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    Wenyingzhuangia屬海洋細(xì)菌產(chǎn)β-紫菜多糖酶的克隆表達(dá)及性質(zhì)研究

    2022-03-04 04:53:20馮瑞方張玉瑩申晶晶常耀光
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:糖酶紫菜底物

    馮瑞方, 張玉瑩, 申晶晶, 常耀光,2*

    (1 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266003 2 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島266237)

    紫菜是一種大型經(jīng)濟(jì)海藻, 目前中國(guó)紫菜栽培產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)量達(dá)11.4 萬t[1],居世界首位。 紫菜多糖是紫菜的主要組成部分, 約占紫菜干重的40%[2]。 其存在于紫菜細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙中[3],由(1→3)-O-β-D-吡喃半乳糖殘基(G 殘基)及(1→4)-O-α-L-吡喃半乳糖-6-硫酸基殘基 (L6S 殘基)交替組成[4]。 研究表明,紫菜多糖、低分子質(zhì)量紫菜多糖及紫菜寡糖具有多種生物活性, 如清除活性氧自由基[5],抗神經(jīng)炎癥[6],抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[7]等,是潛在的功能食品的功能因子。

    酶法降解相比物理法和化學(xué)法, 具有反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),是制備低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物及寡糖的重要手段。 紫菜多糖酶是一類糖苷水解酶, 可特異性識(shí)別和降解紫菜多糖中的糖苷鍵。 目前報(bào)道的序列僅有5 條,均為β-紫菜多糖酶, 催化紫菜多糖結(jié)構(gòu)中β-1,4 糖苷鍵的斷裂[4]。由法國(guó)團(tuán)隊(duì)發(fā)表的來源于海洋細(xì)菌Zobellia galactanivorans 中的PorA 和PorB[4]是最早被報(bào)道的紫菜多糖酶, 且該團(tuán)隊(duì)于人類腸道細(xì)菌Bacteroides plebeius 中挖掘到紫菜多糖酶BpGH16B和BpGH86A[8],提出了由飲食習(xí)慣引起的紫菜多糖酶基因轉(zhuǎn)移至人類腸道細(xì)菌的新見解。此外,本實(shí)驗(yàn)室研究人員以前期自主篩選的海洋細(xì)菌Wenyingzhuangia fucanilytica 為基礎(chǔ),挖掘到紫菜多糖酶Por16A_Wf[9],并闡明該酶的生化性質(zhì)及作用方式。 基于氨基酸序列分析,目前發(fā)現(xiàn)的β-紫菜多糖酶分別歸屬于2 個(gè)糖苷水解酶(Glycoside hydrolyase, GH)家族,即PorA、PorB、BpGH16B 及Por16A_Wf歸屬于GH16 家族[10],BpGH86A 歸 屬于GH86 家族。

    本文從海洋細(xì)菌基因組出發(fā), 通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù), 挖掘并克隆表達(dá)新型紫菜多糖酶,采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)作用方式進(jìn)行解析。 課題組前期分離純化得到1 株海洋細(xì)菌Wenyingzhuangia aestuarii OF219,并完成其全基因組測(cè)序。 前期的生物信息學(xué)分析表明,該細(xì)菌基因組中存在一條潛在的β-紫菜多糖酶基因por16Z(MN639876)。本文對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析、大腸桿菌異源表達(dá),闡明重組蛋白Por16Z_Wa 的生化性質(zhì)、動(dòng)力學(xué)常數(shù)及作用方式, 為紫菜多糖這一重要藻類多糖的酶解及分子剪裁提供新型工具酶。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    干壇紫菜, 購(gòu)自青島水產(chǎn)市場(chǎng); 海洋細(xì)菌Wenyingzhuangia aestuarii OF219, 實(shí)驗(yàn)室自主篩選及保藏;基因組DNA 抽提試劑盒,上海Sangon Biotech 公司; 高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,北京Biomed 公司;pET-28a(+)質(zhì)粒,北京Annoron 公司;切膠回收試劑盒,Omega 公司;限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI、預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),Thermo Fisher Scientific 公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒,Beyotime Biotech公司;OHpak LB-806M(8.0 mm×300 mm)色譜柱,日本Shodex 公司;HiPrepTM26/10 Desalting、His-TrapTMHP、Superdex 30 increase 3.2/300 GL 色譜柱,美國(guó)GE Healthcare Life Sciences 公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JY92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波Scientz 公司;Agilent 1260 Infinity、Agilent 1290 Infinity 液相色譜儀、Aglient G6125B 質(zhì)譜儀, 美國(guó)Agilent公司;?KTA Prime Plus 蛋白純化系統(tǒng), 美國(guó)GE Healthcare Life Sciences 公司 ;NANODROP 2000, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;Dawn Heleos II MALLS 檢測(cè)器,美國(guó)Wyatt Technology公司;iMark 酶標(biāo)儀、T100TM PCR 儀, 美國(guó)Bio-Rad 公司。

    1.3 方法

    1.3.1 紫菜多糖的提取及純化 紫菜多糖的提取及純化參考文獻(xiàn)[11]的方法。利用粉碎機(jī)將干壇紫菜磨粉備用。 紫菜粉末通過水提及乙醇沉淀法處理獲得粗紫菜多糖。 利用?KTA Prime Plus 蛋白純化系統(tǒng), 以凝膠排阻色譜法 (色譜柱:HiPrepTM26/60 Sephacryl S-400)純化多糖,以次甲基藍(lán)法[12]對(duì)各收集管進(jìn)行檢測(cè),收集顯色的各管進(jìn)行透析、凍干,所得多糖用于后續(xù)試驗(yàn)。 多糖的分子質(zhì)量由高效凝膠排阻色譜(High performance size exclusion chromatography, HPSEC)法測(cè)定,檢測(cè)器采用多角度激光光散射儀 (Multi-angle laser light scattering detector, MALLS) 及示差檢測(cè)器(Refractive index detector, RID)聯(lián)用方法。 本研究中使用的紫菜多糖分子質(zhì)量測(cè)定為(194.0±2.1)ku。

    1.3.2 生物信息學(xué)分析 使用SignalP 4.1[13]、db-CAN[14]、ExPASy[15]軟件分別預(yù)測(cè)Por16Z_Wa 的 信號(hào)肽、 結(jié)構(gòu)域組成、 分子質(zhì)量及等電點(diǎn)。 利用ClustalX[16]進(jìn)行多序列比對(duì)并使用MEGA6[17]基于鄰接法建立進(jìn)化樹。 利用BLASTP[18]程序?qū)or16Z_Wa 與已報(bào)道的GH16 家族β-紫菜多糖酶序列的相似度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

    1.3.3 克隆表達(dá)及蛋白純化

    1.3.3.1 克隆表達(dá) 利用磁珠法提取W. aestuarii OF219 基因組DNA。 通過無縫克隆技術(shù)擴(kuò)增目的基因并構(gòu)建質(zhì)粒。 上下游引物分別為5’-GACACGGATCCATGATTGTATCATGTAGTAAAA AGAACACT-3’、5’- GACACCTCGAGTTATTGTT TGTCTTCTAATTTCCAAGTTCT-3’。酶切位點(diǎn)使用BamHI 及XhoI。 將目標(biāo)序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,純化后得擴(kuò)增產(chǎn)物片段與含有N 端His 標(biāo)簽的載體連接, 將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè), 回收構(gòu)建成功的質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。 將轉(zhuǎn)化成功的菌株使用Luria-Bertani 瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過夜, 添加異丙基β-D-硫代半乳糖苷(培養(yǎng)基中終濃度為0.5 mmol/L)并于17 ℃低溫誘導(dǎo)過夜。 離心收集細(xì)胞沉淀并重懸于20 mmol/L 檸檬酸-NaH2PO4(pH 6.5)緩沖液中,通過超聲破碎(400 W,共99 次循環(huán))獲取粗酶液。

    1.3.3.2 蛋白純化 使用親和色譜對(duì)粗酶液進(jìn)行純化 (色譜柱為HisTrapTMHP), 以20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4(含0.3 mol/L 氯化鈉,pH 8.0)為流動(dòng)相進(jìn)行平衡,使用咪唑在0~0.5 mol/L 范圍進(jìn)行線性梯度洗脫, 觀察紫外信號(hào)并收集有酶活的組分。 進(jìn)一步以凝膠排阻色譜柱(HiPrepTM26/10 Desalting) 進(jìn)行脫鹽, 以20 mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4(pH 6.5)為流動(dòng)相進(jìn)行平衡。收集有酶活組分并利用SDS-PAGE 測(cè)定蛋白分子質(zhì)量及純度,純化后的蛋白用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。

    1.3.4 β-紫菜多糖酶酶活測(cè)定 將紫菜多糖底物溶液(溶于20 mmol/L pH 6.5 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液,質(zhì)量濃度為2 mg/mL)與適量稀釋的酶液混合,45 ℃孵育10 min,取出后立即置于100 ℃金屬浴滅活5 min。 反應(yīng)體系中的還原糖增量以pHBH法[19]測(cè)定。 酶活單位(U)定義為1 mL 酶液1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)生1 μmol 還原糖(即D-半乳糖)的活力[20]。 以BCA 法測(cè)定蛋白濃度。

    1.3.5 生化性質(zhì)研究

    1.3.5.1 溫度對(duì)Por16Z_Wa 的影響 酶與底物在4~50 ℃范圍內(nèi)反應(yīng), 測(cè)定酶活力以研究重組蛋白的最適反應(yīng)溫度。將酶液在不同溫度下(4,25,35,45 ℃)放置24 h,探究溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響。

    1.3.5.2 pH 值對(duì)Por16Z_Wa 的影響 酶與底物在不同pH 值緩沖體系 (pH 3.0~6.5: 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液;pH 6.5~9.0:Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液;pH 9.0~11.0:Na2CO3-NaHCO3緩沖液)中反應(yīng),測(cè)定酶活力以研究重組蛋白的最適反應(yīng)pH值。 將酶液置于上述不同的pH 值條件下,在4 ℃下存放1 h 后調(diào)整至最適pH 值,探究pH 值對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響。

    1.3.5.3 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)Por16Z_Wa 的影響 向酶與底物的反應(yīng)體系中添加終濃度為0~0.6 mol/L 的NaCl 和KCl,研究Na+、K+濃度對(duì)重組蛋白活力的影響。 向反應(yīng)體系中添加終濃度1 mmol/L 的金屬離子及化學(xué)試劑, 測(cè)定MgSO4、Ca-Cl2、CuSO4、MnSO4、HgCl2、β-巰基乙醇、SDS、EDTA存在時(shí)酶活力的變化情況。

    1.3.5.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定 根據(jù)米氏方程,在底物質(zhì)量濃度為0.1~1 mg/mL 時(shí)測(cè)定Por16Z_Wa的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km、Vmax、Kcat及Kcat/Km。

    1.3.6 作用方式及降解產(chǎn)物研究 以0.1 U Por16Z_Wa 酶解100 mg 紫菜多糖底物 (以20 mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液溶解至2 mg/mL,pH 6.5),添加緩沖液補(bǔ)足至體系中紫菜多糖底物終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,45 ℃下反應(yīng),并于不同時(shí)間間隔取樣并滅活。 酶解產(chǎn)物利用高效凝膠排阻色譜, 以多角度激光光散射儀與示差檢測(cè)器聯(lián)用(HPSEC-MALLS-RID)測(cè)定分子質(zhì)量。 色譜柱為Shodex OHpak LB-806M; 流動(dòng)相為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4(含0.15 mol/L NaCl,pH 7.4)。

    為探究Por16Z_Wa 的降解終產(chǎn)物, 以7.5 U Por16Z_Wa 與100 mg 紫菜多糖底物(2 mg/mL,超純水溶解)混合,于最適條件下充分反應(yīng),以獲取終產(chǎn)物。 利用超高效凝膠排阻色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(UPSEC-MS)技術(shù)檢測(cè)降解產(chǎn)物中的全部寡糖組分。 凝膠排阻色譜柱:Superdex 30 increase 3.2/300[21];流動(dòng)相:10%乙腈,含50 mmol/L 甲酸銨;流速:0.075 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;質(zhì)譜條件: 氣體流速12 L/min; 霧化壓力241.32 kPa;干燥氣溫度300 ℃;碎裂電壓110 V;掃描分子質(zhì)量100~2 000 u;離子源負(fù)離子模式。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    試驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)平行,利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 16.0 進(jìn)行顯著性分析,以P<0.05 作為差異顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 生物信息學(xué)分析

    Por16Z_Wa 由313 個(gè)氨基酸組成, 其序列中含有一段GH16 家族結(jié)構(gòu)域 (62~307)(如圖1 所示)。

    圖1 Por16Z_Wa 結(jié)構(gòu)域Fig.1 Domain architecture of Por16Z_Wa

    GH16 家族是目前研究最為廣泛的半乳聚糖降解酶家族之一, 該家族酶具有廣泛的底物多樣性[22-23],包括瓊膠、紫菜多糖、地衣多糖、κ-卡拉膠以及海帶淀粉。 將GH16 家族中已報(bào)道的糖苷水解酶與本研究的Por16Z_Wa 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)不同底物的降解酶進(jìn)化關(guān)系較近, 其中Por16Z_Wa 與GH16 家族中β-紫菜多糖酶的進(jìn)化地位相近,預(yù)示該序列具有β-紫菜多糖酶活力。

    圖2 Por16Z_Wa 與GH16 家族糖苷水解酶構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.2 Evolutionary tree constructed by Por16Z_Wa and GH16 family glycoside hydrolases

    GH16 家族β-紫菜多糖酶的關(guān)鍵位點(diǎn)已被報(bào)道。其中,PorB[4]的關(guān)鍵催化位點(diǎn)為E156 和E161,關(guān)鍵識(shí)別位點(diǎn)為W67 和R70。 目前, 已報(bào)道的4條GH16 家族β-紫菜多糖酶在上述位點(diǎn)均保守。多序列比對(duì)結(jié)果表明,Por16Z_Wa 在上述4 個(gè)位點(diǎn)與GH16 家族β-紫菜多糖酶具有一致性 (圖3),進(jìn)一步提示該酶具有潛在的β-紫菜多糖酶活力。同時(shí),對(duì)Por16Z_Wa 以及已報(bào)道的GH16 家族的蛋白序列進(jìn)行Blast 局部比對(duì),發(fā)現(xiàn)序列相似度最高為67.4%,相似度最高的酶為W. fucanilytica產(chǎn)紫菜多糖酶Por16A_Wf[10](覆蓋率為88%)。

    圖3 Por16Z_Wa 的多序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Multiple sequence alignment results of Por16Z_Wa

    2.2 功能驗(yàn)證

    Por16Z_Wa 實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá),超聲破碎后的上清液經(jīng)鎳柱親和純化后,在咪唑濃度為0.2 mol/L 時(shí),洗脫組分顯示出β-紫菜多糖酶活力,酶活為(11.02±0.12)U/mg。 純化后的蛋白在電泳譜圖中呈現(xiàn)單一條帶, 證明其純度較高(圖4)。 利用蛋白分子質(zhì)量Marker 計(jì)算得出重組蛋白的分子質(zhì)量為37.4 ku, 與預(yù)測(cè)分子質(zhì)量(39.6 ku)吻合。 上述結(jié)果證實(shí)Por16Z_Wa 為β-紫菜多糖酶。

    圖4 純化后Por16Z_Wa 的SDS-PAGE 圖譜Fig.4 SDS-PAGE of purified Por16Z_Wa

    2.3 酶學(xué)性質(zhì)

    2.3.1 溫度對(duì)酶活的影響 反應(yīng)溫度對(duì)Por16Z_Wa 酶活的影響如圖5a 所示,該酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。 15 ℃和20 ℃時(shí)的活力分別為最適溫度的63.0%和86.7%, 說明此酶具有適冷性; 相比于已闡明生化性質(zhì)的Por16A_Wf,Por16Z_Wa 可以在低溫下反應(yīng)同時(shí)保持較高的酶解速率, 有利于降低實(shí)際應(yīng)用時(shí)的熱能消耗。Por16Z_Wa 的熱穩(wěn)定性如圖5b 所示,Por16Z_Wa在4 ℃放置24 h 時(shí)酶活基本保持不變。 此外,25℃放置6 h 酶活殘余率為95.2%, 然而該酶在35℃及45 ℃下的酶活穩(wěn)定性較差,這一現(xiàn)象與多數(shù)海洋來源的糖苷水解酶性質(zhì)相似[24-26]。

    圖5 Por16Z_Wa 酶學(xué)性質(zhì)Fig.5 Enzymatic properties of Por16Z_Wa

    2.3.2 pH 值對(duì)酶活的影響 反應(yīng)體系pH 值對(duì)Por16Z_Wa 酶活的影響如圖5c 所示,該酶的最適反應(yīng)pH 值為6.5, 并在pH 5~9 范圍展現(xiàn)出較高活力, 說明該酶具有較廣泛的pH 適用范圍。Por16Z_Wa 的pH 值穩(wěn)定性如圖5d 所示,Por16Z_Wa 在pH 4.0~9.0 條件下酶活保持穩(wěn)定(酶活殘余率大于75%)。

    2.3.3 NaCl、KCl、 金屬離子及化學(xué)試劑 對(duì)Por16Z_Wa酶活的影響 NaCl 和 KCl 對(duì)Por16Z_Wa 酶活的影響如圖5e 所示。 與未經(jīng)處理的反應(yīng)體系相比,0.15 mol/L NaCl 和0.15 mol/L KCl 可分別使Por16Z_Wa 的酶活提高1.2 倍和0.9 倍,Na+和K+顯著提高酶活的現(xiàn)象與Por16A_Wf 以及多種海洋來源的酶相一致[27],此時(shí)底物的物理狀態(tài)可能發(fā)生了改變, 導(dǎo)致相對(duì)酶活的提高[28]。然而在不添加Na+和K+的條件下,Por16Z_Wa 仍然具有酶活, 證明該酶活力的啟動(dòng)不依賴鹽離子。在工業(yè)生產(chǎn)中,酶解產(chǎn)物中不含有鹽離子可以避免后續(xù)繁瑣的脫鹽步驟, 降低生產(chǎn)成本。

    Ca2+、Mg2+、Cu2+、EDTA、β-巰基乙醇及SDS 均對(duì)酶活無顯著影響, 而Mn2+與Hg2+對(duì)酶活具有顯著性抑制作用(圖6)。

    圖6 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)Por16Z_Wa 酶活的影響Fig.6 Effects of metal ions and chemicals on the activity of Por16Z_Wa

    2.3.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù) 控制反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度 為0.1 ~1 mg/mL,于最適反應(yīng)條件下測(cè)定Por16Z_Wa的動(dòng)力學(xué)常數(shù),Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km分別為1.09 mg/mL、105.26 U/mg、69.44 s-1、12.36×103L/(mol·s)。 已報(bào)道的Por16A_Wf,其Km、Kmax、Kcat和Kcat/Km分別為0.54 mg/mL、17.54 U/mg、13.41 s-1、4.25×103L/(mol·s),Por16Z_Wa 的Vmax及Kcat 高于Por16A_Wf,證明該酶的催化效率較高。

    2.4 作用方式和反應(yīng)產(chǎn)物研究

    將0.1 U Por16Z_Wa 與100 mg 底物反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)凝膠色譜柱分離后檢測(cè),MALLS 檢測(cè)器檢測(cè)得到在反應(yīng)10 min 及30 min 后樣品分子質(zhì)量分別由初始的(194.0±2.1)ku 降至(89.9±1.3)ku和(47.6±1.5)ku,這種短時(shí)間內(nèi)分子質(zhì)量急劇下降的現(xiàn)象證明Por16Z_Wa 為內(nèi)切酶。

    圖7 HPSEC-MALLS-RID 分析Por16Z_Wa 的酶解產(chǎn)物Fig.7 HPSEC-MALLS-RID analysis of the hydrolysis products of Por16Z_Wa

    為探究降解終產(chǎn)物, 利用UPSEC-MS 對(duì)7.5 U Por16Z_Wa 酶解100 mg 底物所得的終產(chǎn)物進(jìn)行在線分離及檢測(cè), 終產(chǎn)物組成如圖8 所示。Por16Z_Wa 的降解終產(chǎn)物由1 種二糖、3 種四糖及3 種六糖組成。 碳水化合物是一類非模板合成的生物大分子,其結(jié)構(gòu)存在異質(zhì)性,紫菜多糖也表現(xiàn)出相同性質(zhì)[29]。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,紫菜多糖是瓊脂糖的生物前體物, 因此在紫菜多糖的糖鏈中含有瓊脂糖的二糖單元的取代,約占30%。 其中,瓊脂糖結(jié)構(gòu)由G 殘基及LA 殘基 ((1-4)-O-3,6-內(nèi)醚-α-L-吡喃半乳糖殘基)交替連接構(gòu)成[4]。 此外,多糖鏈的G 殘基的C6 位氧原子容易被甲基化修飾,修飾程度可高達(dá)50%[30]。 Por16Z_Wa 的二糖產(chǎn)物僅有一種,即紫菜二糖(L6S-G),且高聚合度的紫菜四糖(L6S-G)2及紫菜六糖(L6S-G)3均未被檢測(cè)到, 證明Por16Z_Wa 能夠識(shí)別并切割G 與L6S 之間的β-1,4 糖苷鍵, 并將所有的紫菜二糖重復(fù)單元完全水解, 具有高效制備紫菜二糖的潛力。此外,所有的四糖及六糖產(chǎn)物均為L(zhǎng)A-G 取代或者甲基化修飾的結(jié)構(gòu), 而二糖產(chǎn)物中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元LA-G 及L6S-GMe 的生成, 證明Por16Z_Wa 嚴(yán)格識(shí)別G-L6S 之間的糖苷鍵。 因此,Por16Z_Wa 是一種紫菜多糖酶解的新工具,可以用于紫菜寡糖及紫菜二糖的高效、定向制備。

    圖8 Por16Z_Wa 降解產(chǎn)物的提取離子流色譜圖Fig.8 EIC chromatogram of the end products of Por16Z_Wa

    3 結(jié)論

    本研究從海洋細(xì)菌Wenyingzhuangia aestuarii OF219 的基因組克隆并異源表達(dá)了一條新型的GH16 家族β-紫菜多糖酶, 對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并研究了其生化性質(zhì)及作用方式。 45 ℃、pH 6.5 是Por16Z_Wa 的最適反應(yīng)條件, 其在pH 4.0~9.0 及4 ℃的環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性,20℃下仍能保持80%以上的酶活性。 作用方式結(jié)果表明Por16Z_Wa 為內(nèi)切酶。 Por16Z_Wa 的降解終產(chǎn)物主要由紫菜二糖構(gòu)成, 并含有少量的四糖及六糖, 且四糖、 六糖均為被取代或修飾的紫菜寡糖。Por16Z_Wa 作為紫菜多糖的新型工具酶,可以用于低分子質(zhì)量紫菜多糖的制備及紫菜二糖的高效、定向制備,該酶的研究有利于紫菜及紫菜多糖的高值化開發(fā)及利用。

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