性耐藥癌癥中的治療效果[61-63]。作為 “分子膠水”，這些化合物通過(guò)結(jié)合在N-SH2、C-SH2和PTP的相互作用界面上穩(wěn)定SHP2的自抑制構(gòu)象，變構(gòu)地抑制SHP2的酶活性。在體外可通過(guò)調(diào)控SHP2介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路而抑制癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而達(dá)到治療癌癥的效果[44,64]。臨床前數(shù)據(jù)表明，TNO155與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、小鼠肉瘤病毒癌基因同源體B（murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因G12C突變（Kirsten rat sarcoma viral oncogene G12C mutation，KRASG12C）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）4/6抑制劑以及程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）抗體聯(lián)合使用均呈現(xiàn)出較好的協(xié)同療效[65]。自2007年以來(lái)，單一TNO155或TNO155與PD-1抗體spartalizumab、CDK4/6抑制劑ribociclib、BRAF抑制劑dabrafenib (Tafinlar?)、口服ERK抑制劑LTT462或KRASG12C特異性口服抑制劑如MRTX849、JDQ443和JDQ443聯(lián)合使用已經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，以確定最大耐受劑量和推薦劑量下藥物的抗腫瘤活性、安全性、耐受性和PK/PD性質(zhì)，為獲得性耐藥患者提供了另一種治療策略。藥理學(xué)研究表明，在osimertinib耐藥的非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）模型中，BBP-398單獨(dú)或與EGFR抑制劑osimertinib聯(lián)合使用在體內(nèi)外均呈現(xiàn)出有效的腫瘤抑制作用，且可恢復(fù)NSCLC對(duì)osimertinib的敏感性[66]。RMC-4630可通過(guò)干擾RAS-RAF-MAPK-ERK級(jí)聯(lián)信號(hào)而抑制腫瘤生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。單用RMC-4630或與MEK抑制劑cobimetinib協(xié)同使用均呈現(xiàn)較好的抗腫瘤作用。此外，RMC-4630可與KRASG12C抑制劑AMG510聯(lián)合使用治療KRASG12C突變的晚期實(shí)體腫瘤患者。ERAS-601和RLY-1971單用或與其他藥物聯(lián)合使用也對(duì)晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤發(fā)揮治療作用。此外，由北京加科思新藥研發(fā)有限公司自主開(kāi)發(fā)的變構(gòu)SHP2抑制劑JAB-3068和JAB-3312也已獲批開(kāi)展針對(duì)NSCLC、頭頸部癌、食管癌和其他轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者的安全性、耐受性、藥動(dòng)學(xué)和初步抗腫瘤活性的臨床研究[42]。

圖3 SHP2的自抑制構(gòu)象（PBD ID：2SHP）與開(kāi)放構(gòu)象（PBD ID：6CRF）Figure 3 Auto-inhibited (PBD ID: 2SHP) and open conformation of SHP2 (PBD ID: 6CRF)

2.2 靶向絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的變構(gòu)調(diào)控研究現(xiàn)狀

AKT也被稱為蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是PI3K信號(hào)通路的重要成員，其過(guò)表達(dá)或激活與乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等一系列癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是癌癥治療的一個(gè)潛在藥物作用靶點(diǎn)[67-69]。AKT家族包括AKT1 ~ 3這3種亞型，均由N末端的PH結(jié)構(gòu)域、中心的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）和C末端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域3部分組成（PDB ID：6HHG）[70]（見(jiàn)圖4）。3種亞型的激酶結(jié)構(gòu)域高度保守，同源性超過(guò)85%。但它們的PH結(jié)構(gòu)域在不同的亞型中存在較大的差異，同源性約為60%，可促進(jìn)AKT與膜磷脂的黏附[68]。AKT的N末端PH結(jié)構(gòu)域與中心的KD結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用介導(dǎo)了AKT的“PH-in”和“PH-out”2種構(gòu)象的轉(zhuǎn)換。PH與KD結(jié)構(gòu)域間的分子內(nèi)相互作用可使AKT處于非活化的“PH-in”構(gòu)象，防止AKT激酶結(jié)構(gòu)域的活性環(huán)被磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PI3K-dependent kinase 1，PDK1）磷酸化，但當(dāng)二者之間的相互作用受到破壞后，AKT轉(zhuǎn)變?yōu)椤癙Hout”構(gòu)象，激酶結(jié)構(gòu)域的活性環(huán)可被PDK1磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致AKT的活化[36,68]。由于AKT激酶家族中ATP結(jié)合位點(diǎn)的保守性，因而靶向AKT激酶結(jié)構(gòu)域的ATP競(jìng)爭(zhēng)抑制劑面臨著選擇性和脫靶副作用的挑戰(zhàn)，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已終止[37]。因而針對(duì)AKT的變構(gòu)調(diào)控機(jī)制，開(kāi)發(fā)高選擇性和低毒性的ATP非競(jìng)爭(zhēng)性變構(gòu)抑制劑逐漸引起了研究者的關(guān)注[68,71]。目前報(bào)道的處于臨床試驗(yàn)階段的AKT變構(gòu)抑制劑主要有MK-2206、ARQ092、ARQ751和BAY1125976[72]。MK-2206是一種高效、高選擇性的新型非ATP競(jìng)爭(zhēng)性變構(gòu)AKT抑制劑[73]。單用MK-2206或MK-2206與細(xì)胞毒性藥物如拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（阿霉素和喜樹(shù)堿）、抗代謝物（吉西他濱和5-氟尿嘧啶）、抗微管藥物（多西紫杉醇）和DNA交聯(lián)劑（卡鉑）聯(lián)用均在體內(nèi)和體外呈現(xiàn)出抗腫瘤活性，并且耐受性良好[74]。臨床研究表明，雖然MK-2206的半衰期較長(zhǎng)，可連續(xù)隔日服用，但仍具有皮疹、疲勞和胃腸道毒性等缺陷，因此仍需針對(duì)該化合物進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化[75]。ARQ092是一種可口服、高效且高選擇性的變構(gòu)AKT抑制劑，在實(shí)體瘤和血液腫瘤中具有抗腫瘤活性，但仍具有輕度至中度的高血糖、皮疹、腹瀉、嘔吐、黏膜炎和轉(zhuǎn)氨酶升高等藥物相關(guān)不良反應(yīng)[76]。與ARQ092相比，ARQ751是一種具有更高效力和選擇性的AKT變構(gòu)抑制劑[77]。生化和細(xì)胞分析表明，這2種化合物均可有效地調(diào)控AKT介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路從而抑制AKT的活性，進(jìn)而抑制諸多腫瘤細(xì)胞的增殖，其中在白血病、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中效果最強(qiáng)[77]。BAY1125976也是一種有效的高選擇性變構(gòu)AKT抑制劑，通過(guò)結(jié)合到由PH和KD結(jié)構(gòu)域形成的變構(gòu)結(jié)合口袋而選擇性地抑制AKT1和AKT2的活性。BAY1125976呈現(xiàn)較好的療效和體內(nèi)耐受性，并在多個(gè)PI3K/AKT/mTOR通路激活的腫瘤模型中顯示出劑量依賴性的抗腫瘤療效[78]。相比于MK-2206，BAY1125976的半衰期較短，在臨床用藥過(guò)程中也有高血糖、皮疹等現(xiàn)象出現(xiàn)，因而也仍需進(jìn)一步的優(yōu)化[79]。

圖4 靶向AKT變構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID：6HHG）Figure 4 Co-crystal structure of inhibitors targeting the allosteric site of AKT (PDB ID: 6HHG)

2.3 靶向斷裂點(diǎn)簇集區(qū)-艾貝爾遜酪氨酸激酶的變構(gòu)調(diào)控研究現(xiàn)狀

BCR-ABL是由斷點(diǎn)聚集區(qū)蛋白BCR與ABL蛋白融合而成的一種相對(duì)分子質(zhì)量約為210 000的非受體型酪氨酸蛋白激酶。BCR-ABL可催化γ-磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到蛋白中特定酪氨酸殘基的羥基 上，參 與RAS-RAF-MAPK-ERK、PI3K-AKT、JAK-STAT和髓細(xì)胞組織增生蛋白（myelocytomatosis proteins，Myc）等多種信號(hào)通路[39,80]。ABL蛋白由N端無(wú)序的Cap結(jié)構(gòu)域、SRC同源結(jié)構(gòu)域3（Src homology 2，SH3）、SH2、C端激酶結(jié)構(gòu)域KD、SH3與SH2連接區(qū)（ContectorSH3/2）和SH2與KD連接區(qū)（LinkerSH2/KD）構(gòu)成。SH2、SH3和KD 3個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用可變構(gòu)地調(diào)控ABL蛋白的酶活性。N端的肉豆蔻酰基插入C端的口袋后將穩(wěn)定ABL的KD結(jié)構(gòu)域，使ABL呈現(xiàn)自組裝的抑制構(gòu)象。當(dāng)SH2結(jié)合到N端的KD結(jié)構(gòu)域，ABL呈現(xiàn)擴(kuò)展的激活構(gòu)象[23,81]。單獨(dú)的ABL蛋白可在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，但當(dāng)其與BCR蛋白融合后，ABL蛋白將失去穿梭特性，停留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。BCR與ABL蛋白的融合可激活A(yù)BL的酪氨酸激酶活性，通過(guò)與致癌途徑中蛋白質(zhì)的相互作用而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[82]。臨床研究發(fā)現(xiàn)BCR-ABL融合蛋白與慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生密切相關(guān)[39]。目前報(bào)道的靶向BCR-ABL抑制劑分為兩類(lèi)： 1）ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑如imatinib、nilotinib和PPY-A等，可與活化或非活化構(gòu)象的BCR-ABL蛋白相結(jié)合； 2）ATP非競(jìng)爭(zhēng)性變構(gòu)抑制劑如ON012380、GNF-2及其衍生物GNF-5和DCC-2036等，可結(jié)合到酶的底物結(jié)合位點(diǎn)或遠(yuǎn)離ATP結(jié)合位點(diǎn)的變構(gòu)口袋中。但ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑卻面臨著耐藥性的挑戰(zhàn)，而單用ATP非競(jìng)爭(zhēng)性變構(gòu)抑制劑或與ATP競(jìng)爭(zhēng)抑制劑聯(lián)合使用可在一定程度上克服單一藥物的耐受突變[83-85]。ON012380可與BCR-ABL的底物結(jié)合位點(diǎn)而非ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，因而這些化合物不受ABL激酶突變的影響，對(duì)BCR-ABL突變體T315I細(xì)胞的生長(zhǎng)也呈現(xiàn)出較好抑制效果[86-87]。GNF-2及其衍生物GNF-5是一類(lèi)高選擇性的變構(gòu)BCR-ABL抑制劑，通過(guò)與ABL酶C末端的豆蔻酸鹽結(jié)合口袋相結(jié)合，誘導(dǎo)穩(wěn)定BCR-ABL的非活化構(gòu)象[88]。相比于GNF-2，GNF-5具有更好的藥動(dòng)學(xué)特性。研究表明，GNF-5可與ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑imatinib聯(lián)合使用而改變ATP結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象，協(xié)同抑制耐藥突變[89]。DCC-2036是一種全新的酪氨酸激酶抑制劑，通過(guò)結(jié)合到一個(gè)稱為“開(kāi)關(guān)口袋”的新區(qū)域而抑制BCR-ABL的構(gòu)象活化[90]。研究顯示，DCC-2036也表現(xiàn)出良好的生物利用度和安全性，在imatinib耐藥性慢性粒細(xì)胞白血病治療方面具有較大的潛力[83]。

3 蛋白-蛋白相互作用策略

蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用在諸多重要的細(xì)胞功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，對(duì)于生物體維持正常的生理功能是必不可少的。除此之外，蛋白-蛋白相互作用也與眾多疾病如癌癥和自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[91-92]。如胚胎外胚層發(fā)育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）與Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）之間的相互作用可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，WD40重復(fù)蛋白5（WD40 repeat protein 5，WDR5）與混合譜系白血病1蛋白（mixed lineage leukemia 1，MLL1）之間相互作用與急性白血病的發(fā)生密切相關(guān)[93-94]。因此，開(kāi)發(fā)靶向蛋白-蛋白相互作用界面的抑制劑在疾病研究領(lǐng)域至關(guān)重要。但是與傳統(tǒng)的單一靶點(diǎn)相比，蛋白-蛋白相互作用界面具有大而平坦且疏水的特點(diǎn)，是高選擇性小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)過(guò)程中需要面臨的問(wèn)題[95]。目前已報(bào)道了多個(gè)成功靶向蛋白-蛋白相互作用界面如EED-EZH2、MLL-WDR5、鼠雙微粒體2（murine double minute 2，MDM2）-p53、B細(xì)胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL-2）-B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma associated X protein，Bax）、表面抗原分化簇4（cluster of differentiation 4，CD4）-糖蛋白120（glycoprotein 120，gp120）、RAS-RAF和Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein 1，KEAP1）-核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，NRF2）等開(kāi)發(fā)抑制劑的案例，部分代表性抑制劑如表3所示。

表3 蛋白-蛋白相互作用策略相關(guān)靶點(diǎn)研究現(xiàn)狀Table 3 Current status of research on targets with protein-protein interaction strategy

3.1 靶向胚胎外胚層發(fā)育蛋白與Zeste基因增強(qiáng)子同源物2的相互作用研究現(xiàn)狀

多梳抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）由3個(gè)核心亞基EZH2、EED和Zeste 12基因抑制因子（suppressor of zeste 12，SUZ12）組成，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期、衰老和細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[96]。通過(guò)催化亞基EZH2和EED之間的蛋白-蛋白相互作用，PRC2可通過(guò)調(diào)控H3K27me3的甲基化調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄抑制[97]。PRC2的異?；罨c癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是潛在的表觀遺傳癌癥治療靶點(diǎn)[98]。抑制EZH2和EED之間的相互作用可使PRC2復(fù)合物失去活力，通過(guò)抑制癌細(xì)胞的增殖而達(dá)到治療癌癥的目的[93]。近幾年報(bào)道的靶向EZH2-EED之間相互作用界面的高效、高選擇性的小分子抑制劑主要有astemizole、EED226和A-395[96-97,99]。研 究 表 明，astemizole可通過(guò)干擾EZH2和EED之間的相互作用而破壞PRC2復(fù)合物的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其甲基轉(zhuǎn)移酶活性而抑制PRC2驅(qū)動(dòng)的淋巴瘤細(xì)胞的增殖[97]。結(jié)構(gòu)研究表明，抑制劑A-395和EED226通過(guò)直接結(jié)合到EED的H3K27me3結(jié)合口袋而阻止PRC2的活化[96,99]。這些抑制劑的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更高效且高選擇性的PRC2抑制劑奠定了基礎(chǔ)。

3.2 靶向混合譜系白血病1蛋白與WD40重復(fù)蛋白5的相互作用研究現(xiàn)狀

MLL1是一種組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，WDR5是激活MLL1酶活性所必需的多蛋白復(fù)合物的重要組成部分。MLL1與WDR5的相互作用在急性淋巴細(xì)胞系白血?。╝cute lymphoid leukemia，ALL）和AML的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，因此靶向MLL1蛋白或MLL1與WDR5蛋白-蛋白相互作用界面開(kāi)發(fā)抑制劑為急性白血病的治療提供了機(jī)會(huì)[100]。近幾年報(bào)道的作用于MLL1-WDR5蛋白-蛋白相互作用界面的抑制劑主要有擬肽類(lèi)抑制劑如MM-101及其衍生物和小分子抑制劑如OICR-9429和WDR5-47等[101-102]。擬肽類(lèi)抑制劑MM-101和MM-401可通過(guò)模擬MLL1與WDR5的結(jié)合模式而抑制MLL1的H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更有效的混合譜系白血病藥物奠定了基礎(chǔ)[100,103]。高親和力和高選擇性小分子抑制劑OICR-9429可通過(guò)與WDR5直接結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地破壞MLL與WDR5之間的相互作用。由于WDR5參與p30誘導(dǎo)的自我更新和白血病發(fā)生，OICR-9429可選擇性地抑制p30表達(dá)的人白血病細(xì)胞的增殖和分化，因此其對(duì)白血病的治療發(fā)揮著重要作用[104]。此外，相對(duì)分子質(zhì)量較低的小分子拮抗劑WDR5-47也對(duì)WDR5具有中等的親和力，可通過(guò)占據(jù)WDR5結(jié)合口袋的中心空腔而強(qiáng)效地抑制MLL1與WDR5之間的相互作用，該化合物的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步設(shè)計(jì)優(yōu)化較高親和力的化合物提供了結(jié)構(gòu)骨架[105]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

近年來(lái)，靶向蛋白的非催化功能開(kāi)發(fā)抑制劑受到廣泛關(guān)注，諸多成功案例已被報(bào)道，為該類(lèi)抑制劑在相關(guān)疾病領(lǐng)域的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。蛋白非催化結(jié)構(gòu)域策略通過(guò)靶向蛋白的非催化結(jié)構(gòu)域開(kāi)發(fā)抑制劑來(lái)達(dá)到治療效果；變構(gòu)調(diào)控策略是通過(guò)靶向蛋白的變構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行新藥研發(fā)；蛋白-蛋白相互作用策略則是通過(guò)靶向蛋白-蛋白相互作用界面開(kāi)發(fā)高選擇性的小分子抑制劑。3種靶向蛋白非催化功能的藥物開(kāi)發(fā)新策略在藥物研究領(lǐng)域均具有廣闊的前景，但仍存在不足之處。目前針對(duì)蛋白非催化結(jié)構(gòu)域的藥物開(kāi)發(fā)仍在臨床前初期研究階段，缺乏深入的藥物化學(xué)、活性機(jī)制、毒性和成藥性等臨床前評(píng)價(jià)研究。相比于活性位點(diǎn)抑制劑，針對(duì)變構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑具有更高的選擇性以及較低的毒性、脫靶毒性和更低的劑量要求[106-107]。但是由于變構(gòu)位點(diǎn)相比正構(gòu)位點(diǎn)具有更低的進(jìn)化壓力，變構(gòu)位點(diǎn)發(fā)生耐藥突變的機(jī)會(huì)增加，變構(gòu)藥物面臨著耐藥性的挑戰(zhàn)。因此研究變構(gòu)調(diào)節(jié)策略中的耐藥突變機(jī)制對(duì)于解決這一挑戰(zhàn)具有重要的意義[107]。由于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面大且平坦，獲得高活性靶向蛋白相互作用的小分子抑制劑在新藥研發(fā)領(lǐng)域仍具有一定的挑戰(zhàn)[108]。此外，靶蛋白非催化功能的作用機(jī)制及其靶向開(kāi)發(fā)策略等領(lǐng)域的研究仍相對(duì)較少，在一定程度上限制了非催化功能抑制劑的開(kāi)發(fā)。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)靶蛋白非催化功能的抑制劑設(shè)計(jì)策略、深入探究該類(lèi)抑制劑的作用機(jī)制等是該領(lǐng)域重要的研究方向?？偟膩?lái)說(shuō)，非催化功能抑制劑在疾病領(lǐng)域具有非常大的潛力，靶向非催化功能的抑制劑的開(kāi)發(fā)是藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要研究方向，有望在未來(lái)幾年取得突破進(jìn)展。