灰樹花多肽-鈣螯合物對小鼠衰老性骨質(zhì)疏松的改善作用

熊 煜， 張鳳麗， 劉 斌，2， 趙立娜*

（1 福建農(nóng)林大學(xué) 國家菌草工程技術(shù)研究中心 福州350002 2 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州350002）

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥從病因?qū)W分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Postmenopausal osteoporosis， PMOP）（Ⅰ型）和老年性骨質(zhì)疏松癥（Ⅱ型）[1]。 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松通過去勢法等被國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究[2-3]。 由于老年性骨質(zhì)疏松癥（SOP）是生物衰老在骨骼方面的一種特殊表現(xiàn)， 且復(fù)制SOP 動物模型的周期長，死亡率較高，因此研究SOP 較困難。 目前，D-半乳糖致雄性鼠骨質(zhì)疏松動物模型是研究SOP的一個重要工具， 具有簡便易行、 價格低廉的特點(diǎn)。 大量D-半乳糖可致睪丸功能減退，雄激素水平降低，這與衰老致性腺功能退化相似[4]。

灰樹花是擔(dān)子菌亞門的一種藥食兩用珍稀菇類，因含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)及微量元素等活性物質(zhì)，已成為亞洲流行的食用菌。其蛋白質(zhì)含量高達(dá)31.5%，必需氨基酸在總氨基酸中占比高達(dá)45.5%，遠(yuǎn)高于香菇、銀耳、金針菇、黑木耳等常見食用菌[5]。 灰樹花多肽具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和降血糖等活性。 鈣是人體必需的一種重要礦質(zhì)元素，能有效防治骨質(zhì)疏松[6]，而日常膳食并不能滿足機(jī)體每日需求量。 中國現(xiàn)有膳食結(jié)構(gòu)的營養(yǎng)調(diào)查表明，我國居民鈣攝入量普遍偏低，僅達(dá)鈣推薦供給量（RDA）的50%左右[7]。我國市場流通鈣制劑約2 700 種， 然而普遍存在生物利用度低的現(xiàn)象[8]。 生物活性肽具有鈣元素載體的作用，可輸送鈣元素到人體各處，充分發(fā)揮其功能[9]。 肽與鈣離子螯合形成的肽鈣螯合物， 能夠通過腸道對小分子肽段的吸收機(jī)制以螯合物的形式被小腸主動吸收，不易形成磷酸鈣沉積物，能提高鈣的生物利用度，具有雙重營養(yǎng)功能，是一種理想的補(bǔ)鈣制劑[10]。Bao 等[11]、張根生等[12]證明多肽鈣制劑能夠有效預(yù)防大鼠骨質(zhì)疏松癥。本文通過腹腔注射D-半乳糖建立衰老性骨質(zhì)疏松大鼠模型， 結(jié)合體外Caco-2 細(xì)胞試驗(yàn)， 探討灰樹花多肽-鈣螯合物對衰老性骨質(zhì)疏松癥的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞

SPF 級成年雄性ICR 小鼠50 只，每只體質(zhì)量（45±5）g， 由吳氏實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 許可證號：SCXK（滬）2017-0005。 Caco-2 細(xì)胞，由福州大學(xué)生物工程研究所提供。

1.2 主要試劑及儀器

灰樹花，慶元縣宏億農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉（NaOH）、HCL、無水氯化鈣，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-半乳糖，Aladdin 公司；鈣測定試劑盒、血清無機(jī)磷測定試劑盒、堿性磷酸酶測試盒，南京建成生物工程研究所；DMEM 培養(yǎng)基，美國Hyclone 公司；特級胎牛血清，澳洲Gibco公司；1xPBS，美國Hyclone 公司；Fluo-3-Am，美國Sigma 公司。

X52 酶標(biāo)儀， 美國Molecullar 公司；Alpha 1-4LD 型凍干機(jī)， 德國Christ 公司；BR 4i 型高速冷凍離心機(jī)，法國Jouan 公司；AA-6800 原子吸收分光光度計(jì)，島津制作儀器有限公司；AL204 精密分析天平，梅特利托利多儀器（上海）有限公司；SHA.B 精達(dá)水浴恒溫振蕩器， 常州精達(dá)儀器制造有限公司；THZ-82 細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SANYO 公司。

1.3 方法

1.3.1 灰樹花多肽-鈣螯合物的制備 參考實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化條件制備灰樹花多肽-鈣螯合物[13]。 灰樹花磨粉過40 目篩， 按料液比1∶50 加蒸餾水溶解，1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至10.0。置于恒溫振蕩器中60 ℃水浴90 min，冷卻后6 層紗布過濾。 上清液用1 mol/L HCl 調(diào)pH 值至2.5。5 000 r/min 離心10 min，沉淀冷凍干燥后即灰樹花蛋白。稱取一定量的灰樹花蛋白，按照液料比40∶1 加入超純水進(jìn)行溶解，調(diào)pH 值至7.5（復(fù)合蛋白酶最適pH），加復(fù)合蛋白酶（溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%）， 將其放置于53 ℃水浴搖床中充分反應(yīng)4 h， 沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，離心（4 500 r/min）10 min，取上清液冷凍干燥即得灰樹花多肽。 按溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%復(fù)溶多肽，肽鈣質(zhì)量比2∶1 加入無水氯化鈣，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，60 ℃恒溫反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫， 加入95%乙醇洗滌靜置過夜后離心（5 000 r/min，10 min），取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得到灰樹花多肽-鈣螯合物。 螯合物用火焰原子吸收光譜儀測得鈣含量為7%。

1.3.2 動物分組 空白對照組（不造模+去離子水灌胃）10 只；模型對照組（造模+去離子水灌胃）10只；陽性對照組（HCaCO3，造模+高劑量碳酸鈣灌胃）10 只；陽性有機(jī)鈣對照組（HGCa，造模+高劑量葡萄糖酸鈣灌胃）10 只； 試驗(yàn)組 （Hgps-Ca，造模+高劑量灰樹花多肽-鈣螯合物灌胃）10 只。

1.3.3 動物實(shí)驗(yàn) 50 只雄性ICR 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由飲水飲食，室溫控制在20～25 ℃，濕度60%左右。按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，除了空白對照組外，其它5 組均給予腹腔注射120 mg/（kg d）的D-半乳糖[14]，骨質(zhì)疏松癥模型造模；空白對照組給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水。 8 周后造模成功，空白對照組、模型對照組均給予去離子水灌胃； 陽性對照組分別給予高劑量碳酸鈣（HCa-CO3），高劑量葡萄糖酸鈣（HGCa）灌胃；試驗(yàn)組給予高劑量灰樹花多肽-鈣螯合物灌胃（高劑量組按生藥量換算為53.2 mg/kg bw）。 飼養(yǎng)過程中小鼠自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料和自由飲用去離子水。 基礎(chǔ)飼料為南通特洛菲LAD 0001 標(biāo)準(zhǔn)飼料。 各組連續(xù)灌胃4 周后，采血取材檢測血生化指標(biāo)。

1.3.4 血清樣本采集及檢測方法 在12 h 禁食后， 眼球取血， 將血樣品轉(zhuǎn)移到裝有抗凝劑的2 mL 離心管中。在4 ℃下將血清離心10 min（3 000 r/min），取其上清，-20 ℃保藏備用。 用于血清指標(biāo)的測定：1）血清Ca2+濃度檢測：采用鄰甲酚肽絡(luò)合酮法測定；2） 血清P 濃度檢測： 采用磷鉬酸法測定；3）血清ALP 活性檢測：采用微量酶標(biāo)法進(jìn)行測定；4）血清CAT 活性檢測：檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 骨指標(biāo)的測定 12 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，術(shù)前小鼠禁食， 取每只小鼠左右股骨和脛骨， 去除軟組織，用數(shù)字卡尺測量左股骨、左脛骨的長度直徑。應(yīng)用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2 細(xì)胞置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至20～40 代。培養(yǎng)基采用DMEM 加入20%胎牛血清、1%雙抗[15]。細(xì)胞培養(yǎng)過程中每周換液2～3 次， 待貼壁細(xì)胞匯合率達(dá)到80%～90%時進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基， 加入適量0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，觀察細(xì)胞變圓后加入適量DMEM 培養(yǎng)基終止消化，按1∶3 的比例進(jìn)行傳代。

1.3.7 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將傳代后的Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)至生長對數(shù)期， 采用胰蛋白酶對貼壁生長細(xì)胞進(jìn)行消化。 并加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，制得細(xì)胞密度為2×104CFU/mL 的細(xì)胞懸液。 將細(xì)胞懸液以每孔200 μL 體積接種于96 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，小心吸出培養(yǎng)基，向其中加入不同鈣含量的灰樹花多肽-鈣螯合物（GPs-Ca），每個濃度設(shè)置6 孔為平行試驗(yàn)?？瞻讓φ战M設(shè)置為只加入等量培養(yǎng)基， 不加入細(xì)胞懸液，也不加入樣品。陰性對照組設(shè)置為只加入等量培養(yǎng)基， 不加樣品。 陽性對照組設(shè)置為氯化鈣，葡萄糖酸鈣。將試驗(yàn)組，空白對照組，陰性對照組，陽性對照組同時置于CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。 24 h 后， 每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，繼續(xù)孵育4 h 后棄去上清液，每孔中加入150 μL DMSO，充分震蕩溶解。 采用酶標(biāo)儀于波長570 nm 處測定每孔的吸光值并記錄，空白孔調(diào)零[16]。 按照如下公式進(jìn)行計(jì)算細(xì)胞存活率（IC）：

IC（%）=（OD試驗(yàn)組/OD對照組）×100

1.3.8 GPs-Ca 對細(xì)胞鈣攝取的影響 灰樹花多肽-鈣螯合物（GPs-Ca）的Caco-2 細(xì)胞攝取試驗(yàn)采用Fluo-3-AM 細(xì)胞內(nèi)鈣離子探針進(jìn)行細(xì)胞吸收鈣量的測定[17]。按5×104CFU/mL 的細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于6 孔板上，將接種板置于37 ℃，CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。 設(shè)定灰樹花多肽-鈣螯合物（Hgps-Ca） 試驗(yàn)組，CaCl2陽性對照組，空白對照組，依據(jù)MTT 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果，考察不同鈣濃度（2.5，5，7.5，10，15，20，25，30 mmol/L）的樣品對細(xì)胞鈣攝取的影響。 將培養(yǎng)14 d 的細(xì)胞上層培養(yǎng)液小心吸取出來， 加入新鮮的培養(yǎng)液與各組分樣品處理1 h 后，吸去培養(yǎng)液，加入HBSS 緩沖液清洗3 遍后，再加入10 μmol/L Fluo-3-AM 細(xì)胞內(nèi)鈣離子探針作用1 h， 用HBSS 緩沖液沖洗3 遍后，移取樣品至1.5 mL 離心管中，1 0000 r/min，離心5 min，吸取上清液，采用流式細(xì)胞儀對各試驗(yàn)組Caco-2 細(xì)胞攝取鈣離子含量進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

D-半乳糖誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥，其突出表現(xiàn)即為血清鈣/磷水平的顯著變化。 圖1 結(jié)果顯示：在第4 周，高劑量碳酸鈣（HCaCO3）、高劑量葡萄糖酸鈣（HGCa）、高劑量灰樹花多肽-鈣螯合物（Hgps-Ca）喂養(yǎng)的小鼠血清Ca 高于模型組（P＜0.05），且喂食Hgps-Ca 的小鼠血清Ca 水平略高于高劑量碳酸鈣（HCaCO3）、高劑量葡萄糖酸鈣（HGCa）組。試驗(yàn)組的血清P 水平，與模型組相比也均有顯著上升（P＜0.01），喂食Hgps-Ca 的小鼠血清P 水平與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 此外，模型組血清ALP 水平顯著高于空白組（P＜0.01），這種增加可歸因于成骨細(xì)胞活躍和成骨率增加[18]。 喂食高劑量碳酸鈣（HCaCO3）、高劑量葡萄糖酸鈣（HGCa）、高劑量灰樹花多肽-鈣螯合物（Hgps-Ca）小鼠灌胃4 周后血清ALP 值均顯著下降（P＜0.01）。 自由基和氧化應(yīng)激與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[19]，通過血清過氧化氫酶（CAT）水平的顯著下降可以清楚地表明這一點(diǎn)。由圖1d 可看出，與正常對照組相比，模型組血清CAT 水平下降約60%。Manolagas[20]報告說，過氧化氫酶的使用可以防止大鼠骨丟失， 推測具有抗氧化特性的化合物是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的最佳候選。 灌胃4 周后，小鼠血清過氧化物酶（CAT）水平幾乎恢復(fù)到正常值（P＞0.05）。 這一效應(yīng)或可歸因于富含多肽的灰樹花多肽-鈣螯合物部分的強(qiáng)抗氧化性，具有調(diào)節(jié)核因子-紅細(xì)胞-2 相關(guān)因子2（Nrf2）/Kelch樣ECH 相關(guān)蛋白（Keap）通路途徑的作用[21]。

圖1 各組小鼠血清生化指標(biāo)Fig.1 Biochemical parameters in the serum of mice for each group

2.2 骨形態(tài)檢測結(jié)果

股骨指數(shù)可以反映動物體的骨骼生長狀況。圖2 顯示了所有組的股骨和脛骨質(zhì)量和長度。 在灌胃4 周結(jié)束時，各組股骨質(zhì)量、長度較模型組均有所上升，無機(jī)鈣源加鈣組（HCaCO3）和高劑量灰樹花多肽-鈣螯合物組（Hgps-Ca）和模型組相比有顯著差異（P＜0.01），與空白對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），而高劑量灰樹花多肽-鈣螯合物組（Hgps-Ca）更接近空白對照組。脛骨長度在各組中未觀察到顯著差異。高劑量灰樹花多肽-鈣螯合物組和葡萄糖酸鈣組脛骨質(zhì)量顯著高于模型組（P＜0.01），且與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠股骨、脛骨質(zhì)量及長度Fig.2 Weight and length of femurs and tibia for each group

2.3 骨組織顯微結(jié)構(gòu)的觀察

H & E 染色顯示各組樣品對股骨病理學(xué)特征的影響。 連續(xù)注射8 周D-半乳糖，小鼠骨形態(tài)特性發(fā)生顯著變化。 與對照組（圖3a）相比，模型組（圖3b）骨小梁稀少或斷裂，小梁變細(xì)，體積減小，連接減少，游離端增多，小梁數(shù)、小梁鏈接和小梁骨面積觀察到顯著減少，骨礦化受損。通過灰樹花多肽-鈣螯合物和葡萄糖酸鈣（圖3d，3e）處理后，股骨細(xì)胞系正常排列，成骨細(xì)胞較模型組有明顯增加趨勢，結(jié)構(gòu)顯著改善[22]。

圖3 各組試驗(yàn)小鼠股骨組織病理切片觀察（200x）Fig.3 Pathological sections of femur in experiment of mice for each group （200x）

2.4 MTT 毒性評價

由圖4 可知，當(dāng)多肽-鈣螯合物的鈣濃度小于15 mmol/L 時，Caco-2 細(xì)胞存活率均大于85%。 而相同鈣濃度下（15 mmol/L），CaCl2和葡萄糖酸鈣組細(xì)胞存活率為80.91%，75.49%。 因此，肽-鈣螯合物的鈣濃度在0～15 mmol/L 范圍均不會對Caco-2細(xì)胞造成損傷，且在相同鈣濃度下，相比無機(jī)鈣和葡萄糖酸鈣，螯合鈣對細(xì)胞造成損傷最小，存活率更高。

圖4 不同鈣濃度下Caco-2 細(xì)胞活力Fig.4 Cell viability of Caco-2 cells in different calcium concentration

2.5 多肽促鈣吸收試驗(yàn)

通過比較灰樹花多肽-鈣螯合物和CaCl2、葡萄糖酸鈣在鈣吸收上的差異可以明確多肽在腸道細(xì)胞中的促鈣吸收作用。 由圖5 可知，Caco-2 細(xì)胞對CaCl2中鈣離子的攝取率最低， 且一定濃度后吸收率變化不顯著； 細(xì)胞對葡萄糖酸鈣的鈣吸收率略高于CaCl2。而對于多肽-鈣螯合物，細(xì)胞對鈣離子的攝取率隨鈣濃度的增大逐漸增大。 試驗(yàn)結(jié)果表明， 灰樹花多肽與Ca2＋的螯合作用能有效促進(jìn)腸道細(xì)胞中鈣的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)， 這與文獻(xiàn)所述結(jié)果一致， 即多肽能與Ca2＋結(jié)合產(chǎn)生可溶性絡(luò)合物， 防止Ca2＋在呈中性或弱堿性環(huán)境的小腸內(nèi)沉淀，從而促進(jìn)鈣的吸收和利用[23]。

圖5 不同鈣濃度下細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i 變化Fig.5 Changes of intracellular [Ca2+]i in different calcium concentrations

3 討論

D-半乳糖致雄性鼠骨質(zhì)疏松是一個較為實(shí)用的研究衰老性骨質(zhì)疏松（SOP）的動物模型，相比于其它SOP 動物模型簡便易行、價格低廉。 通過持續(xù)6～10 周每天注射50～500 mg/（kg·d）[24-25]劑量的D-半乳糖，建立D-半乳糖致動物衰老模型。連續(xù)注射D-半乳糖后，睪丸功能減退，雄性激素水平降低。此外，體內(nèi)產(chǎn)生過多的氧自由基破壞了膠原蛋白，導(dǎo)致各種細(xì)胞氧化損傷，影響了骨細(xì)胞的正常代謝， 造成礦物質(zhì)流失， 加速雄性鼠的衰老，使其骨量減少，骨質(zhì)丟失。 本研究給予ICR 小鼠120 mg/d 的D-半乳糖，持續(xù)8 周，觀察到股骨體積和框架體積減小，骨孔隙率和框架密度增加，股骨細(xì)胞松散多孔，像蜂窩狀，肥大軟骨細(xì)胞區(qū)的顯著擴(kuò)張， 即在股骨近端干骺端發(fā)生小梁組織形態(tài)學(xué)變化，骨小梁數(shù)顯著減少，表明衰老性骨丟失動物模型的建立。 成骨作用和溶骨作用的正常進(jìn)行是維持血液中鈣、 磷含量穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)。 同樣，血液中鈣、磷含量的高低又直接影響骨的鈣化與溶解，它們是相互影響，互相制約的，并受1，25-（OH）2D3、甲狀旁腺素及降鈣素等的調(diào)節(jié)和控制[26]。 堿性磷酸酶（ALP）能分解有機(jī)磷酸化合物，產(chǎn)生大量的無機(jī)磷酸鹽離子，促使其與鈣離子結(jié)合成磷酸鈣而沉淀于骨組織內(nèi)。 Robison[27]揭示了ALP 在骨鈣化過程中起主要作用，在異常鈣化的情況下，其表達(dá)升高。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的幾種重要礦物質(zhì)如鈣、 磷含量相比于同齡正常小鼠均有顯著降低，血清ALP 水平顯著升高。 目前，有機(jī)鈣（特別是肽鈣復(fù)合物）作為一種新型的鈣補(bǔ)充劑，已成為研究熱點(diǎn)[28-29]。灌胃4 周后，高劑量的灰樹花多肽-鈣螯合物處理組的小鼠血清Ca、P 水平升高，并上升到與空白對照組相當(dāng)?shù)闹?，這與之前的研究一致。在骨鈣化過程中，ALP 起著重要作用。高血清ALP 水平可能干擾鈣吸收[30]?；覙浠ǘ嚯?鈣螯合物飼喂的小鼠血清ALP 值低于碳酸鈣組和葡萄糖酸鈣組， 表明肽鈣螯合的有機(jī)鈣更容易被吸收和鈣化。CAT 水平較模型組顯著上升，表明其抗氧化能力或許對衰老性骨質(zhì)疏松有一定預(yù)防作用[31-32]。Fluo-3-Am 作為一種新型的高度特異性Ca2+熒光指示劑， 可以靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。 研究結(jié)果顯示，灰樹花多肽-鈣螯合物相比CaCl2、 葡萄糖酸鈣更易被細(xì)胞吸收。 灰樹花肽-鈣螯合物一方面能防止肽的水解，使鈣離子在經(jīng)過胃及小腸中的吸收部位時都以螯合態(tài)形式存在， 不易形成磷酸鈣沉積物； 另一方面， 肽-鈣螯合物也更多地利用肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收，從而有效提高鈣的生物利用率。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用復(fù)合蛋白酶水解灰樹花蛋白制備多肽， 以多肽和CaCl2為原料采用液體反應(yīng)法合成灰樹花多肽-鈣螯合物，經(jīng)測定，鈣含量為7%。結(jié)果表明，Hgps-Ca 具備促進(jìn)骨骼生長發(fā)育的作用，對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老性骨質(zhì)疏松有一定改善作用。 同時體外吸收試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)其具備促進(jìn)鈣吸收作用?；覙浠ǘ嚯?鈣螯合物促進(jìn)鈣吸收行使的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑其分子機(jī)制和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑仍需進(jìn)一步研究。 本課題組將對灰樹花多肽-鈣螯合物在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和病理毒理學(xué)進(jìn)行深入研究。