甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)非酶糖基化反應(yīng)及其終產(chǎn)物的抑制作用

王 楠， 章涵鈺， 樓 博， 王 偉， 史學(xué)波

（1 浙江樹(shù)人學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院 杭州310015 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究所 杭州310021 3 浙江中得農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司 杭州310021）

非酶糖基化 （Non-enzymatic gluco-sylation，NEG）是一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)，是蛋白質(zhì)-還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的第1 步，形成席夫堿和Amadori 等可逆的產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)氧化、重排、交聯(lián)等過(guò)程， 最終形成不可逆的晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products， AGEs）。 AGEs 不僅在加工食品中廣泛存在， 在人體內(nèi)由于還原糖類(lèi)羰基化合物和蛋白類(lèi)氨基化合物的存在也進(jìn)行非酶糖基化反應(yīng)。 國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)AGEs 對(duì)人體有影響，能導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥視網(wǎng)膜病變（DR）[1]、動(dòng)脈糊樣硬化[2]、組織老化[3]。 AGEs 形成機(jī)制的復(fù)雜性給AGEs 抑制劑的研究帶來(lái)很多困難。 AGEs在形成過(guò)程中經(jīng)歷氧化過(guò)程， 提示抗氧化劑可能對(duì)AGEs 的形成有抑制作用。 目前， 對(duì)食源性AGEs 抑制劑的研究尚處于起步階段。有研究證實(shí)天然酚類(lèi)物質(zhì)具有顯著的抗糖基化能力， 能有效抑制AGEs 的生成，對(duì)許多AGEs 有關(guān)疾病起到一定預(yù)防和治療功效[4]。Ferchichi 等[5]研究證實(shí)：從金絲桃科和葉綠素科分級(jí)分離的多酚對(duì)AGEs 有抑制作用， 對(duì)預(yù)防微血管疾病及其并發(fā)癥有一定潛力。

近年來(lái)， 抗氧化肽成為國(guó)內(nèi)外研究最多的生物活性肽之一。 目前有大豆、玉米、乳清、魚(yú)、貽貝和蝦等多種抗氧化肽[6]。本研究在建立體外非酶糖基化模擬體系的基礎(chǔ)上， 在反應(yīng)體系中添加抗氧化肽，探究抗氧化肽對(duì)AGEs 的影響作用，為為拓展抗氧化肽的新用途提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甲魚(yú)，市售；D-葡萄糖、肌肽，上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、硝基四氮唑藍(lán)（NBT）（100 mg 溶 于0.1 mol/L pH=10.8 的碳酸鹽緩沖液），SIGMA 公司； 注射用青霉素鈉、 硫酸鏈霉素（雙抗），Solarbio 公司；其它試劑均為分析純級(jí)；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-124 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)， 島津有限公司；F-7000 熒光分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司；TENSOR27 型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司；PHS-3C pH 計(jì)， 杭州奧立龍儀器有限公司；Biofuge Prino R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)賀利氏公司；FD-1D-50 型冷凍干燥機(jī)，北京醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；超凈臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甲魚(yú)抗氧化肽的制備 甲魚(yú)抗氧化肽按以下流程制備： 甲魚(yú)宰殺→去脂→脫殼→蛋白酶酶解→滅酶（90 ℃，15 min）→離心過(guò)濾（4 000 r/min，10 min）→保存、備用。

1.3.2 甲魚(yú)抗氧化肽分子質(zhì)量的測(cè)定 參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22492-2008《大豆肽粉》的方法測(cè)定肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布[7]。

1.3.3 DPPH·清除能力的測(cè)定 DPPH·清除率測(cè)定參考Umayaparvathi 等[8]的研究方法，取0.1 mL蛋白酶解液， 加入2.8 mL 1×10-4mol/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min，并在4 000 r/min 下離心10 min， 取上清液在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度，空白組以等體積無(wú)水乙醇溶液代替DPPH·溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液， 并以等體積蒸餾水和無(wú)水乙醇混合液空白調(diào)零。 清除率（I）按下式計(jì)算：

式中，A0——對(duì)照組吸光度；Ai——樣品組吸光度；A——空白組吸光度。

1.3.4 體外蛋白質(zhì)-還原糖糖基化體系建立 參考張麗娜等[9]、李軍等[10]和吳光杰等[11]的研究方法建立蛋白質(zhì)-還原糖體系。 無(wú)菌條件下，在稀釋后的PBS 溶液中加入BSA、D-葡萄糖、EDTA、 青霉素鈉、 硫酸鏈霉素， 使各組分終含量為EDTA 8 μmol/L、雙抗100 U/mL、BSA 20 mg/mL、D-葡萄糖80 μmol/L。 在上述配置好的溶液中加入甲魚(yú)抗氧化肽，配置成質(zhì)量濃度為0.25，0.50，0.75，1.00 mg/mL 的溶液。 同時(shí)以肌肽作為陽(yáng)性對(duì)照。 保鮮膜覆蓋，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中避光溫孵，溫孵時(shí)間分別為3，7，14，21，28 d。 分別設(shè)不加樣品組a；不加D-葡萄糖、不加樣品組b；不加BSA、不加樣品組c； 不加BSA 組d； 不加D-葡萄糖組e，5 組對(duì)照組。 試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行。

分別取NEG 反應(yīng)體系反應(yīng)的第3，7，14，21，28 天時(shí)各組的反應(yīng)液0.1 mL，加入4 mL NBT，37℃溫孵15 min 后， 立即加入15%乙酸0.1 mL，并于冰水浴中終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)530 nm 處測(cè)定其吸光值A(chǔ)， 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)NEG 反應(yīng)的抑制率（IRNEG）按式（2）計(jì)算：

分別取AGEs 生成反應(yīng)體系反應(yīng)的第3，7，14，21，28 天時(shí)各組的反應(yīng)液1 mL，檢測(cè)其熒光值F，檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)440 nm、狹縫5 mm。 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)AGEs 生成的抑制率（IRAGEs）按式（3）計(jì)算：

1.3.5 紅外光譜分析 樣品冷凍干燥后將樣品與干燥的KBr（質(zhì)量比1∶100）混合置于瑪瑙研缽中，研磨均勻后的粉末壓制成片，光譜范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32 次。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。 單因素方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶制備甲魚(yú)抗氧化肽的DPPH·清除率

由表1 可知，4 種蛋白酶分別以最佳的酶解條件酶解甲魚(yú)蛋白4 h 時(shí)， 中性蛋白酶酶解后的酶解液DPPH·清除率最高，達(dá)（76.45±3.16）%，明顯優(yōu)于其它3 種酶， 故選用中性蛋白酶酶解甲魚(yú)蛋白制備甲魚(yú)抗氧化肽。

表1 不同蛋白酶制備甲魚(yú)抗氧化肽的DPPH·清除率Table 1 DPPH·clearance of turtle antioxidant peptides prepared by different proteases

2.2 甲魚(yú)抗氧化肽分子質(zhì)量分布

由圖1 可知， 甲魚(yú)抗氧化肽的相對(duì)分子質(zhì)量在1 000 u 以上的占總組分的30.32%； 相對(duì)分子質(zhì)量在1 000～200 u 范圍占總組分的63.23%；相對(duì)分子質(zhì)量在200～128 u 范圍占總組分的4.24%；相對(duì)分子質(zhì)量在128 u 以下的占總組分的2.21%，甲魚(yú)抗氧化肽分子質(zhì)量主要分布在1 000～200 u。Zhong 等[12]報(bào)道分子質(zhì)量＜1 ku 的鰱魚(yú)加工副產(chǎn)品蛋白質(zhì)肽SCPH-V 具有較高的DPPH·清除率。 張東杰等[13]的研究表明，分子質(zhì)量在156～1 439 u 范圍的小分子肽具有較高的抗氧化活性。 李桂峰等[14]的研究表明，用木瓜蛋白酶水解雙孢菇蛋白質(zhì)制得的600～2 600 u 之間的肽具有很好的·OH清除率以及較好的O2-·清除率。 Mendis 等[15]和莊永亮等[16]認(rèn)為肽類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量低于3 000 u 時(shí)具有良好的抗氧化性。 Alemán 等[17]的研究表明分子質(zhì)量在500～1 400 u 范圍的魷魚(yú)膠原蛋白酶解物具有較好的抗氧化活性。 本試驗(yàn)研究結(jié)果與以上文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致， 即具有較高抗氧化活性的肽的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小。

圖1 甲魚(yú)抗氧化肽高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of turtle antioxidant peptides

2.3 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)蛋白質(zhì)-還原糖糖基化體系的影響

2.3.1 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)NEG 反應(yīng)的影響 如圖2所示，在糖基化的開(kāi)始階段，隨著甲魚(yú)抗氧化肽和肌肽質(zhì)量濃度的增加，NEG 的抑制率也增加，并呈正相關(guān)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相同質(zhì)量濃度的肌肽和甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)NEG 反應(yīng)的抑制率呈先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明當(dāng)反應(yīng)到28 d 時(shí)底物可能已基本消耗完。當(dāng)肌肽質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL、溫孵7 d 時(shí)，對(duì)NEG 反應(yīng)的抑制率達(dá)76.17%，然而從第7 天開(kāi)始， 肌肽對(duì)糖基化反應(yīng)體系產(chǎn)生的NEG 反應(yīng)的抑制率明顯降低，波動(dòng)較大。

圖2 甲魚(yú)抗氧化肽和肌肽對(duì)NEG 反應(yīng)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of turtle antioxidant peptides and carnosines on NEG

各質(zhì)量濃度的甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)糖基化反應(yīng)的各個(gè)階段的NEG 反應(yīng)抑制率都維持在較高水平，波動(dòng)較小。甲魚(yú)抗氧化肽質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL、溫孵時(shí)間為21 d 時(shí)， 對(duì)NEG 反應(yīng)的抑制率達(dá)到68.79%。

2.3.2 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)蛋白質(zhì)-還原糖糖基化終產(chǎn)物AGEs 的影響 如圖3 所示， 隨著甲魚(yú)抗氧化肽和陽(yáng)性對(duì)照肌肽質(zhì)量濃度的增加， 二者對(duì)蛋白質(zhì)-還原糖糖基化終產(chǎn)物AGEs 生成的抑制率逐漸增加。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相同質(zhì)量濃度的甲魚(yú)抗氧化肽和肌肽對(duì)AGEs 的抑制率逐漸增加，說(shuō)明甲魚(yú)抗氧化肽和肌肽對(duì)蛋白質(zhì)-還原糖糖基化終產(chǎn)物AGEs 的抑制率均具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，且均呈正相關(guān)。

圖3 甲魚(yú)抗氧化肽和肌肽對(duì)AGEs 生成的抑制率Fig.3 Turtle antioxidative peptides and carnosine inhibit the production of AGEs

在相同質(zhì)量濃度條件下， 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)AGEs 的抑制作用強(qiáng)于肌肽。 當(dāng)溫孵28 d 時(shí)，1.00 mg/mL 的甲魚(yú)抗氧化肽， 對(duì)AGEs 的抑制率達(dá)89.35%。

2.3.3 抗氧化肽對(duì)蛋白質(zhì)-還原糖體系的影響為進(jìn)一步探究甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)AGEs 抑制的作用機(jī)理，采用紅外光譜分析甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)蛋白質(zhì)-還原糖體系的影響。

如圖4 所示，535 cm-1左右的不飽和鍵的震動(dòng)峰發(fā)生了藍(lán)移， 說(shuō)明反應(yīng)體系生成了新的不飽和鍵，即產(chǎn)生了美拉德反應(yīng)初期產(chǎn)物——Amadori 產(chǎn)物。 1 000 cm-1處的峰是由糖的O-H 和C-C 鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[18]，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化作用越發(fā)明顯。 3 500～3 100 cm-1范圍的吸收峰強(qiáng)度的改變，是由O-H 伸縮振動(dòng)和游離N-H 的伸縮振動(dòng)所引起的，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，峰的寬度明顯增強(qiáng)， 可能與糖基化反應(yīng)過(guò)程中席夫堿的形成有關(guān)。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，峰值也有相應(yīng)減弱，說(shuō)明美拉德反應(yīng)進(jìn)入中后期。

紅外光譜中酰胺Ⅰ區(qū)、 酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)可以用于分析蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)， 酰胺Ⅰ區(qū)與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。1 650 cm-1左右是酰胺Ⅰ區(qū)的特征吸收峰， 主要是由α-螺旋中肽鏈的C=O 伸縮振動(dòng)所引起；1 550 cm-1左右是酰胺Ⅱ區(qū)，1 400～1 200 cm-1范圍是酰胺Ⅲ區(qū)， 由C-N 的伸縮振動(dòng)和N-H 的彎曲振動(dòng)產(chǎn)生[14]。 圖4 可以看出，隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的增強(qiáng)，酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)的峰有先變大再變小再變大的趨勢(shì)，表明周?chē)幕鶊F(tuán)聚合數(shù)量的改變。 蛋白質(zhì)-還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的反應(yīng)初期， 氨基與羥基發(fā)生脫水縮合、分子重排生成果糖胺，導(dǎo)致酰胺吸收峰增強(qiáng)；反應(yīng)中期，糖胺烯醇化生成醛酮類(lèi)物質(zhì)，酰胺吸收峰值減小；反應(yīng)后期，蛋白質(zhì)氨基酸與羰基化合物發(fā)生脫羧、脫氨，酰胺吸收帶峰值增強(qiáng)。

圖4 空白組糖基化反應(yīng)體系反應(yīng)不同時(shí)間的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectral diagram of glycosylation reaction system of blank group at different reaction times

圖5 為0.50 mg/mL 肌肽處理組不同反應(yīng)時(shí)間的糖基化產(chǎn)物紅外光譜圖，與空白對(duì)照組相比，相同溫孵時(shí)間的肌肽處理組1 000 cm-1處的峰有所減弱。 圖6 為0.50 mg/mL 甲魚(yú)抗氧化肽處理組不同反應(yīng)時(shí)間的糖基化產(chǎn)物紅外光譜圖， 與對(duì)空白照組和肌肽組相比， 相同溫孵時(shí)間的甲魚(yú)抗氧化肽處理組1 000 cm-1處的峰明顯減弱。圖6 中甲魚(yú)抗氧化肽處理28 d 的糖基化產(chǎn)物紅外光譜圖中，紅外光譜中酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)的振動(dòng)產(chǎn)生明顯降低，進(jìn)一步證明，甲魚(yú)抗氧化肽通過(guò)降低糖基化反應(yīng)程度，來(lái)抑制非酶糖基化反應(yīng)。

圖5 反應(yīng)不同時(shí)間肌肽處理組糖基化產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of glycosylation products in the group treated with carnosine at different reaction times

圖6 反應(yīng)不同時(shí)間甲魚(yú)抗氧化肽處理組糖基化產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of the glycosylation products in the turtle antioxidant peptide treatment group at different reaction times

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)蛋白質(zhì)-還原糖體系NEG 和AGEs 產(chǎn)生的抑制作用。 研究結(jié)果表明，隨著甲魚(yú)抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，對(duì)非酶糖基化反應(yīng)各個(gè)階段的抑制作用均呈正相關(guān)。 蛋白質(zhì)-還原糖體系反應(yīng)21 d 時(shí)，1.00 mg/mL 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)NEG 的抑制率達(dá)68.79%。 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)AGEs 的抑制作用， 與甲魚(yú)抗氧化肽的質(zhì)量濃度和體系反應(yīng)時(shí)間均呈正相關(guān)。 甲魚(yú)抗氧化肽對(duì)AGEs 的抑制作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照肌肽。 當(dāng)甲魚(yú)抗氧化肽質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL 時(shí)， 對(duì)AGEs的抑制率達(dá)89.35%。 紅外光譜結(jié)果表明，甲魚(yú)抗氧化肽通過(guò)降低糖基化反應(yīng)程度來(lái)抑制非酶糖基化反應(yīng)。 本研究為降低AGEs 的形成提供了理論依據(jù)和新思路， 研究結(jié)果為拓展甲魚(yú)抗氧化肽在食品加工領(lǐng)域的新用途提供了數(shù)據(jù)支持， 為控制AGEs 產(chǎn)生， 提高食品的安全品質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。